李曉艷 裴嘉博 張志東 吳 林 劉海廣 李亞?wèn)|

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118)

李海燕

(教育部生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)工程研究中心(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)))

花色素苷和類黃酮化合物廣泛存在于高等植物中，是植物花和果實(shí)等幾乎所有色澤形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，并起到保護(hù)植物免受紫外線和病原體損傷的功能［1］。查耳酮合酶(CHS，EC2.3.1.74)是類黃酮生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，它催化1分子4－香豆酰CoA與3分子丙二酰CoA縮合形成含15個(gè)碳原子的查耳酮，為類黃酮提供了基本的碳骨架，是一個(gè)重要的中間產(chǎn)物。自1983年克隆第一個(gè)查耳酮合酶基因(CHS)［2］以來(lái)，CHS就成為科學(xué)家感興趣的一個(gè)模式基因，用于研究基因表達(dá)和基因家族的進(jìn)化，并且已經(jīng)在許多植物中相繼分離克隆出來(lái)［3－9］。由于查耳酮合酶在花色素苷合成途徑中的重要作用，科學(xué)家利用正抑制和反抑制等方法抑制CHS基因的表達(dá)，從而減少花色素苷的合成和累積，達(dá)到改變植物花的顏色，培育新品種的目的［10］。

越橘(Vaccinium spp.)俗稱藍(lán)莓，由于果實(shí)富含花色素苷等對(duì)人體健康有益的抗氧化物質(zhì)而備受關(guān)注?；ㄉ剀盏纳锖铣赏緩绞窃介俟麑?shí)成熟過(guò)程中最主要的次生代謝途徑之一，通過(guò)分離和鑒定越橘花色素苷合成途徑的關(guān)鍵酶及相關(guān)基因，是深入了解和調(diào)控越橘果實(shí)花色素苷合成的重要方法。但是目前越橘基因組數(shù)據(jù)的缺乏給越橘花色素苷等次生代謝途徑的研究帶來(lái)了困難，用新一代測(cè)序技術(shù)(Illumina/Solexa sequencing)對(duì)越橘果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，并以測(cè)序文庫(kù)中高表達(dá)的Unigene23486片段為基礎(chǔ)，利用RT－PCR和RACE技術(shù)對(duì)越橘CHS基因的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行克隆，分析該基因的表達(dá)與其酶活性和花色素苷累積的關(guān)系，從功能基因組水平上研究越橘花色素苷合成途徑中重要基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究越橘花色素苷形成的分子機(jī)制和培育越橘新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

以越橘品種‘北陸’(V.corymbosum L.)為試材，試驗(yàn)材料來(lái)源于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小漿果試驗(yàn)基地。材料分別于花期(2010年5月25日)、綠果期(花后25 d)、粉果期(花后45 d)、藍(lán)果期(花后50 d)采集。取藍(lán)果期(成熟期)的果實(shí)，將果肉和果皮迅速分離，各組織液氮速凍處理后，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

越橘VcCHS基因cDNA全長(zhǎng)序列的獲得:果皮RNA提取采用北京奧萊博生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒。根據(jù)Illumina測(cè)序(數(shù)據(jù)已上傳至NCBI Short Read Archive數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào):SRA046311)產(chǎn)生的在果皮文庫(kù)中高表達(dá)的序列Unigene23486(440 bp)設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物CHSF和 CHS－R(表 1)，以 DNaseⅠ酶(RNase free)消化處理后的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。切膠回收與預(yù)期片段大小一致的泳帶，連接克隆載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選及質(zhì)粒酶切鑒定陽(yáng)性克隆后測(cè)序。根據(jù)所得的cDNA片段的中間序列，分別設(shè)計(jì)特異引物 VcCHS 3'GSP和 VcCHS 5'GSP(表 1)，按照RACE試劑盒SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說(shuō)明書進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增。凝膠回收、產(chǎn)物克隆及序列測(cè)定如上所述。為獲得越橘VcCHS基因全長(zhǎng)，根據(jù)由中間序列和末端序列拼接而得到的cDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物VcCHS F和VcCHS R(表1)，以 DNaseⅠ酶(RNase free)消化處理后的越橘果皮總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測(cè)序結(jié)果在 GenBank中進(jìn)行 Blast分析。利用在線軟件ProtParam預(yù)測(cè)所編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及保守結(jié)構(gòu)域等。采用DNAMAN和MEGA軟件進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析。

相對(duì)熒光定量PCR表達(dá)分析:用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的適合多糖多酚植物RNA提取試劑盒分別對(duì)‘北陸’的花、綠果、粉果、藍(lán)果、果肉和果皮的總RNA進(jìn)行提取，用DNaseⅠ酶(RNase free)消化基因組DNA后，各取1 μg為模板，用MMuLV First cDNA Synthesis Kit(Promega)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈備用。根據(jù)VcCHS cDNA全長(zhǎng)序列，按照熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則在VcCHS的3'非翻譯區(qū)附近設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物P1和P2(表1)，獲得的擴(kuò)增片段為92 bp。以 GAPDH(GenBank AY123769)為內(nèi)參，設(shè)計(jì)其特異引物GAPDH－F和GAPDH－R(表1)，獲得的擴(kuò)增片段為116 bp，對(duì)照樣品是以綠果提取的RNA為模板，根據(jù)GAPDH設(shè)計(jì)引物C1和C2。對(duì)反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA分別進(jìn)行5倍梯度稀釋(1、1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000)，實(shí)施熒光定量反應(yīng)，然后繪制相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系20 μL:cDNA模板 1 μL，2 × SYBR PremixEx TaqTM10 μL，上下游特異引物(10 μmol·L－1)各 0.4 μL，水 8.2 μL。擴(kuò)增采用兩步法標(biāo)準(zhǔn)程序:95℃預(yù)變性2 min;95℃變性15 s，60 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)第3步進(jìn)行熒光采集;最后95℃變性1 min，退火至55℃，保溫1 min后以0.2℃·s－1的速度逐漸升溫至95℃ ，在此過(guò)程中連續(xù)檢測(cè)其熒光值，繪制熔點(diǎn)曲線。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

表1 越橘VcCHS基因克隆及表達(dá)分析所用引物

花色素苷相對(duì)含量測(cè)定:花色素苷相對(duì)含量測(cè)定參照 Pirie［11］及王惠聰?shù)龋?2］的方法并加以優(yōu)化，將材料切碎充分混合，取1.0 g鮮樣放入20 mL 1%HCl甲醇溶液室溫浸提2 h。取2 mL浸提液，用1%HCl/甲醇溶液稀釋6倍，以1%HCl/甲醇溶液作為空白，用分光光度計(jì)測(cè)定提取液在553、600 nm處的吸光值，兩者之差即為花色素苷的相對(duì)含量。差值每增加0.01定義為1個(gè)單位。設(shè)3次取樣重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 越橘VcCHS基因cDNA全長(zhǎng)的獲得及序列分析

以果皮RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，CHS－F和CHS－R為引物，擴(kuò)增出一條440 bp的單一特異性條帶(圖1，A)，陰性對(duì)照未加模板?；厥占兓a(chǎn)物后經(jīng)測(cè)序與預(yù)期結(jié)果一致。以VcCHS3'GSP和VcCHS5'GSP為引物，經(jīng)RACE－PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物克隆、測(cè)序后，分別得到長(zhǎng)度為1 169 bp的3'端和474 bp的5'末端(圖1B)。根據(jù)3'RACE和5'RACE測(cè)序結(jié)果拼讀出越橘查耳酮合酶基因，并將其與全長(zhǎng)引物VcCHS F和VcCHS R擴(kuò)增所得的序列(圖1C)進(jìn)行比較，最終獲得一條長(zhǎng)為1 438 bp的cDNA全長(zhǎng)序列，命名該基因?yàn)閂cCHS(GenBank登錄號(hào)為JN654702)。利用NCBI提供的ORF Finder進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，VcCHS包含一個(gè)長(zhǎng)度為1 260 bp的開放讀碼框(open reading frame，ORF)和一個(gè) poly(A)尾巴，5'非翻譯區(qū)長(zhǎng) 107 bp，3'非翻譯區(qū)長(zhǎng) 71 bp(圖2)。其ORF編碼一個(gè)含419個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，包括起始密碼子和終止密碼子。利用在線軟件Prot-Param預(yù)測(cè)所編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為45.7 kD，理論等電點(diǎn)(pI)為8.21。

圖1 越橘VcCHS基因的PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 VcCHS基因編碼產(chǎn)物的功能分析與同源性比較

為進(jìn)一步分析越橘CHS與其他物種CHS的同源性，利用DNAMAN5.2.2軟件對(duì)包括越橘在內(nèi)的15個(gè)物種的CHS的氨基酸序列進(jìn)行了多重比對(duì)。結(jié)果如圖3，越橘VcCHS基因編碼的氨基酸序列與其他已知植物的氨基酸序列有很高的同源性，平均達(dá)到86.76%;與葡萄(AEP17004)相似性高達(dá)90.2%;與同是杜鵑花目的植物山茶(BAA05641)、杜鵑花(CAC88858)相似性較高，分別達(dá)到86.4%和84.8%;而與番茄(AEK99072)相似性相對(duì)較低，為81.0%。利用NCBI Conserved Domain Search進(jìn)行保守域分析表明，越橘CHS的ORF十分保守，編碼的蛋白具有的兩個(gè)保守域，即cd00831(CHS_like，Chalcone and stilbene synthases，type IIIplantspecificpolyketide synthases，Ⅲ型聚酮合成酶)和PLN03173(chalcone synthase;Provisional)。進(jìn)一步的功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，越橘CHS含有多個(gè)查耳酮合酶起功能作用所必需的活性位點(diǎn)，這些活性位點(diǎn)使底物能夠和查耳酮合酶結(jié)合發(fā)生催化反應(yīng)，其位點(diǎn)是:Cys(C)164、His(H)303和 Asn(N)336;CoA 結(jié)合位點(diǎn):Lys(K)55、Arg(R)58、Met(M)59、Phe(F)265、Gly(G)306、Pro(P)307和 Ala(A)308。這些位點(diǎn)幾乎在所有CHS中都高度保守，且各位點(diǎn)的相對(duì)位置保持不變(圖3)。另外，利用 prosite軟件對(duì)越橘CHS序列的功能位點(diǎn)分析表明，VcCHS基因編碼的氨基酸序列還具有查耳酮合酶基因家族的特征多肽序列:RLMMYQQGCFAGGTVLR(圖3)。

在多重比對(duì)的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步分析越橘CHS與其他植物CHS之間的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 4.0軟件，對(duì)越橘和上述14種已知植物CHS結(jié)構(gòu)域蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果(圖4)表明，越橘CHS的進(jìn)化基本符合植物分類學(xué)分類，并具有明顯的種屬特性，除了紫花苜蓿(AAA02827)外，同屬于薔薇科的幾個(gè)物種聚為一類，茄科植物聚為一類。越橘VcCHS(JN654702)基因編碼的氨基酸序列越橘CHS與同是杜鵑花目的山茶(BAA05641)和杜鵑花(CAC88858)聚為一類。

2.3 VcCHS基因的組織特異性表達(dá)

采用熒光定量PCR的方法對(duì)VcCHS基因在越橘不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，以綠果作為對(duì)照，表達(dá)量定為“1”，按照⊿⊿Ct作圖，⊿⊿ Ct=()處理組－()未處理組，Ct值:表示擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò) 的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

圖2 越橘VcCHS基因cDNA全長(zhǎng)及推導(dǎo)的氨基酸序列

結(jié)果(圖5)表明，從越橘開花到果實(shí)成熟的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都能檢測(cè)到VcCHS的表達(dá)。在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期，VcCHS的相對(duì)表達(dá)量和花色素苷相對(duì)含量在藍(lán)果期顯著高于其他時(shí)期(p＜0.05)，二者均是在果皮組織中達(dá)到最大值。VcCHS相對(duì)表達(dá)量與花色素苷相對(duì)含量之間具有正對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

本研究以Illumina測(cè)序產(chǎn)生的片段為基礎(chǔ)，通過(guò)RT－PCR和RACE方法從越橘果皮中成功分離出CHS的同源基因VcCHS，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有CHS家族保守存在的活性位點(diǎn)和特征多肽序列，進(jìn)行基因序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，CHS基因編碼區(qū)保守性很強(qiáng)，不同科植物間氨基酸水平上的同源性達(dá)86.76%。這與之前的研究結(jié)果相一致，即認(rèn)為CHS編碼區(qū)有很高的保守性，不同科植物間，在DNA水平上的同源性大于60%，在氨基酸水平上的同源性達(dá)80%［13］。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明越橘CHS的進(jìn)化具有明顯的種屬特性，與同是杜鵑花目的植物山茶和杜鵑花親緣關(guān)系最近，與茄科植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)VcCHS基因在越橘不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，在整個(gè)果實(shí)發(fā)育的過(guò)程中都能檢測(cè)到VcCHS基因的表達(dá)，花期和果實(shí)成熟期表達(dá)量較高，這與 Jaakola et al.［14］用 Northern－blotting方法檢測(cè)CHS基因在歐洲越橘(Vaccinium myrtillus L.)果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的檢測(cè)結(jié)果一致。

圖3 越橘VcCHS基因主要ORF推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種CHS多重比對(duì)分析

CHS是花色素苷代謝途徑中的第一個(gè)限速酶，在類黃酮的代謝途徑上查耳酮分子的異構(gòu)化和功能基團(tuán)的進(jìn)一步取代都能導(dǎo)致黃酮、異黃酮和花色素苷的合成，從而使花色、葉色和果實(shí)色澤發(fā)生變化［15］。越橘VcCHS基因的表達(dá)量與花色素苷的蓄積量都是在果皮組織中達(dá)到最高，這與荔枝［16］的研究結(jié)果相似，說(shuō)明CHS基因相對(duì)表達(dá)量變化與花色素苷相對(duì)含量的變化趨勢(shì)具有一致性，并具有一定的組織特異性。從而推測(cè)CHS可能是越橘花色素苷合成途徑的主要限速酶之一，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)越橘果實(shí)花色素苷的形成起調(diào)控作用。

圖4 越橘VcCHS與其他物種CHS氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖5 越橘果實(shí)發(fā)育的不同階段和VcCHS的組織特異性表達(dá)

不同植物的CHS基因序列同源性很高，但功能上存在明顯差異，CHS幾乎在所有植物中都是以多基因家族存在，研究表明被子植物中至少有兩個(gè)基因，在茄科和豆科植物中甚至檢測(cè)到8個(gè)以上的CHS基因［17－18］。如在矮牽牛中檢測(cè)到的8個(gè)CHS，多數(shù)在花組織中表達(dá)，主要與花色素苷的累積有關(guān)［19］;在苜蓿中，CHS 主要在花和葉中表達(dá)［20］;在山茶的莖和葉中檢測(cè)到CHS，并發(fā)現(xiàn)其參與兒茶素的合成［21］。通過(guò)Illlumia測(cè)序技術(shù)對(duì)越橘果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)過(guò)短序列拼接組裝、比對(duì)和功能注釋，研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)序列比對(duì)到CHS，所以肯定越橘的CHS也是多基因家族，接下來(lái)將通過(guò)基因工程的手段構(gòu)建植物正義和反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草和番茄，對(duì)越橘VcCHS基因的功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究和探討。

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