【摘要】目的 觀察雙氫青蒿素（DHA）對甲狀腺未分化癌（ATC）細胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響，為臨床提供參考。方法 取人ATC細胞株進行培養(yǎng)，分為對照組與DHA組，其中DHA組根據(jù)DHA干預(yù)劑量不同，分為5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA亞組。觀察DHA對ATC細胞形態(tài)的影響，采用細胞計數(shù)檢測試劑盒-8（CKK-8）、Transwell小室檢測DHA對ATC細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響；以流式細胞術(shù)（FCM）檢測DHA對ATC細胞凋亡的影響。結(jié)果 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24 、48 、72 及96 h后，對照組ATC細胞正常生長，5、10和20 μmol/L DHA組ATC細胞形態(tài)變化不明顯，40、80和160 μmol/L DHA組ATC細胞密度變得明顯稀疏，出現(xiàn)細胞離壁，腫脹，胞膜和胞體破裂分解，細胞死亡等情況。10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24 、48 及72 h后，ATC細胞的吸光度（OD）值均低于對照組，5 μmol/L DHA組藥液作用48 、72 h后，ATC細胞的OD值均低于對照組（均P<0.05）。5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞的遷移、侵襲細胞數(shù)均少于對照組（均P<0.05）。5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞晚期凋亡率均高于對照組（均P<0.05）；5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞早期凋亡率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）；40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞早期凋亡率均高于對照組（均P<0.05）。結(jié)論 DHA可明顯抑制ATC細胞的增殖、侵襲和遷移并誘導(dǎo)其凋亡，進而實現(xiàn)抑制ATC的作用。

【關(guān)鍵詞】雙氫青蒿素；甲狀腺未分化癌細胞；增殖；侵襲；遷移；凋亡

【中圖分類號】R736.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2024.22.0029.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.22.010

甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）惡性程度高，腫瘤生長速度快，侵襲性強，預(yù)后較差。有研究顯示，ATC發(fā)病率有升高趨勢[1]，嚴重威脅患者生命安全。近年來，有關(guān)ATC治療方案不斷優(yōu)化，但仍有部分ATC患者出現(xiàn)攝碘能力異常，表現(xiàn)出極強的細胞侵襲性和較高的轉(zhuǎn)移率，嚴重影響治療效果[2]。因此，積極研發(fā)新的ATC治療藥物對改善患者預(yù)后具有重要意義。雙氫青蒿素（DHA）是采用硼氫化納將青蒿素還原而生成的一種衍生物，具有強大的抗瘧作用，既往多用于寄生蟲病的治療中，已成為治療惡性瘧疾的特效藥，此外，DHA還具有生物利用度高、毒性較低、吸收快、排泄迅速和適用范圍廣等優(yōu)點[3]。隨著臨床應(yīng)用推廣和研究深入，有研究顯示，DHA具有抗腫瘤作用，在肝癌、肺癌和腸癌等惡性腫瘤中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果[4-5]。但有關(guān)DHA在ATC中的應(yīng)用還較為少見?；诖?，本研究觀察DHA對人ATC細胞的作用效果，初步探討DHA對ATC的治療作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 人ATC細胞株（上海研謹生物科技有限公司，批號：YJ-h443）；WE培養(yǎng)基[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號：12551032]和胎牛血清[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號：A5669701]，0.22 μm微孔濾膜，細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（6孔、12孔、24孔和96孔等），細胞計數(shù)檢測試劑盒（CKK）-8（山東思科捷生物技術(shù)有限公司，型號：CT0001-B）、二甲基亞砜（DMSO）（北京索萊寶科技有限公司，型號：D8371）、曲拉通X-100（Sigma-aldrich，型號：T8787），Transwell小室（美國Costar公司，型號：CLS3422），Matrigel基質(zhì)膠（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，型號：C0396）和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒（碧迪生物科學(xué)公司，型號：556547）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及含藥培養(yǎng)基的配制 ATC細胞快速復(fù)蘇后接種在含有100 mL/L胎牛血清的WE培養(yǎng)基中（含青霉素100 kU/L，鏈霉素100 mg/L），常規(guī)培養(yǎng)、消化、傳代；實驗均用對數(shù)生長期細胞。電子天平稱取DHA溶于DMSO，配制各藥物濃度分別為5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液，經(jīng)微孔濾膜過濾、分裝后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 觀察DHA對ATC細胞形態(tài)的影響 在37 ℃、5% CO2的條件下，ATC細胞培養(yǎng)液配成單細胞懸液，每孔5×103個細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中；培養(yǎng)24 h后移除細胞培養(yǎng)液，分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液各30 μL，培養(yǎng)24、48、72、96 h后經(jīng)倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.3 DHA對ATC細胞增殖的抑制作用 將對數(shù)生長期的ATC細胞進行計數(shù)，配制成3×104個/mL的細胞懸液。取100 μL的ATC細胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板（3×103個/孔），經(jīng)24 h培養(yǎng)使其貼壁，移除細胞培養(yǎng)液，分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液，培養(yǎng)24、48、72 h后，加入10 μL CKK溶液，于37 ℃下作用4 h，采用酶標儀（北京宏潤達科技發(fā)展有限公司，京械注準20162220432，型號：ZS-2）于450 nm波長下檢測吸光度（OD）值。

1.2.4 DHA對ATC細胞侵襲、遷移能力的影響 采用Transwell小室侵襲實驗檢測ATC細胞的侵襲能力。于4 ℃解凍Matrigel過夜，采用細胞培養(yǎng)液WE按1∶5稀釋，平鋪在Transwell小室的濾膜上，50 μL/膜，于37 ℃放置30 min，便于基底膜膠發(fā)生凝固，采用生理鹽水浸浴水化小室膜30 min待用。于Transwell下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，DHA組上室分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液400 μL，對照組上室加入無DHA藥物的血清WE培養(yǎng)基溶液400 μL，培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去上室面的細胞，固定，采用1 g/L的結(jié)晶紫染液（北京索萊寶科技有限公司，型號：CR202211004766）染色，在的生物顯微鏡[蔡司科技（蘇州）有限公司，蘇械注準20202220363，型號：Axiolab 5]（200×）下觀察并拍照，并隨機挑選6個視野進行穿膜細胞計數(shù)。采用遷移實驗檢測ATC細胞的遷移能力，操作步驟參照Transwell小室侵襲實驗，除Transwell小室的上室底部不鋪設(shè)基質(zhì)膠外，其余的操作步驟和方法均相同。

1.2.5 流式細胞術(shù)（FCM）檢測ATC細胞凋亡結(jié)果 采用雙熒光標記法檢測不同濃度DHA藥液作用后的ATC細胞的凋亡情況。具體步驟按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。每組取1 mL細胞懸液分別加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI混勻后避光標記10 min，采用流式細胞儀（碧迪公司，型號：BD FACSCalibur）進行細胞凋亡檢測。凋亡率=象限內(nèi)凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，流式細胞儀檢測圖右上象限為晚期凋亡細胞，右下象限為早期凋亡細胞。

1.3 觀察指標 ⑴分析DHA 對ATC細胞形態(tài)的影響。⑵分析DHA 對 ATC細胞增殖的抑制作用。⑶分析DHA對ATC細胞侵襲、遷移能力的影響。⑷觀察DHA對ATC細胞凋亡的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以（x）表示，多組間比較采用F檢驗，其兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHA對ATC細胞形態(tài)的影響 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48、72及96 h后，對照組ATC細胞正常生長，5、10和20 μmol/L DHA組ATC細胞形態(tài)變化不明顯，40、80和160 μmol/L DHA組ATC細胞密度變得明顯稀疏，出現(xiàn)細胞離壁，腫脹，胞膜和胞體破裂分解，細胞死亡等情況。

2.2 DHA對ATC細胞增殖的抑制作用 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48 及72 h后，ATC細胞的OD值均低于對照組，5 μmol/L DHA組藥液作用48、72 h后，ATC細胞的OD值均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見表1。

2.3 DHA對ATC細胞侵襲、遷移能力的影響 5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞的遷移、侵襲細胞數(shù)均少于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見表2。

2.4 DHA對ATC細胞凋亡的影響 5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞晚期凋亡率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞早期凋亡率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05），40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞早期凋亡率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見表3。

3 討論

ATC的兩大標志性惡性生物學(xué)行為包括血管生成和組織侵襲，是造成ATC預(yù)后極差的原因之一，主要表現(xiàn)為腫瘤細胞迅速生長、較早發(fā)生致命性的局部侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。DHA是倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有強大的抗瘧作用，還可抑制腫瘤相關(guān)蛋白表達，下調(diào)絲裂素活化蛋白激酶、胞外信號調(diào)控激酶等信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，既往已有多項報道證實DHA對肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤具有抑制作用[7-8]，這為臨床抗癌新藥的研發(fā)提供方向。但有關(guān)DHA在ATC中的應(yīng)用還較為少見。因此，本研究觀察DHA對人ATC細胞的作用效果，分析DHA對ATC的治療作用。

本研究結(jié)果顯示，10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48、72及96 h后，對照組ATC細胞正常生長，5、10和20 μmol/L DHA組細胞形態(tài)變化不明顯，40、80和160 μmol/L DHA組細胞密度變得明顯稀疏，出現(xiàn)細胞離壁，腫脹，胞膜和胞體破裂分解，細胞死亡等情況。這提示DHA對ATC細胞具有毒性作用，隨著DHA濃度的增加，ATC細胞的形態(tài)變化越明顯，細胞死亡率也越高。分析原因為，DHA可能通過干擾鐵代謝、促進脂質(zhì)過氧化、調(diào)控信號通路和改變基因表達等機制，誘導(dǎo)ATC細胞發(fā)生鐵死亡，從而改變其形態(tài)[9]。本研究結(jié)果顯示，10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48 及72 h后，ATC細胞的OD值均低于對照組，5 μmol/L DHA組藥液作用48、72 h后，ATC細胞的OD值均低于對照組；5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞的遷移、侵襲細胞數(shù)均少于對照組，這提示DHA可顯著抑制ATC細胞增殖、侵襲、遷移。分析原因為，凋亡和壞死是細胞死亡的方式，細胞凋亡是機體發(fā)育過程中基因調(diào)控下的細胞程序性死亡，惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征為細胞的凋亡受阻和過度細胞增殖[10]。DHA能阻斷Wnt/β-catenin蛋白信號通路，并增強糖原合酶激酶的催化活性，抑制甲狀腺腫瘤細胞分化、增殖。此外，DHA可與ATC細胞內(nèi)亞鐵離子結(jié)合，直接破壞ATC細胞，抑制ATC細胞的增殖、侵襲和遷移能力[11]。本研究結(jié)果顯示，5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞晚期凋亡率均高于對照組；5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞早期凋亡率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細胞早期凋亡率均高于對照組，這提示DHA可誘導(dǎo)ATC細胞凋亡。分析原因為，DHA能抑制核因子κB（NF-κB）蛋白表達，破壞腫瘤細胞膜與蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)DNA損傷，進而抑制腫瘤血管生長，達到促進腫瘤細胞凋亡目的，且DHA抗腫瘤作用可能具有劑量依賴性[12]。這也證實DHA有望成為甲狀腺未分化癌治療藥物，但其具體機制和臨床應(yīng)用還有待今后深入探討。

綜上所述，DHA可明顯抑制ATC細胞的增殖、侵襲和遷移能力并誘導(dǎo)其發(fā)生細胞凋亡，進而實現(xiàn)抑制甲狀腺腫瘤的作用。

參考文獻

李斐，李舍予.全球甲狀腺癌疾病負擔[J].中國全科醫(yī)學(xué)， 2018， 21（26）： 3155-3159.

周一坤，施秉銀.對甲狀腺未分化癌生物學(xué)行為的再認識[J].中華醫(yī)學(xué)雜志， 2023， 103（5）： 375-377.

YANG S， ZHANG D， SHEN N， et al. Dihydroartemisinin increases gemcitabine therapeutic efficacy in ovarian cancer by inducing reactive oxygen species[J]. J Cell Biochem， 2019， 120（1）： 634-644.

周許薇，譚蔚鋒，解方園，等.雙氫青蒿素抗癌藥理作用機制的研究進展[J].藥學(xué)實踐雜志， 2019， 37（3）： 206-211， 278.

孫卉，陳曉靜，劉麗，等.雙氫青蒿素通過PI3K/Akt通路逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥A549/DDP細胞的分子機制[J].中國藥師， 2021， 24（6）： 1013-1017.

RAMMAL R， WASSERMAN J K， SINGHI A D， et al. Glomangiosarcoma-like anaplastic transformation in papillary thyroid carcinoma： A novel form of heterologous differentiation and a systematic review of heterologous element prevalence[J]. Endocr Pathol， 2023， 34（4）： 471-483.

胡冰琪，周靜，黃俊峰，等.雙氫青蒿素抑制非小細胞肺癌細胞遷移侵襲和血管生成擬態(tài)的初步研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2023， 58（5）： 766-771.

周駟杰，劉思豪，楊嘉昕，等.雙氫青蒿素誘導(dǎo)前列腺癌細胞焦亡及調(diào)控凋亡相關(guān)斑點樣蛋白甲基化[J].陸軍軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 2022， 44（14）： 1421-1430.

董佳悅，李樹杰，王艷，等.雙氫青蒿素和索拉非尼誘導(dǎo)未分化甲狀腺癌鐵死亡的協(xié)同機制[J]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志， 2023， 39（7）： 596-604.

潘宗富，方琦璐，張軼雯，等.基于生物信息學(xué)的未分化甲狀腺癌惡性機制研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)， 2018， 35（11）： 1606-1612

PACCEZ J D， DUNCAN K， SEKAR D， et al. Correction： Dihydroartemisinin inhibits prostate cancer via JARID2/miR-7/miR-34a-dependent downregulation of Axl[J]. Oncogenesis， 2024， 13（1）： 32.

費偉東，葉軼青，陳玥，等.雙氫青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細胞鐵死亡及其機制研究[J].中草藥， 2020， 51（13）： 3473-3481.