關(guān)鍵詞：蒙古冰草;脫水素基因;生物信息學(xué)分析;干旱脅迫

蒙古冰草（Agropyronmongolicum Keng）屬于典型的冰草屬寒旱生、二倍體（2n=2x=14，PP）多年生禾草，多分布于中國(guó)西北部地區(qū)，在沙土、干燥草原地帶均可生長(zhǎng)[1]，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐旱特性，具有分蘗多、耐風(fēng)沙、耐土地瘠薄的優(yōu)點(diǎn)，且具有作物遺傳改良的優(yōu)異抗旱基因資源[2-3]，還富含極高的飼用價(jià)值[4]。

植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常遭受各種生物脅迫以及非生物脅迫，導(dǎo)致作物產(chǎn)量顯著受損，為了應(yīng)對(duì)這些傷害，植物進(jìn)化出了抵御不良環(huán)境的機(jī)制。1988年科學(xué)家第一次在干旱條件下的作物大麥和玉米中發(fā)現(xiàn)植物脫水誘導(dǎo)蛋白[5]。隨后，這個(gè)蛋白被命名為脫水蛋白，且被確定為植物耐干旱的生物學(xué)遺傳基礎(chǔ)。研究表明，脫水素（Dehydrin，DHN）有效參與植物的脅迫應(yīng)答過程，在植物遭受鹽、低溫或是干旱等非生物脅迫后期會(huì)大量積累并表達(dá)，還可以對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)起到保護(hù)和抗逆的作用[6]，協(xié)助植物克服逆境脅迫[7]。脫水素是一種高度親水蛋白，廣泛存在于植物中，屬于胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白LEAⅡ家族成員，相對(duì)分子質(zhì)量在9～200kD之間。脫水素蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保守性強(qiáng)，具有3個(gè)高度保守片段，即K，Y和S段[8]，根據(jù)植物中脫水素蛋白各個(gè)片段所含數(shù)量及種類的差異，將脫水素家族分為YnSKn，YnKn，SKn，KnS，Kn 五類。這五大類中，YnSKn 是最為常見的一種，通常這類蛋白包含3個(gè)或3個(gè)以下的Y保守片段和若干個(gè)K段，這類脫水素蛋白是堿性或中性脫水素;YnKn 型脫水素包含Y段和K段，且二者所含數(shù)量在3以下，此類脫水素蛋白是典型的酸性脫水素;SKn，KnS多數(shù)屬于酸性脫水素，二者都包含1個(gè)S片段和1～3個(gè)K片段;多數(shù)Kn 型脫水素包含2～9個(gè)K片段，屬于中性或酸性蛋白[9]。脫水素蛋白具有非常高的親水性[10]以及熱穩(wěn)定性[11]，能夠?qū)⑺肿硬蹲讲㈡i在植物體內(nèi)，從而保護(hù)植物體細(xì)胞免受干旱的損傷[12-13]。已有研究證明當(dāng)植物遭受干旱、低溫、鹽等非生物脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的脫水素基因表達(dá)量顯著上調(diào)[14-15]。

關(guān)于脫水素的功能探究發(fā)現(xiàn)，白刺花（Sophoradavidii （Franch.）Skeels）葉片和根中SdDHN 基因在干旱脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，復(fù)水后則表達(dá)水平恢復(fù)正常[16]。狗牙根‘C299’品種中DHNS 基因在離體狀態(tài)下導(dǎo)入E.coli 表現(xiàn)出明顯的耐鹽性和耐酸堿性;轉(zhuǎn)基因研究證實(shí)，DHNS 提高了擬南芥（Arabidopsisthaliana）對(duì)干旱、鹽脅迫、高滲脅迫和酸堿環(huán)境的耐受能力[17]。甘薯（IpomoeabatatasLam.）中IbDHN1 基因qRT-PCR 分析顯示，Ib-DHN1 的表達(dá)受干旱和鹽脅迫處理的顯著誘導(dǎo)[18]。這些結(jié)果均表明，DHN 蛋白在非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。本研究以蒙古冰草為研究材料，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選DHN 基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析，為進(jìn)一步研究蒙古冰草脫水素基因在干旱脅迫響應(yīng)中的功能和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蒙古冰草種子采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)薩拉齊牧草繁種基地。挑選顆粒飽滿的種子萌發(fā)，于室內(nèi)培養(yǎng)箱（BIC-300）水培[溫度為（24±1）℃、光/暗周期為16/8h]。在三葉一心期，用含25%的PEG-6000的1/5Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行模擬干旱處理，未干旱處理的蒙古冰草設(shè)為對(duì)照（CK），分別在干旱處理12h，24h，48h，3d，5d，7d及復(fù)水24h取樣，每處理3次重復(fù)。委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（數(shù)據(jù)登錄號(hào)為PRJNA742257）[19]。

1.2 蒙古冰草脫水素基因的篩選及結(jié)構(gòu)域鑒定

從干旱脅迫下蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中，根據(jù)功能注釋初步篩選出11個(gè)脫水素基因，利用notepad++軟件找到對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，用NCBI中的ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）在線軟件對(duì)基因的開放閱讀框（OpenReadingFrame，ORF）進(jìn)行選擇，然后用Pfam（https：//www.pfam.xfam.org/），CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）在線軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)鑒定，并使用TBtools可視化脫水素蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.3 蒙古冰草脫水素基因保守基序分析及序列比對(duì)

使用在線軟件TheMEMESuite中的MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對(duì)篩選出的蒙古冰草脫水素基因的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，基序參數(shù)設(shè)定為最大值20;使用DNAMAN 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.4 蒙古冰草脫水素蛋白的理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

用ExpasyProtParam （https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對(duì)DHN 蛋白的氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)、分子量、總平均親水性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析;利用WOLFPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線軟件對(duì)脫水素蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.5 蒙古冰草脫水素基因進(jìn)化分析

將篩選出的6個(gè)蒙古冰草脫水素基因與12個(gè)已報(bào)道具有耐旱、耐低溫、耐鹽脅迫等功能的脫水素基因（表1）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。使用MEGA11.0軟件，采用鄰位算法（Neighbor-Joining method），1000次Bootstrap測(cè)試，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，后使用evolview在線軟件（https：//evolgenius.info//evolview-v2/#login）進(jìn)行美化。

1.6 蒙古冰草脫水素蛋白不同干旱處理下的表達(dá)分析

蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用TPM（TranscriptsPer Kilobaseofexonmodelper Million mappedreads）對(duì)樣本表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。

用SnapGene3.03對(duì)篩選出來的蒙古冰草抗旱相關(guān)基因的特異性引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，U6為內(nèi)參基因（引物序列見表2），委托生工（Sangon，上海）合成序列。

使用TRNzol試劑（TIANGEN，北京）提取蒙古冰草CK和干旱處理1d，3d，5d，7d及復(fù)水24h的總RNA，用FastQuantRT Kit（withgDNase）試劑盒將蒙古冰草試驗(yàn)組及對(duì)照組的TotalRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用MomAmpSYBR GreenqPCRMix試劑盒（MQ10201S）進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)處理4次生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR 試驗(yàn)總反應(yīng)體系為20.0μL，其中上下游引物（10μmol·L-1）各0.4μL，cDNA 模板1.2μL，Nuclease-FreeH2O8μL，MomAmpSYBR GreenqPCR Mix 試劑10μL。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95℃30s，變性95℃10s，退火61℃10s，延伸72℃ 30s，循環(huán)次數(shù)為30次，在FTC-3000P上運(yùn)行程序。采用2-ΔΔCT 法[32]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，并通過SPSS26.0軟件進(jìn)行表達(dá)量差異顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古冰草脫水素蛋白家族的鑒定分析

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫根據(jù)功能注釋挑選出11個(gè)基因，Pfam網(wǎng)站輸入11個(gè)基因的ORF序列后預(yù)測(cè)6個(gè)基因具有DHN 保守結(jié)構(gòu)域（PF00257）;CDD網(wǎng)站輸入6個(gè)基因的ORF序列后預(yù)測(cè)6個(gè)基因均具有DHN保守結(jié)構(gòu)域，其中2個(gè)基因具有Dehydrinsu-perfamily結(jié)構(gòu)域，分別是TRINITY_DN27921_c1_g1，TRINITY_DN14936_c0_g6，最終確定6個(gè)基因含有脫水素保守結(jié)構(gòu)域;將CDD網(wǎng)站蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果下載后，使用TBtools將其可視化（圖1）。

2.2 蒙古冰草脫水素基因的保守基序及序列比對(duì)分析

對(duì)6個(gè)蒙古冰草脫水素基因的ORF進(jìn)行保守序列對(duì)比，并對(duì)每個(gè)亞族保守區(qū)進(jìn)行分析（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒙古冰草脫水素基因家族整體高度保守性，所有成員均包含K 保守序列區(qū)，TRINITY _DN18948_c1 _g4，TRINITY _DN18948 _c1 _g1，TRINITY _DN14936 _c0 _g6 和TRINITY _DN19347_c0_g7 包含1個(gè)S序列區(qū)（表3）。

蒙古冰草DHN 蛋白保守基序分析發(fā)現(xiàn)3種motif（圖3，圖4），motif1和motif2對(duì)應(yīng)K 片段保守區(qū)域（EKKGIMDKIKEKPLG），歸為一類，推測(cè)是基因內(nèi)結(jié)構(gòu)域擴(kuò)增形成的，6個(gè)基因均具有兩個(gè)富K結(jié)構(gòu)域，分別是motif1和motif2，而motif3對(duì)應(yīng)S片段保守區(qū)域（4～10個(gè)絲氨酸殘基組成）。6個(gè)基因根據(jù)有無S結(jié)構(gòu)域可歸屬于兩大類：TRINITY_DN18948_c1_g4，TRINITY_DN18948_c1_g1，TRINITY _DN14936 _c0 _g6 和TRINITY _DN19347_c0_g7 這4個(gè)具有S結(jié)構(gòu)域的為一類;TRINITY _DN23361 _c0 _g4 和TRINITY _DN27921_c1_g1 這2個(gè)不具有S結(jié)構(gòu)域的為一類。

2.3 脫水基因蛋白序列的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位分析

6個(gè)脫水素蛋白氨基酸數(shù)目在81～275個(gè)氨基酸殘基之間，TRINITY_DN23361_c0_g4 的氨基酸數(shù)目最少，為81個(gè)氨基酸殘基，TRINITY_DN18948_c1_g4 的最多，為275個(gè)氨基酸殘基;分子量在8283.39 Da～2 7476.48 Da 之間，其中TRINITY _DN23361_c0 _g4 的分子量最小，而TRINITY _DN14936_c0_g6 的分子量最大;6個(gè)脫水素基因的等電點(diǎn)在5.14～10.00之間，除TRINITY_DN14936_c0_g6，TRINITY_DN19347_c0_g7 外，其余4個(gè)脫水素蛋白均為堿性蛋白質(zhì);6個(gè)脫水素蛋白均為親水性蛋白，均定位于細(xì)胞核（表3），初步推測(cè)蒙古冰草脫水素蛋白在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

2.4 蒙古冰草脫水素基因的進(jìn)化關(guān)系分析

將蒙古冰草脫水素基因與12個(gè)其他物種具有耐低溫、耐旱、耐鹽脅迫等功能的脫水素基因構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果將進(jìn)化樹分為3個(gè)大類，其中第2類不含有蒙古冰草脫水素基因。第1大類包含2個(gè)蒙古冰草脫水素基因，分別是TRINITY_DN14936_c0_g6和TRINITY _DN19347 _c0 _g7，TRINITY _DN14936 _c0 _ g6 與擬南芥KJ000690.1（SpDHN1）聚在一個(gè)小分支上，它們的相似度為100%，SpDHN1 在擬南芥植株中過表達(dá)能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力[21]，TRINITY_DN19347_c0_g7 與杜鵑CV015064（RcDhn5）聚在一個(gè)小分支上，它們的相似度為100%，RcDhn5 的過表達(dá)能夠增強(qiáng)擬南芥的的冷凍耐受性[29];第3類中含有4個(gè)蒙古冰草脫水素基因，TRINITY_DN23361_c0_g4和TRINITY _DN27921 _c1 _g1 聚在1 個(gè)小分支上，TRINITY _DN18948 _c1 _g4 和TRINITY _DN18948_c1_g1 聚在一個(gè)分支上，有較近進(jìn)化關(guān)系，TRINITY_DN18948_c1_g4 和小麥OK094572（WDHN2）聚在一個(gè)小分支上，相似度為100%，WDHN2 受干旱、高鹽、低溫和脫落酸誘導(dǎo)表達(dá)[25]。SpDHN1 和WDHN2 已被證明與干旱脅迫相關(guān)，根據(jù)MEGA 分類和各類成員基因功能，推測(cè)蒙古冰草TRINITY_DN14936_c0_g6 和TRINITY _DN18948_c1_g4 也具有相似功能，參與干旱脅迫響應(yīng)（圖5）。

2.5 蒙古冰草脫水素蛋白不同干旱處理下的表達(dá)水平分析

在干旱處理24h，3d，5d，7d，復(fù)水24h及對(duì)照（CK）下，對(duì)篩選出的與抗旱相關(guān)的蒙古冰草6個(gè)脫水素基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，6個(gè)DNH 基因?qū)Ω珊得{迫響應(yīng)程度各不相同，結(jié)果如圖6所示。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，6個(gè)蒙古冰草抗旱相關(guān)基因在25%PEG-6000處理期間表達(dá)量均高于CK，6個(gè)基因的表達(dá)量總體隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，DN18948_c1_g4 呈一直上升的趨勢(shì)，DN14936_c0_g6，DN18948 _c1 _g1，DN23361 _c0 _g4 和DN27921_c1_g1 的表達(dá)趨勢(shì)為先上升后下降再上升，DN19347_c0_g7 基因的表達(dá)趨勢(shì)為先上升后下降再上升又下降;DN18948_c1_g4，DN14936_c0_g6，DN18948_c1_g1 和DN27921_c1_g1 這4個(gè)基因在復(fù)水24h表達(dá)量最高，DN23361_c0_g4在5d表達(dá)量最高，DN19347_c0_g7 在1d表達(dá)量最高。qRT-PCR 結(jié)果分析表明，6個(gè)脫水素基因均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，DN18948_c1_g4，DN27921_c1_g1 和DN23361_c0_g4 這3個(gè)基因在3d表達(dá)量最高，DN19347 _c0 _g7 在5d 表達(dá)量最高，DN18948_c1_g1 和DN14936_c0_g6 這2個(gè)基因在復(fù)水24h 表達(dá)量最高;DN18948 _c1 _g1 和DN14936_c0_g6 的復(fù)水24h處理組與CK相比表達(dá)量差異顯著，DN18948_c1_g4 和DN27921_c1_g1 的3d處理組與CK 相比表達(dá)量差異顯著，DN23361_c0_g4 的3d，5d，7d和復(fù)水24h處理組與CK相比表達(dá)量差異顯著，其余處理組表達(dá)量與CK 的表達(dá)量相比差異不顯著，DN19347_c0_g7 表達(dá)趨勢(shì)為上調(diào)表達(dá)，然而處理組與CK 相比表達(dá)量差異不顯著，說明蒙古冰草DHN 參與蒙古冰草對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。

3 討論

脫水素基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，徐學(xué)中等[33]發(fā)現(xiàn)脫水素的生物學(xué)功能與植物內(nèi)源激素ABA 息息相關(guān)，植物遭受鹽、低溫或是干旱等非生物脅迫的情形下，植物體內(nèi)ABA 的激素含量顯著增加[33]。

為篩選與蒙古冰草抗旱相關(guān)的DHN 蛋白，本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選出6 個(gè)蒙古冰草DHN 家族成員，其中2個(gè)具有Dehydrinsuperfam-ily結(jié)構(gòu)域，4個(gè)具有Dehydrin結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)蒙古冰草DHN 蛋白都屬于親水性蛋白，與小麥、番木瓜（Carica papaya L.）、甘薯等[18，27，34]對(duì)DHN 蛋白親疏水性的研究結(jié)果一致，有較強(qiáng)的水合能力。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，蒙古冰草DHN 蛋白定位于細(xì)胞核，說明蛋白在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。在蒙古冰草DHN 蛋白保守基序分析中，共出現(xiàn)了3種motif，motif1和motif2對(duì)應(yīng)脫水素蛋白的K 保守片段（EKKGIMDKIKEKPLG），motif3對(duì)應(yīng)脫水素蛋白的S保守片段（4～10個(gè)絲氨酸殘基組成的片段），與馮闖、張紅梅和趙陽[9，27，35]對(duì)DHN 蛋白的保守基序研究結(jié)果相似。大量研究表明，脫水素蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)面臨非生物脅迫起正調(diào)控作用，例如WDHN2[27]，DHN5[22]，SpDHN1[23]等。將6 個(gè)DHN 蛋白和已知具有耐旱、耐寒和耐鹽脅迫等功能的12 個(gè)DHN 蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹分析，小麥WDHN2[27]qPCR分析表明，WDHN2 基因受干旱、高鹽、低溫和脫落酸誘導(dǎo)表達(dá)，構(gòu)建原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，重組菌的抗性實(shí)驗(yàn)表明，WDHN2蛋白可以增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)滲透脅迫、高鹽等非生物脅迫的抗性。將苜蓿MtCAS31 轉(zhuǎn)入到擬南芥中，Mt-CAS31 過表達(dá)顯著降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥的氣孔密度，顯著增強(qiáng)其耐旱性[25]。擬南芥植物中Sp-DHN1 的異位表達(dá)和野生型相比表現(xiàn)出更好的抗旱脅迫能力[23]。趙陽等對(duì)玉米的幼苗進(jìn)行鹽和干旱脅迫處理下的表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因均表現(xiàn)出不同程度的響應(yīng)，其中ZmDHN1，ZmDHN3，ZmDHN4 和ZmDHN5 出現(xiàn)大幅度的上調(diào)表達(dá)[35]。這些均證明脫水素基因與干旱脅迫響應(yīng)有關(guān)，且與蒙古冰草有較高的同源性，進(jìn)而推測(cè)TRINITY _DN14936 _c0 _g6 和TRINITY _DN18948_c1_g4 也具有相似功能，可能參與干旱脅迫響應(yīng)。

另外，AhDHN1 在花生的葉片中對(duì)干旱脅迫起正調(diào)控作用[36]，張紅梅等對(duì)小麥WDHN2 進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，表明WDHN2 在干旱脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)，基因表達(dá)量存在先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)[27]，小麥WZY1-2蛋白的表達(dá)量隨著干旱程度增加而升高[37]，扁穗冰草Acwcs120，Acwzy2 對(duì)干旱脅迫均有響應(yīng)[38]。本研究中，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和qRT-PCR分析均表明6個(gè)基因的表達(dá)量總體隨干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，與前人研究結(jié)果相似，推測(cè)6個(gè)蒙古冰草脫水素基因在干旱脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有關(guān)鍵作用。qRT-PCR 結(jié)果分析顯示，DN18948_c1_g1和DN14936_c0_g6 的復(fù)水24h處理組、DN18948_c1_g4 和DN27921_c1_g1 的3d處理組、DN23361_c0_g4 的3d，5d，7d和復(fù)水24h處理組與CK組相比表達(dá)量差異顯著，DN19347_c0_g7的處理組與CK 組相比表達(dá)量差異不顯著。以上研究表明，脫水素蛋白在植物干旱脅迫過程中具有多樣的響應(yīng)模式，而且脫水素蛋白功能呈現(xiàn)多樣性。

綜上，本研究初步證明蒙古冰草脫水素基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，可能參與蒙古冰草對(duì)干旱脅迫的調(diào)控過程。下一步的工作是通過轉(zhuǎn)基因的手段將脫水素基因轉(zhuǎn)入蒙古冰草和擬南芥中，進(jìn)一步探究蒙古冰草脫水素基因的抗旱機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究基于蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選得到6個(gè)參與逆境脅迫的脫水素基因，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)均位于細(xì)胞核;干旱誘導(dǎo)脅迫下DN19347_c0_g7基因呈下調(diào)表達(dá)，起負(fù)調(diào)控作用;DN18948_c1_g4，DN14936_c0_g6，DN18948_c1_g1，DN27921_c1_g1 和DN23361_c0_g4 在干旱誘導(dǎo)脅迫下呈上調(diào)表達(dá)，起正調(diào)控作用。