陳 靜 金燦燦 周皓鵬 張茜蕙 梅 輝

江蘇省泰興市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 泰州 225400

慢性乙型肝炎（以下簡(jiǎn)稱“乙肝”）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起，可經(jīng)血液、母嬰、性傳播，是全球廣泛存在的公共衛(wèi)生問題[1]。未加抑制的HBV 在肝臟中大量復(fù)制，可導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)釋放等情況發(fā)生，使得肝臟組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，逐漸轉(zhuǎn)壞為乙肝肝硬化，最終發(fā)展為肝癌[2]。臨床調(diào)查顯示未經(jīng)抗病毒治療的乙肝患者肝硬化年發(fā)生率為2%～10%，非肝硬化乙肝患者發(fā)展為原發(fā)性肝癌的年發(fā)生率為0.2%～1.0%[3-5]。乙肝診斷以實(shí)驗(yàn)室檢查為主要依據(jù)，常見包括乙肝兩對(duì)半及HBVDNA 定量檢測(cè)，前者是血清學(xué)傳統(tǒng)標(biāo)志檢查包括乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙肝表面抗體（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙肝e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙肝e抗體（hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙肝核心抗體（hepatitis B core antibody，HBcAb），可通過觀察HBV 顆粒外殼蛋白成分誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體情況觀察患者感染情況，此法檢測(cè)方便快捷、患者接受程度高，但是結(jié)果異常并不意味著外周血存在HBV完整顆粒，因此準(zhǔn)確率存疑；后者可通過基因擴(kuò)增技術(shù)直觀了解HBV 感染者病毒復(fù)制水平，不僅能用于診斷，還能用于判斷抗病毒治療效果，便于調(diào)整治療方案，是乙肝診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是此法為有創(chuàng)操作且檢測(cè)要求較高，限制其廣泛使用[6]。既往有研究發(fā)現(xiàn)乙肝兩對(duì)半指標(biāo)與HBV-DNA 定量檢測(cè)結(jié)果相關(guān)，本研究分析375 例乙型肝炎患者病例，旨在探討乙肝兩對(duì)半指標(biāo)水平與HBV 感染和復(fù)制的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取江蘇省泰興市人民醫(yī)院（本院）2021 年4 月至2023 年4 月收治的375 例乙型肝炎患者病例為研究資料。其中男211 例，女164 例；年齡32 ～69 歲，平均（47.57±6.12）歲；疾病類型：慢性肝炎213 例，肝硬化121 例，肝癌41 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18 歲；②符合《慢性乙型肝炎防治指南（2022 年版）》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、其他肝?。虎诮谧⑸湟腋我呙??；颊邔?duì)本研究知情同意，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：2023-0814 號(hào)）。

1.2 方法

1.2.1 檢查方法 所有患者均接受乙肝兩對(duì)半及HBV-DNA 定量檢測(cè)。①兩對(duì)半檢測(cè)方法：取患者外周靜脈血5 ml，離心半徑16 cm，轉(zhuǎn)速3500 rpm，離心時(shí)間10 min 獲得血清樣本，-70℃保存待測(cè)。取待測(cè)樣本，使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 檢測(cè)患者HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb 水平。檢測(cè)試劑盒來自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司，檢測(cè)儀器包括Sorvall LYNX 6000 超速離心機(jī)、羅氏Cobas e602 型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。②HBV-DNA 定量檢測(cè)方法：取待測(cè)樣本，使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)，根據(jù)試劑盒使用說明，取300 μl DNA 提取溶液1、200 μl待測(cè)樣本，震蕩混勻10 s，瞬時(shí)離心；加入100 μl DNA 提取溶液2-mix，震蕩混勻10 s 后，室溫靜置10 min；瞬時(shí)離心后將離心管置于分離器上，3 min后緩慢將溶液吸出；加入600 μl DNA 提取溶液3 和200 μl DNA 提取溶液，震蕩混勻5 s，瞬時(shí)離心后將離心管再次置于分離器上；靜置1 min 后將管底殘余液體完全吸出丟棄；每管加入30 μl洗脫液，最后HBV-DNA 洗脫于30 μl 洗脫液中。內(nèi)、外引物為HBV 的S 基因保守序列，外引物P1：5’-CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3’（300-321），P2：5’-AGGGTTTAAATGTATACCC-3’（715-695）；內(nèi)引物P3：5’-TCTATGTTTCCCTCTTGTTGC-3’（421-441），P4：5’-TACCACATCATCCATATAACTG-3’（626-605）。擴(kuò)增參數(shù)：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95℃ 15 s，58℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)；37℃ 10 s。檢測(cè)試劑盒來自圣湘生物科技股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）。

1.2.2 判定標(biāo)準(zhǔn) ①乙肝兩對(duì)半檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)：正常標(biāo)準(zhǔn)HBsAg<1 COI，HBsAb<10 IU/L，HBeAg<1 COI，HBeAb>1 COI，HBcAb>1 COI[8]。②HBV-DNA 定量檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：HBV-DNA 定量檢測(cè)結(jié)果≥20 IU/ml 為陽性，定量檢測(cè)值取對(duì)數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)使用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析使用Pearson 相關(guān)性分析，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乙肝兩對(duì)半及HBV-DNA定量檢測(cè)結(jié)果

匯總患者乙肝兩對(duì)半類型共6 種，見表1。不同乙肝兩對(duì)半類型患者HBV-DNA 陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=105.044，P< 0.001）。

2.2 HBV-DNA定量與兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析

HBV-DNA 陽性組患者HBsAg、HBeAg 水平高于HBV-DNA 陰性組，HBsAb、HBeAb、HBcAb 水平低于HBV-DNA 陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見表2。Pearson 相關(guān)性分析顯示，HBsAg、HBeAg 水平與HBV-DNA 呈正相關(guān)（P< 0.05），HBsAb、HBeAb、HBcAb 水平與HBV-DNA 呈負(fù)相關(guān)（P< 0.05），見表3。

表2 不同HBV-DNA結(jié)果患者兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

表2 不同HBV-DNA結(jié)果患者兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

注 HBsAg：乙肝表面抗原；HBsAb：乙肝表面抗體；HBeAg：乙肝e 抗原；HBeAb：乙肝e 抗體；HBcAb：乙肝核心抗體；HBV：乙型肝炎病毒

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表3 HBV-DNA定量與兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析

2.3 不同疾病類型乙肝兩對(duì)半類型HBV-DNA陽性率比較和不同疾病類型HBV-DNA定量檢測(cè)結(jié)果比較

不同疾病類型患者乙肝兩對(duì)半類型HBV-DNA陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見表4。不同疾病類型患者HBV-DNA 定量檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見表5。

表4 不同疾病類型乙肝兩對(duì)半類型HBV-DNA陽性率比較[n（%）]

表5 不同疾病類型HBV-DNA定量檢測(cè)結(jié)果比較[lg（IU/ml），±s]

表5 不同疾病類型HBV-DNA定量檢測(cè)結(jié)果比較[lg（IU/ml），±s]

注 HBV：乙型肝炎病毒

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3 討論

HBV 感染后在人體內(nèi)大量復(fù)制可損害肝臟組織，增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)，目前臨床暫無特異性治療方法，主要以抗病毒藥物控制，早期篩查診斷是控制乙肝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。基于基因維度的HBV-DNA 定量檢測(cè)是判斷HBV 在人體內(nèi)表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)，但此法操作要求較高，基層醫(yī)院難以推廣[10]。傳統(tǒng)血清學(xué)乙肝標(biāo)志物簡(jiǎn)稱為“乙肝兩對(duì)半”，檢查門檻較低，利用試劑盒檢查獲取結(jié)果較為便捷，但是各類標(biāo)志物組合類型復(fù)雜多樣，在臨床判斷中存在一定難度，可能導(dǎo)致誤診、漏診，無法作為最終診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。因此臨床診斷中應(yīng)注意保證診斷有效性與防止過度醫(yī)療間的平衡，基于此，本研究探究HBV-DNA 定量、兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示不同乙肝兩對(duì)半類型患者HBV-DNA 陽性率差異顯著，以類型1 患者陽性率最高，類型6 最低，說明不同乙肝兩對(duì)半類型與患者病毒復(fù)制進(jìn)展水平存在關(guān)聯(lián)。類型1 臨床常稱作大三陽，其中HBsAg 是HBV 感染人體復(fù)制后脫下來的蛋白質(zhì)外殼，陽性提醒患者被感染或曾被感染，無法準(zhǔn)確判斷患者感染階段，此外有研究顯示其水平與免疫耐受相關(guān)，在患者免疫耐受時(shí)期可達(dá)到峰值[12]。HBeAg 是存在于HBV 核心中的可溶性蛋白，由HBV-DNA 開放讀碼框前C 區(qū)編碼，被認(rèn)為與病毒復(fù)制增加相關(guān)，陽性可說明病毒復(fù)制活躍，傳染性強(qiáng)，當(dāng)HBeAg 轉(zhuǎn)陰、HBeAb 陽性時(shí)提醒病情進(jìn)入恢復(fù)期[13]。HBcAb 是HBV 核心區(qū)基因產(chǎn)物，是機(jī)體特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞攻擊的主要靶抗原，可在一定程度反映肝組織炎癥水平[14]。本研究發(fā)現(xiàn)HBV-DNA 陰性組、陽性組患者乙肝兩對(duì)半指標(biāo)均有差異，其中HBsAg、HBeAg 水平與HBVDNA 呈正相關(guān)，HBsAb、HBeAb、HBcAb 水平與HBV-DNA 呈負(fù)相關(guān)（P< 0.05）。感染HBV 可明顯增加患者肝硬化、肝癌風(fēng)險(xiǎn)，本研究結(jié)果顯示不同疾病類型患者乙肝兩對(duì)半類型HBV-DNA 陽性率比較和不同疾病類型HBV-DNA 定量檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），肝炎患者病毒量明顯高于肝硬化和肝癌患者，其兩對(duì)半類型以大三陽為主，而肝硬化和肝癌患者以小三陽為主。考慮是因?yàn)楦伟┖透斡不颊咄ǔ８腥緯r(shí)間較久，已經(jīng)歷過病毒快速增殖時(shí)期，因此現(xiàn)存HBV-DNA 表達(dá)量低于肝炎患者。當(dāng)患者從大三陽轉(zhuǎn)化為小三陽時(shí)，可見其病毒復(fù)制水平下降，同時(shí)提醒患者免疫功能受損，使肝臟組織更易發(fā)生纖維化進(jìn)而加重肝功能受損害[15]。

綜上所述，乙肝患者兩對(duì)半?yún)?shù)水平與HBVDNA 定量水平有相關(guān)性，不同兩對(duì)半類型患者HBV-DNA 陽性率有差異，有助于臨床針對(duì)性篩查，減少漏診、誤診，不同疾病類型患者兩對(duì)半類型和HBV-DNA 定量差異顯著，可見聯(lián)合上述檢測(cè)有助于判斷患者肝受損程度，為臨床精確診療提供指導(dǎo)。