張寧，擺翔，蔣犁，李偉

(1．東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江蘇南京 210009;2．江蘇省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，江蘇泰州 225300)

隨著產(chǎn)科和新生兒重癥監(jiān)護(hù)診療技術(shù)的發(fā)展，更多早產(chǎn)的極低出生體重兒和超低出生體重兒獲得了存活。我國(guó)城市早產(chǎn)兒發(fā)生率為7.8%［1］，每年以1%的比例遞增，但隨之而來(lái)的早產(chǎn)兒腦損傷也較為突出。早產(chǎn)兒在圍生期發(fā)生的腦損傷主要包括胚胎生發(fā)層基質(zhì)-腦室內(nèi)出血、出血后腦室積水與腦室周圍白質(zhì)軟化(periventricular leucumalacia leukomalacia，PVL)，其中PVL被認(rèn)為是早產(chǎn)兒腦損傷的主要形式，常導(dǎo)致腦癱等后遺癥。腦白質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量最多的是少突膠質(zhì)細(xì)胞，早產(chǎn)兒胎齡越小，其腦白質(zhì)中少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞含量越多。未成熟的晚期少突膠質(zhì)(oligodendrocyte，OL)前體細(xì)胞對(duì)缺氧缺血敏感，是PVL病變的主要靶細(xì)胞，其缺氧缺血損傷后可凋亡［2］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧損傷性疾?。?-4］，許多國(guó)家和地區(qū)已相繼建立干細(xì)胞庫(kù)，MSCs已用于臨床一期和二期［5-6］。從各方面成果上看，間充質(zhì)干細(xì)胞用于成人和足月兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病均取得一定療效，應(yīng)用于未成熟腦組織亦能取得療效。

本研究建立新生大鼠PVL模型，將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUcMSCs)通過(guò)腹腔注射移植到模型動(dòng)物體內(nèi)，觀察HUcMSCs經(jīng)腹腔移植后在宿主腦PVL病變部位的遷移以及對(duì)腦室周圍軟化灶少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，以及初步探討HUcMSCs保護(hù)受損腦組織和促進(jìn)神經(jīng)重建的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1． 1 主要試劑及器材

DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))、胎牛血清(杭州四季青公司)、BRDU(Sigma公司，美國(guó))、小鼠抗人BrdU抗體(Sigma公司，美國(guó))。兔抗鼠MBP抗體(Abcam公司，美國(guó))。7.0 T微型磁共振(MicroMRI，美國(guó))。

1． 2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備及其分組

40只清潔級(jí)大鼠隨機(jī)分為移植組和無(wú)菌PBS注射組(對(duì)照組)，各組根據(jù)處死時(shí)間分為24 h(P6d)、14 d(P19d)兩個(gè)亞組。大鼠由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，參照文獻(xiàn)［7］法制作模型:分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，清醒后放入自制缺氧箱中，通入含94%氮?dú)夂?%氧氣的氣體(1.5 L·h－1)4 h，造模完成后第5天，P5d即給予移植組 BrdU標(biāo)記HUcMSCs，每只 1 ×107(0.05 ml)－1，對(duì)照組僅給予0.05 ml無(wú)菌PBS液，兩組均由腹腔注射。

1． 3 HUcMSCs的來(lái)源、培養(yǎng)以及標(biāo)記

HUcMSCs由江蘇省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心提供，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液消化、傳代后取第2代用于移植。進(jìn)行細(xì)胞移植前用含BrdU(3 mg·L－1)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后用于移植。

1． 4 免疫組織化學(xué)染色以及組織病理觀察

于P6d、19d斷頭取腦，4%多聚甲醛固定24 h，取視交叉水平腦組織分別作石蠟切片(4 μm)行BrdU、MBP免疫組織化學(xué)染色。

1． 5 微型MRI(MicroMRI)掃描和神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試

移植HUcMSCs組和對(duì)照組在P19d分別行MicroMRI掃描和神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試。

1．5.1 7.0 T微型MRI掃描 移植組大鼠于P19d行T1W1、T2W2微型磁共振掃描。

1．5.2 懸吊實(shí)驗(yàn) 方法:使P19d大鼠前腿抓住一水平玻璃棒(直徑0.5 cm)，離開(kāi)桌面45 cm，記錄大鼠掉下的時(shí)間并進(jìn)行評(píng)分，兩組比較。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):1分，＜10 s;2分，10～30 s;3分，31～119 s;4分，2～5 min;5分，＞5 min。

1．5.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 裝置為36 cm×36 cm×36 cm無(wú)頂方盒，箱底用墨線等分成9個(gè)小方格，將大鼠置于中央小方格內(nèi)，觀察30 s內(nèi)活動(dòng)情況。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):大鼠1/2以上身體從所在方格進(jìn)入相臨方格計(jì)1分，大鼠后肢站立計(jì)1分，兩者相加為其總分。

1．5.4 拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 用動(dòng)物從來(lái)沒(méi)有接觸過(guò)的手套輕撓大鼠，觀察其反應(yīng)。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):0分:很容易抓取動(dòng)物;1分，尖叫或回避;2分，尖叫并回避;3分，逃脫;4分，逃脫并尖叫;5分，咬或試圖撕咬手套;6分，主動(dòng)躍起攻擊。

1． 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2． 1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

倒置顯微鏡下放大100倍觀察經(jīng)傳代后第2代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，呈梭形、螺旋編織狀(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡顯示傳代后第2代HUcMSCs呈梭形、螺旋編織狀(×100)Fig 1 The morphology of the human mesenchymal stem cells(×100)

2． 2 病理學(xué)變化

2．2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植后在宿主腦內(nèi)遷移及分布 經(jīng)腹腔移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞24 h后，移植組可見(jiàn)BrdU(+)陽(yáng)性示蹤人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(圖2A);對(duì)照組(PBS溶液注射組)未見(jiàn)BrdU(+)示蹤人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(圖2B)。

2．2.2 移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞腦內(nèi)病理變化 移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后第14天(P19d)，HUcMSCs移植組腦室旁白質(zhì)致密，空泡體積小且數(shù)量少(圖3A);PBS溶液注射組腦室旁白質(zhì)疏松，空泡體積大且數(shù)量較多(圖3B)。

2．2.3 移植HUcMSCs促進(jìn)腦損傷區(qū)域膠質(zhì)細(xì)胞的存活 移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后第14天(P19d)，移植HUcMSCs組髓磷脂堿性蛋白(MBP)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(圖4A)明顯多于載體溶液對(duì)照組(圖4B)。每個(gè)視野HUeMSCs組MBP標(biāo)記陽(yáng)性數(shù)為(13．95±1．57)個(gè)，大于PBS組的(10．22±1．02)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。

2． 3 MicroMRI掃描

移植組于造模后第1天(P6d)MicroMRI掃描在T2W2上可見(jiàn)明顯高信號(hào)(圖5A)，移植后第14天(P19d)在T2W2上未見(jiàn)異常信號(hào)(圖5B)。對(duì)照組于造模后第1天(P6d)MicroMRI掃描，在T2W2上可見(jiàn)明顯高信號(hào)(圖5C)，第14天(P19d)在T1W1可見(jiàn)低信號(hào)，腦白質(zhì)軟化灶形成(圖5D)。

2． 4 行為學(xué)測(cè)定

大鼠生后第19天時(shí)(P19d)模型組大鼠懸吊試驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)、拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分均較對(duì)照組低(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

圖2 BrdU免疫組化染色(×200)A．Transplantation group BrdU(+)cells(black arrow);B．The control group showed no BrdU(+)cellsFig 2 BrdU immunohistochemical staining(×200)

圖3 BrdU免疫組化染色(×400)A．HUcMSCs transplantation group of periventricular white matter is more compact，the volume and the number of bubbles is less;B．PBS solution injection group’s periventricular white matter is loose，the number of the bubble is more，the volume is lagrerFig 3 BrdU immunohistochemical staining(×400)

圖4 MBP免疫組化染色(×200)A．The number of the MBP positive staining cells is more;B．The number of the MBP positive staining cells is lessFig 4 MBP immunohistochemical staining(×200)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)擬以早產(chǎn)兒常見(jiàn)病PVL早期應(yīng)用HUcMSCs干預(yù)后腦局部有良好的神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)和功能改善為切入點(diǎn)，觀察到給新生PVL大鼠經(jīng)腹腔移植BrdU標(biāo)記HUcMSCs后，在腦部的定向遷移以及對(duì)新生未成熟鼠缺血缺氧性腦部病灶的神經(jīng)保護(hù)作用。

圖5 MicroMRI掃描HUcMSCs group:A．T2W2 scanning shouw hign signal at p6d;B．T2W2 scanning shouw no abnomal singnal at p19d;C．T2W2 scanning shows high signal at P6d;D．The T1W1 scanning shows low signal(Focal periventricular leukomalacia)Fig 5 MicroMRI scanning

表1 P19D兩組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較(n=10，ˉx±s)分Tab 1 Copmparative study on behaviors of rats(n=10) point

表1 P19D兩組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較(n=10，ˉx±s)分Tab 1 Copmparative study on behaviors of rats(n=10) point

組3．40 ±0．966 3．00 ±0．816 1．60 ±0．516 HUeMSCs 1．80 ±0．789 1．30 ±1．059 0．60 ±0．516 t值別 懸吊試驗(yàn) 拒俘反應(yīng) 曠場(chǎng)試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M4．057 4．019 4．330 P值 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

MSCs來(lái)源廣泛，可取自骨髓、臍帶、脂肪等組織。HUcMSCs來(lái)源于胚胎組織廢棄物-臍帶，取材無(wú)創(chuàng)傷性，避免倫理學(xué)問(wèn)題，易于體外提取、保存，且保存時(shí)間長(zhǎng)，可大量擴(kuò)增。HUcMsCs具有多向分化潛能，可跨胚層向神經(jīng)系統(tǒng)分化，且其分化能力強(qiáng)于人成熟組織及器官來(lái)源的MSCs;具有免疫調(diào)節(jié)作用，可異體移植［8］。移植后可向病灶處遷移。此外，臍帶組織來(lái)源干細(xì)胞在血管和神經(jīng)發(fā)生方面更具有優(yōu)勢(shì)［9］。許多學(xué)者應(yīng)用MSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)病變，研究發(fā)現(xiàn)自體或異體MSCs，通過(guò)靜脈輸注等途徑能歸巢至腦內(nèi)損傷部位［10］;這與缺血缺氧性損傷后，血腦屏障通透性增高［11］，細(xì)胞易于通過(guò)受損血腦屏障，炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)腦內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種黏附分子，促使HUcMSCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜發(fā)生特異性結(jié)合有關(guān);同時(shí)炎癥因子誘導(dǎo)MSCs定向遷移到腦部受損傷區(qū)域［10］。我們的實(shí)驗(yàn)選擇在新生未成熟大鼠缺血缺氧后24 h，此時(shí)病變部位炎癥介質(zhì)產(chǎn)生較多。經(jīng)腹腔移植 BrdU標(biāo)記HUcMSCs，觀察到HUcMSCs向宿主腦內(nèi)受損區(qū)域遷移，且主要集中于受損區(qū)域，表明經(jīng)腹腔移植的HUcMSCs能夠通過(guò)血腦屏障進(jìn)入宿主腦內(nèi)，遷移至損傷區(qū)域。應(yīng)用MSCs治療足月兒缺血缺氧性腦病(hypoxia-ischemic brain damage，HIBD)可刺激神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞再生，改善足月兒腦功能、減少損傷面積［3］。我們實(shí)驗(yàn)觀察到，接受HUcMSCs移植的新生大鼠未成熟腦組織缺血缺氧后經(jīng)MBP染色顯示，損傷區(qū)存活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組;P19d時(shí)HUcMSCs移植組懸吊試驗(yàn)、拒俘反應(yīng)、曠場(chǎng)試驗(yàn)得分均較移植PBS組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，移植人間充質(zhì)干細(xì)胞后動(dòng)物遠(yuǎn)期神經(jīng)行為學(xué)改善程度顯著;經(jīng)微型磁共振掃描亦觀察到接受移植HUcMSCs組腦部損傷面積較注射載體溶液組明顯減少，表明HUcMSCs移植可縮小新生大鼠PVL腦損傷區(qū)腦白質(zhì)損傷面積，這與 Koh等［12］的研究結(jié)果一致。目前，對(duì)于移植HUcMSCs保護(hù)缺血缺氧性腦損傷機(jī)理還不清楚。有研究顯示，HUcMSCs與宿主神經(jīng)細(xì)胞相互作用導(dǎo)致HUcMSCs自分泌營(yíng)養(yǎng)因子或周圍腦組織旁分泌營(yíng)養(yǎng)因子的增加［12］，促進(jìn)腦細(xì)胞的存活。此外，募集祖細(xì)胞到受損區(qū)域，提高損傷區(qū)域細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)這些增殖細(xì)胞分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞［13-14］，抑制凋亡，重建神經(jīng)組織功能。我們推測(cè)早產(chǎn)兒腦組織處于未成熟狀態(tài)，其再生和修復(fù)潛能大，給予HUcMSCs治療后，可刺激體內(nèi)再生，有效修復(fù)受損腦組織。

HUcMSCs是一種治療早產(chǎn)兒缺血缺氧性腦損傷極有潛力的細(xì)胞，為新生未成熟神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療開(kāi)辟了廣闊前景，但HUcMSCs治療新生鼠PVL確切機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。［參考文獻(xiàn)］

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