王惠敏 王歡歡 馮梅 高源 董瑩瑩 柏冬

黃芪桂枝五物湯原載于《金匱要略·血痹虛勞病篇》,由黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗組成,具有益氣溫經(jīng)、和血通痹的功效,為治療血痹之常用方劑[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),黃芪桂枝五物湯主治病證共52條,痹證有37條,其中又以血痹居多,有28條,其余痹證有痿痹、痛痹、風(fēng)痹麻木等[2]。

糖尿病性周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是一組以感覺和自主神經(jīng)癥狀為主要臨床表現(xiàn)的周圍神經(jīng)病變,西醫(yī)常給予控制飲食、適當(dāng)鍛煉等基礎(chǔ)治療和修復(fù)神經(jīng)、抗氧化應(yīng)激、改善微循環(huán)、改善代謝紊亂等對癥治療[3]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatic arthritis,RA)是一種慢性、破壞性的自身免疫性疾病[4],RA的相關(guān)治療以抗炎為關(guān)鍵策略[5]。中醫(yī)藥在預(yù)防疾病及并發(fā)癥方面具有許多優(yōu)勢,尤其在慢性病方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢[6]。

中醫(yī)藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),體現(xiàn)了中醫(yī)“一方多治”[7]的思想觀念,而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以從多靶點(diǎn)、多途徑的角度闡釋藥理機(jī)制,探索藥物與疾病之間的靶點(diǎn)和通路關(guān)系,并在此基礎(chǔ)上闡明中藥的復(fù)雜作用機(jī)制[8-9]。因此,本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法,從中醫(yī)“異病同治”的角度初步探討黃芪桂枝五物湯治療DPN、RA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 黃芪桂枝五物湯活性成分的收集

以黃芪桂枝五物湯中黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗5味藥材為關(guān)鍵詞,利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)[10](https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、TCM Database@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)[11]及文獻(xiàn)檢索收集藥物的主要活性成分。其中,以口服生物利用度≥30%,藥物相似性≥0.18為TCMSP中藥有效成分的篩選參數(shù);以有生物活性和藥理作用報(bào)道且含量較高但未符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的成分也納入候選活性成分為文獻(xiàn)相關(guān)成分篩選標(biāo)準(zhǔn)。將以上數(shù)據(jù)庫所得的結(jié)果合并后進(jìn)行去重得到相關(guān)藥物的活性成分。

1.2 黃芪桂枝五物湯潛在靶點(diǎn)預(yù)測

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫對有效活性成分的蛋白靶點(diǎn)預(yù)測,并結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(UniversalProtein,UniProt)(https://www.uniprot.org/)[12]數(shù)據(jù)庫中UniProKBt的檢索功能,校正靶基因名稱;通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[13]數(shù)據(jù)庫獲得這些成分的Smiles號、2D Structure,然后將Smiles號導(dǎo)入SwissTargetPrediction(http://www. swisstargetprediction.ch/)[14]數(shù)據(jù)庫,限定研究對象為homo sapiens,以probability>0為卡值進(jìn)行篩選。將2D Structure以SDF格式下載,導(dǎo)入Pharmmapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)[15]數(shù)據(jù)庫中,設(shè)置Norm Fit≥0.9為篩選條件,將篩選的靶點(diǎn)蛋白通過Uniprot數(shù)據(jù)庫中的ID mapping進(jìn)行官方名稱校正;將得到的活性成分導(dǎo)入Stitch(http://stitch.embl.de/)[16]數(shù)據(jù)庫,限定研究對象為homo sapiens,combined score>0.4為篩查標(biāo)準(zhǔn)得到相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)的篩選

以“diabetic peripheral neuropathy”和“rheumatic arthritis”為關(guān)鍵詞,在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(http://www.omim.org/)、基因卡(GeneCards)(https://www.genecards.org/)[17]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,選擇物種為“Homo sapiens”,搜集DPN和RA相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.4 蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

利用STRING平臺數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[18]進(jìn)行共有靶點(diǎn)的蛋白間相互作用關(guān)系,物種設(shè)置為“Homo sapiens”,combined score>0.9,將結(jié)果利用Cytoscape3.7.2軟件中CytoNCA插件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,并進(jìn)行拓?fù)浞治?分析內(nèi)容包括度中心性(degreecentrality,DC)、介度中心性(betweenness centrality,BC)、特征向量中心性(eigenvetor centrality,EC)、接近中心性(closenesscentrality,CC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(network centrality,NC)和局部邊連通性(localaverage connectivity,LAC)等5個指標(biāo)。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析、京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genesand genomes,KEGG)通路富集分析

為進(jìn)一步了解黃芪桂枝五物湯異病同治相關(guān)生物途徑及機(jī)制,采用Hiplot(https://hiplot.com.cn/)數(shù)據(jù)庫,以P<0.05為篩選條件,選擇物種為“org.Hs.eg.db”進(jìn)行黃芪桂枝五物湯治療DPN、RA靶基因的GO和KEGG的信號通路富集分析,得到相應(yīng)的功能分析和信號通路分析數(shù)據(jù),使用在線繪圖網(wǎng)站對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化,得到富集分析條形圖、氣泡圖。

1.6 “藥物—成分—靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)與其相關(guān)的活性成分和KEGG富集得出的生物通路來源Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建出“藥物—成分—靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.7 黃芪桂枝五物湯中有效活性成分與DPN、RA作用靶蛋白的分子對接驗(yàn)證

本文通過Pubchem數(shù)據(jù)庫獲取藥物主要成分的2D結(jié)構(gòu)信息,采用Chem3D軟件中將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為MOL2格式并將其用作配體;同時通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(protein data bank,PDB)[19](https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載受體蛋白的3D結(jié)構(gòu),以PDBQT格式保存。使用Autodock Too1.5.6軟件分別對小分子和靶蛋白進(jìn)行加氫、去水分子及小分子配體處理,借助PyMOL2.3.4軟件插件找到對接活性位點(diǎn),即可在Autodock Vina軟件將處理后的成分及靶蛋白進(jìn)行分子對接,最后通過PyMOL2.3.4軟件將結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 黃芪桂枝五物湯活性成分及篩選的靶點(diǎn)

通過TCMSP、TCM Database@Taiwan及文獻(xiàn)篩選,獲得黃芪桂枝五物湯有效成分122個。其中黃芪29個,白芍29個,桂枝18個,大棗32個,生姜14個,刪重后獲得107個活性成分。

2.2 DPN及RA疾病靶基因收集結(jié)果

通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫搜集DPN、RA相關(guān)疾病靶點(diǎn),去重后獲得DPN疾病靶點(diǎn)共5175個,RA疾病靶點(diǎn)共1155個,將以上兩組疾病靶點(diǎn)與黃芪桂枝五物湯1226個作用靶點(diǎn)進(jìn)行交集,分別獲得交集靶標(biāo)690個、295個,見圖1。

注:韋恩圖為黃芪桂枝五物湯靶基因與DPN、RA疾病靶基因交集情況,重疊部分為交集靶基因的數(shù)目。

2.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

2.3.1 DPN 通過STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI,并通過Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析, 根據(jù)CytoNCA分別構(gòu)建黃芪桂枝五物湯治療DPN與RA的核心基因。 結(jié)果顯示, 黃芪桂枝五物湯治療DPN的交集靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治? 第一次計(jì)算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC的中位數(shù)分別為7、265.1110536、0.007323334、0.066040975、2.3666666665、3.333333333,然后再進(jìn)行第二次計(jì)算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC 的中位數(shù)分別為19、59.49633452、0.049733732、0.495412844、8.24、9.791666667,根據(jù)大于中位數(shù)的篩選標(biāo)準(zhǔn),選出55個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(660條線)。見圖2。

注:A黃芪桂枝五物湯干預(yù)DPN的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,圖中節(jié)點(diǎn)表示共有靶蛋白,節(jié)點(diǎn)度值與顏色的深淺及節(jié)點(diǎn)面積呈正相關(guān);B PPI核心靶蛋白前15個度值條形圖。

2.3.2 RA 黃芪桂枝五物湯治療RA的交集靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?第一次計(jì)算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC的中位數(shù)分別為5、106.3969241、0.015385864、0.110451848、1.625、2.666666667,然后再進(jìn)行第二次計(jì)算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC的中位數(shù)分別為12、25.202572975、0.090339437、0.521428571、6.2916666665、7.39488012,根據(jù)大于中位數(shù)的篩選標(biāo)準(zhǔn),選出26個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(177條線)。見圖3。

注:A 黃芪桂枝五物湯干預(yù)RA的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,圖中節(jié)點(diǎn)表示共有靶蛋白,節(jié)點(diǎn)度值與顏色的深淺及節(jié)點(diǎn)面積呈正相關(guān);B PPI核心靶蛋白前15個度值條形圖。

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

2.4.1 DPN 通過對690個預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG和GO分析,得到黃芪桂枝五物湯治療DPN的主要途徑和生物學(xué)過程(見圖4、5)。結(jié)果顯示,在GO富集分析方面,生物過程(biological process,BP)主要涉及了對脂多糖的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等過程;細(xì)胞組成(cellular component,CC)主要涉及了膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等過程;分子功能(molecular function,MF)主要涉及了蛋白酪氨酸激酶活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等過程。在KEGG通路富集方面,主要涉及了磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol trikinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGEs)-糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of AGEs,RAGE)信號通路等。

圖4 黃芪桂枝五物湯治療DPN的GO富集分析

圖5 黃芪桂枝五物湯治療DPN的KEGG富集分析

2.4.2 RA 通過對295個預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG和GO分析,得到黃芪桂枝五物湯治療RA的主要途徑和生物學(xué)過程(見圖6、7)。結(jié)果顯示,在GO富集分析方面,BP主要涉及了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)等過程;CC主要涉及了膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等過程;MF主要涉及了核受體活性、內(nèi)肽酶活性等過程。在KEGG通路富集方面,主要涉及了腫瘤壞死因子(transforming necrosis factor,TNF)信號通路、Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)信號通路等。

圖6 黃芪桂枝五物湯治療RA的GO富集分析

圖7 黃芪桂枝五物湯治療RA的KEGG富集分析

2.5 “藥物—成分—共有靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物—成分—靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)圖,圖中共有節(jié)點(diǎn)863個,邊9337條,根據(jù)度值及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,黃芪桂枝五物湯中活性成分含量較高的化合物有黃芪甲苷、芍藥苷、肉桂酸、6-姜酚、棗樹皂苷等,在黃芪桂枝五物湯干預(yù)DPN以及RA的過程中起重要作用。見圖8、表1。

注:紅色正方形表示藥物;粉色圓形表示成分;倒立三角形代表靶點(diǎn),淡綠色表示黃芪桂枝五物湯與DPN交集靶點(diǎn),綠色表示黃芪桂枝五物湯與RA交集靶點(diǎn),藍(lán)色表示黃芪桂枝五物湯與兩種疾病共有交集靶點(diǎn);菱形代表通路,紅色表示DPN通路,橘色表示RA通路,黃色表示DPN和RA共有通路;墨綠色正三角形代表DPN和RA兩種疾病。

2.6 分子對接結(jié)果

選取每個藥物中含量較高且度值較高的成分,利用分子對接篩選可能的有效成分,故選取黃芪中的黃芪甲苷(Astragaloside IV)、白芍中的芍藥苷(Paeoniflorin)、桂枝中的肉桂酸(Cinnamic acid)、生姜中的6-姜酚(6-gingerol)、大棗中的棗樹皂苷(Jujubasaponin V)這5個成分作為對接成分,分別對應(yīng)DPN度值排名靠前關(guān)鍵靶蛋白Src非受體酪氨酸激酶(Src non-receptor tyrosine kinas,SRC)、信息轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)及RA的關(guān)鍵靶蛋白相關(guān)因子A(related A,RELA)、JUN(Activator protein-1,AP-1)、STAT3進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。若結(jié)合能<0,表明配體分子均能和受體蛋白能自發(fā)的結(jié)合,結(jié)合能<-4.0 kcal/mol,表明其結(jié)合良好。其中Jujubasaponin V-MAPK3、JUN、RELA以及astragaloside IV-RELA結(jié)合最穩(wěn)定,均≤-9.6 kcal/mol(見表2、3)。就化合物Jujubasaponin V小分子配體與受體MAPK3大分子蛋白質(zhì)的結(jié)合方式而言,SER-110、GLN-372、LYS-224、TYR-24、ARG-41的氨基殘基與Jujubasaponin V小分子配體形成疏水相互作用(如圖9A);對于Jujubasaponin V小分子配體與受體JUN大分子蛋白質(zhì)的結(jié)合方式而言,ASP-464、ARG-541、GLN-166、ASP-163的氨基殘基與Jujubasaponin V小分子配體形成疏水相互作用(如圖9B);圖9C顯示的是Jujubasaponin V小分子配體與受體RELA大分子蛋白質(zhì)的結(jié)合方式,ASP-53、THR-52、ARG-260、GLU-222、GLN-241、ILE-224的氨基殘基與Jujubasaponin V小分子配體形成疏水相互作用;圖9D顯示的是astragaloside IV小分子配體與受體RELA大分子蛋白質(zhì)的結(jié)合方式,ARG-260、ARG-50、LYS-28、GLN-241、LYS-221、ILE-224的氨基殘基與Astragaloside IV小分子配體形成疏水相互作用。

表3 分子對接得分結(jié)果

注:A 綠色為Jujubasaponin V,藍(lán)色為MAPK3氨基酸殘基;B 綠色為Jujubasaponin V,藍(lán)色為JUN氨基酸殘基;C 綠色為Jujubasaponin V,藍(lán)色為RELA氨基酸殘基;D 綠色為Astragaloside IV,藍(lán)色為RELA氨基酸殘基。

3 討論

DPN在中醫(yī)上屬于消渴病的變證,屬于“血痹”范疇,其基本病機(jī)為氣血虧虛,陰陽兩虛,筋脈失養(yǎng),導(dǎo)致寒、麻、肌萎縮[20-21];RA在中醫(yī)上歸屬于“痹證”范疇,機(jī)體肝腎虧損、氣血不足等是其發(fā)病的內(nèi)因,風(fēng)、寒、濕、熱等外邪侵襲是其外因,最終導(dǎo)致氣血痹阻而發(fā)為痹[22]。DPN和RA雖為“異病”,但是兩病都具有病程長且久病多虛多瘀的特點(diǎn),因此兩病的發(fā)病過程中伴有氣虛血瘀證,根據(jù)中醫(yī)理論“證同治亦同”[23], 對于氣虛血瘀證臨床就可以采用補(bǔ)氣活血化瘀的方法。方中黃芪為君,甘溫益氣,補(bǔ)在表之衛(wèi)氣。桂枝散風(fēng)寒而溫經(jīng)通痹,與黃芪配伍,益氣溫陽,和血通經(jīng)。桂枝得黃芪益氣而振奮衛(wèi)陽;黃芪得桂枝固表而不致留邪。芍藥養(yǎng)血和營而通痹,與桂枝合用調(diào)營衛(wèi)而和表里,兩藥為臣。生姜辛溫,疏散風(fēng)邪以助桂枝之力;大棗甘溫,養(yǎng)血益氣以資芪、芍之功;與生姜為伍,又能和營衛(wèi),調(diào)和諸藥,以為佐使,共奏益氣溫經(jīng)、和血通痹的功效。

大量的臨床研究表明,補(bǔ)氣活血方治療RA和糖尿病的臨床療效確切,具有減少西藥副作用、提高療效的作用。郭洪濤等[24]通過數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn),RA和糖尿病雖然是兩種不同的疾病,但都是以高頻率的補(bǔ)氣活血藥物和祛除瘀血來治療。針對這些癥狀,均采用了益氣溫經(jīng)、和血通痹的治療方法,證實(shí)了兩種疾病在其證候特點(diǎn)的相同點(diǎn),也推出了兩者“異病同治”的客觀存在性。李征鋒等[25]通過臨床觀察患者治療前后的血糖、關(guān)節(jié)腫脹和C反應(yīng)蛋白(C-reactionprotein,CRP)水平,證明降糖藥和抗風(fēng)濕藥的聯(lián)合使用可以提高益氣活血方對RA合并糖尿病患者的臨床療效。這也為本文通過黃芪桂枝五物湯的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接研究“異病同治”的機(jī)制提供了理論依據(jù)。

現(xiàn)代藥理研究表明,黃芪桂枝五物湯具有較強(qiáng)的抗炎[26-27]、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)作用等功效[28]。根據(jù)上述分析結(jié)果顯示,黃芪桂枝五物湯中的活性成分黃芪甲苷、芍藥苷、肉桂酸、6-姜酚等活性成分含量較高且有較多的靶點(diǎn)富集,在干預(yù)疾病中有重要的作用。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一,據(jù)報(bào)道,它能有效降低糖尿病大鼠的血糖及血脂水平,改善抗氧化酶生物活性,減少氧化應(yīng)激造成的病理性損傷[29],并且可以使巨噬細(xì)胞從M1樣表型向M2樣表型再極化促進(jìn)骨細(xì)胞存活,減輕關(guān)節(jié)炎癥狀、減少炎性細(xì)胞因子等作用[30];芍藥苷具有抗炎、抗氧化、抗高血糖等多種生物功能[31],它能抑蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號的過度激活從而減輕母胎妊娠糖尿病大鼠血糖和胰島素水平的失調(diào)[32],并且可以減輕氧化應(yīng)激,增加細(xì)胞增殖和遷移,減少凋亡[33]。楊新偉等[34]研究發(fā)現(xiàn),芍藥苷通過激活DPN小鼠的核因子E2-相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件(nuclear factor-E2 related factor2/antioxidant response element,Nrf2/ARE)通路和B細(xì)胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)相關(guān)凋亡通路來減輕氧化應(yīng)激,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。6-姜酚具有強(qiáng)心、保肝利膽、調(diào)血脂、抗血小板凝聚、抗氧化、抗腫瘤等作用[35]。孫立等[36]通過鏈脲佐菌素方法誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型發(fā)現(xiàn),姜酚對糖尿病小鼠腎損傷具有良好的保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與干預(yù)NADPH氧化酶源性活性氧(reactive oxygen species,ROS)信號,發(fā)揮抗氧化作用密切相關(guān)。馬武開等[37]研究發(fā)現(xiàn),姜酚通過下調(diào)模型大鼠血清白介素17(interleukin 17,IL-17)和白介素23(interleukin 23,IL-23)的表達(dá),可以使滑膜增生減輕,炎細(xì)胞浸潤、水腫改善,達(dá)到治療RA的目的。并且6-姜酚、肉桂酸已被證明在各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有抗氧化和抗炎作用,如缺血性腦損傷、奧沙利鉑引起的周圍神經(jīng)病變等[38-40],為DPN、RA的治療提供積極意義。

PPI網(wǎng)絡(luò)顯示了黃芪桂枝五物湯不同靶點(diǎn)之間的相互作用,在這些靶點(diǎn)中,SRC、STAT3、RELA等具有較高度值,可能是治療疾病關(guān)鍵的靶點(diǎn)。同時通過分子對接技術(shù)對篩選得到的活性成分及靶點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示黃芪桂枝五物湯在治療DPN時大棗皂苷與MAPK3靶蛋白結(jié)合活性最好,在治療RA時大棗皂苷與RELA、 AP-1結(jié)合活性最好,提示黃芪桂枝五物湯在干預(yù)DPN、RA均發(fā)揮著重要作用。STAT3的激活可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和免疫反應(yīng)增加,通過抑制其可以改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度,有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞間的平衡[41-42]。并且通過p-KO小鼠相關(guān)研究表明,STAT3調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor,VEGF)是內(nèi)分泌胰腺和胰島微血管網(wǎng)絡(luò)的正常發(fā)育和維持所必需的[43],在調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)、炎癥和自身免疫疾病方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[44]。RELA是核因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)家族一個重要的成員,可精準(zhǔn)調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,在調(diào)節(jié)炎癥、腫瘤、代謝以及免疫應(yīng)答等方面起重要作用[45-46]。由此推測黃芪桂枝五物湯對于DPN、RA的干預(yù)涉及多種靶蛋白,這些可能是黃芪桂枝五物湯對于兩者異病同治的潛在治療靶點(diǎn)。

根據(jù)KEGG通路富集分析結(jié)果,黃芪桂枝五物湯可以通過相同的信號通路和不同的信號通路來治療兩種疾病,它們有一定的相似性和內(nèi)在關(guān)系,但也有不同之處,以便關(guān)注不同的方向,為研究提供新的啟迪。首先,在共性方面,在本文中用黃芪桂枝五物湯治療兩種疾病的過程中發(fā)現(xiàn)AGEs、RAGE信號通路貫穿始終。AGE-RAGE信號通路中AGE的主要受體(RAGE或AGER)屬于免疫球蛋白超家族[47],它激活多個細(xì)胞內(nèi)信號通路,包括NADPH氧化酶、蛋白激酶C和促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)[48],而且可以在各種類型的細(xì)胞和器官中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥[49-50]。黃芪桂枝五物湯可減輕DPN的機(jī)制可能與阻斷AGEs/RAGE/NF-κB信號通路中組織細(xì)胞表面RAGE的表達(dá)、抑制NF-κB激活及其引發(fā)TNF- α觸發(fā)的氧化應(yīng)激和過度炎癥反應(yīng)有關(guān),從而避免細(xì)胞受損和功能紊亂有關(guān)[51]。同時,晚期糖基化終產(chǎn)物受體可激活促炎因子的分泌,導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥,并且和炎癥細(xì)胞因子結(jié)合將進(jìn)一步激活誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo-proteinase,MMP)的NF-κB通路,這些分子有助于軟骨的進(jìn)一步降解,增加一般炎癥[52-53]。因此,我們發(fā)現(xiàn)黃芪桂枝五物湯可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞基本功能、抗炎、調(diào)整免疫、抗氧化、修復(fù)神經(jīng)等作用參與治療DPN、RA。

其次,它們的特征方向不同。在DPN中,細(xì)胞凋亡為DPN發(fā)病的重要機(jī)制,在DPN病程中伴隨施萬細(xì)胞功能紊亂與凋亡、大量周圍神經(jīng)元凋亡等病理特征[54]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[55],線粒體凋亡途徑在促進(jìn)DPN的發(fā)生中有重要作用,如PI3K/Akt、mTOR、JAK激酶/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase /signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)、腺苷酸活化蛋白激酶/過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(adenylate activated protein kinase/peroxlsome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,AMPK/PGC-1α)通路經(jīng)線粒體機(jī)制誘導(dǎo)DPN細(xì)胞凋亡。近年來研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt信號通路參與神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡等過程,另外,作為胰島素信號關(guān)鍵的下游通路,可調(diào)控體內(nèi)的糖代謝,是高血糖胞內(nèi)靶點(diǎn)之一,當(dāng)其表達(dá)異常時促進(jìn)諸多疾病的發(fā)生,與DPN的發(fā)病密切相關(guān)[55-56]。梁俊清等[57]研究發(fā)現(xiàn),在高糖損傷條件下,周絡(luò)通提取物Z-6上調(diào)nNOS蛋白磷酸化水平,抑制促凋亡因子及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteiny laspartate specific 3,Caspase-3)關(guān)鍵蛋白酶的表達(dá),降低Schwann細(xì)胞凋亡率,從而提高糖損傷細(xì)胞的存活率,這些作用與PI3K/Akt通路有關(guān)。并且研究證實(shí),胰島素樣生長因子I可以顯著抑制Caspase-9和Caspase-3前體的剪切活化從而抑制高糖影響下細(xì)胞的凋亡,這主要是通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮其作用的[58]。綜上所述,本文結(jié)果分析顯示,PI3K/Akt信號通路富集了大多數(shù)的靶基因,是黃芪桂枝五物湯治療DPN的主要途徑,黃芪桂枝五物湯通過激活PI3K/Akt通路,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[59]、刺激神經(jīng)細(xì)胞突觸再生[60],從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)作用。

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。其主要病機(jī)為肢體筋脈、關(guān)節(jié)、肌肉、經(jīng)絡(luò)閉塞不通,中醫(yī)治療以祛邪通絡(luò)、養(yǎng)血活血為法。黃芪桂枝五物湯具有益氣溫經(jīng)、和血通痹之效,符合本病的病機(jī),在治療上可取得較好療效。同時許多臨床研究亦報(bào)道黃芪桂枝五物湯治療RA臨床療效可靠[61]。在本文中,發(fā)現(xiàn)黃芪桂枝五物湯的有效成分對應(yīng)的靶點(diǎn)有一系列炎癥相關(guān)因子,如TNF、IL-6、IL-7、IL-2等。KEGG通路分析顯示,TNF信號通路、IL-17信號通路、NOD樣受體(Nod-like receptors,NLRs)信號通路、TLRs信號通路與黃芪桂枝五物湯的炎癥相關(guān)。據(jù)報(bào)道,黃芪桂枝五物湯的有效成分,如黃芪甲苷具有調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)心臟、抗炎和抗腫瘤等作用[62]。同時,研究發(fā)現(xiàn)黃芪桂枝五物湯中總苷、皂苷、總黃酮對患者機(jī)體免疫功能有調(diào)節(jié)作用[63-65]。這說明黃芪桂枝五物湯可以通過減少炎癥因子、調(diào)節(jié)免疫等來達(dá)到治療RA的目的。

細(xì)胞凋亡是RA的發(fā)病機(jī)制之一[66]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,通過抑制信號通路或抑制抗凋亡分子的表達(dá)來誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的凋亡,可能對RA有治療作用[67]。并且有相關(guān)研究表明,促炎細(xì)胞因子TNF-α和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)在RA患者中刺激滑膜細(xì)胞增殖并通過凋亡抑制滑膜細(xì)胞死亡。因此,促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡缺陷可能有助于滑膜細(xì)胞的生長,最終導(dǎo)致RA患者的增生或血管翳形成和關(guān)節(jié)破壞[68]。

TLRs信號通路是I型跨膜蛋白受體,TLRs介導(dǎo)免疫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的TLRs/NF-κB信號通路在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著極其重要的作用[69]。已經(jīng)有很多研究者發(fā)現(xiàn)多種TLRs在RA和實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的滑膜組織、成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synovial cells,FLS)、滑膜組織中的巨噬細(xì)胞和血單核細(xì)胞等細(xì)胞中高表達(dá),同時也發(fā)現(xiàn)了在關(guān)節(jié)局部存在著一些TLRs的內(nèi)源性配體[70]。其中,TLR2和TLR4在RA的發(fā)病中起重要作用。小鼠關(guān)節(jié)炎模型研究表明,早期階段通過活化TLR2,促進(jìn)血管發(fā)生炎癥細(xì)胞黏附與侵襲,活化的TLR4在發(fā)病后期增加金屬蛋白酶介導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成[71]。髓樣分化因子88是存在于所有TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個關(guān)鍵的接頭蛋白,對TLR4和IL-1R信號起負(fù)性調(diào)控作用[72]。根據(jù)本文KEGG結(jié)果顯示,此信號通路在黃芪桂枝五物湯治療RA中起到關(guān)鍵作用。

TNF信號通路是黃芪桂枝五物湯治療RA的主要途徑,主要涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫、腫瘤免疫等方面[73]。據(jù)報(bào)道,黃芪桂枝五物湯通過下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞中的胱天蛋白酶3(Recombinant Caspase 3,CASP3)、TNF、RELA和B細(xì)胞編碼κ輕鏈多肽基因抑制激酶B(inhibitor of kappa light polypeptidegene enhancer in B-cells,kinase beta,IKBKB)蛋白表達(dá),從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能及調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用[74]。據(jù)報(bào)道,過量的TNF-α不僅可以使其信號通路發(fā)生異常,還可以和其他促炎性細(xì)胞因子刺激破骨細(xì)胞分化和活化,而引起骨丟失,刺激滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生降解軟骨的蛋白酶[75],導(dǎo)致RA患者滑膜中免疫細(xì)胞的活化、滯留和生存等,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟骨的破壞[76]。綜上所述,黃芪桂枝五物湯治療RA有效?，F(xiàn)代藥理研究表明,黃芪桂枝五物湯具有良好的抗炎、調(diào)節(jié)免疫活性及抗細(xì)胞凋亡。本文的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究也顯示了黃芪桂枝五物湯對RA炎癥因子和通路的廣泛作用。

總之,黃芪桂枝五物湯通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究,根據(jù)其治療DPN、RA等病的共同機(jī)制,理解“同治異病”的策略,試圖揭示“異病同治”的科學(xué)內(nèi)涵,也說明了黃芪桂枝五物湯可以通過相同的通路及不同的通路治療兩種疾病。兩者有一定共性,并具內(nèi)在聯(lián)系,但也有不同之處,以便側(cè)重方向的不同,為研究提供新的啟示。

在本文中,以黃芪桂枝五物湯的益氣溫經(jīng)、和血通痹作用為例,了解中醫(yī)“同治異病”的策略。黃芪桂枝五物湯對DPN、RA的治療作用主要是通過對AGE-RAGE信號通路整體調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的,但對不同的病變有不同的側(cè)重。DPN的治療主要依靠抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、刺激神經(jīng)細(xì)胞突觸再生,從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)作用。而RA的治療往往依賴TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等炎癥相關(guān)通路的調(diào)控,減少炎癥因子、調(diào)節(jié)免疫。結(jié)果表明,黃芪桂枝五物湯通過多靶點(diǎn)、多途徑的復(fù)雜調(diào)控,達(dá)到了“異病同治”的效果,可為中醫(yī)藥關(guān)于“異病同治”研究提供一定的啟示。但由于目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究仍有局限性,后續(xù)仍需要進(jìn)行體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,以進(jìn)一步確認(rèn)本文預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。