陳秋陽(yáng),梁瑞英,梁 琳,湯新明,秦 彤,丁家波

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

貓冠狀病毒(Feline coronavirus,FCoV)是貓群中最常見(jiàn)感染的病原體之一。FCoVs根據(jù)生物類(lèi)型分為貓腸道冠狀病毒(FECV)和貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV),FECV感染引起輕度或亞臨床消化道癥狀,持續(xù)排毒,導(dǎo)致貓群血清陽(yáng)性率升高。FECV經(jīng)基因突變演化為貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV),引起免疫介導(dǎo)的致命性貓傳染性腹膜炎(FIP)[1-2]。貓傳染性腹膜炎的臨床癥狀多樣,包括濕性腹膜炎,表現(xiàn)為胸膜腔或腹腔滲出性纖維蛋白漿膜炎;干性腹膜炎,在多個(gè)器官中出現(xiàn)彌散性血管周?chē)撃[,使得臨床診斷變得困難。FCoV是一種有囊膜的單股正鏈 RNA病毒,基因組全長(zhǎng)約30 kb,含有11個(gè)已確定的開(kāi)放閱讀框(ORF),與犬冠狀病毒(CCoV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TEGV)同屬于尼多病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒亞科、α-冠狀病毒屬的成員[3]。FCoV分為2種抗原性不同的血清型,Ⅰ型FCoV難以在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng),Ⅱ型FCoV是Ⅰ型FCoV和CCoV重組的結(jié)果。2種FCoV血清型均可引起FIP,但血清學(xué)研究和最近的分子學(xué)研究證實(shí),Ⅰ型FCoV迄今為止在全球貓種群中占主導(dǎo)地位[4]。

目前沒(méi)有可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)FCoV的方法,在幼齡貓發(fā)病的初期,出現(xiàn)輕微的腹瀉癥狀是唯一的表征。在臨床上,由于FIPV引起的癥狀和病理變化多樣,無(wú)法通過(guò)臨床癥狀和病理變化快速準(zhǔn)確地診斷[5]。目前FIP的診斷一般采用臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷相結(jié)合的方法做出綜合判斷[6],需要多種檢測(cè)方法的聯(lián)合[7]。傳統(tǒng)上貓傳染性腹膜炎診斷主要依賴(lài)組織病理學(xué)檢查和免疫組化檢測(cè),目前腹腔積液檢測(cè)和病原基因檢測(cè)是FCoV檢測(cè)的常用方法。常見(jiàn)的診斷流程需要綜合考慮貓的品種、生活史、病史、體格檢查、臨床癥狀、影像學(xué)檢查、血常規(guī)檢查、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫組化、RT-PCR檢測(cè)以及組織病理學(xué)檢查。但是,ELISA相較于TaqMan熒光定量PCR方法具有靈敏度較低、成本高等缺點(diǎn)[8];普通 RT-PCR 具有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度相對(duì)較低的缺點(diǎn);IFA、免疫組化及電鏡等檢測(cè)技術(shù),對(duì)于儀器及人員的要求較高,且無(wú)法滿(mǎn)足大批量的臨床診斷[9]。相較于以上幾種方法,熒光定量PCR不僅具有操作簡(jiǎn)便、成本低的優(yōu)點(diǎn),而且檢測(cè)時(shí)間短,可適用于基層的臨床檢測(cè)。針對(duì)病毒棘突基因(S)和非翻譯區(qū)基因(UTR)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綑z測(cè)方法(RT-PCR)已有報(bào)道,而核衣殼蛋白(N)基因保守,且在感染細(xì)胞中的含量較高,因此是較好的檢測(cè)基因。

FCoV是貓重要的致病性病原,臨床診斷難度大。靈敏可靠的檢測(cè)方法對(duì)該病的防控具有重要意義。本試驗(yàn)建立檢測(cè)FCoV的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法,為該病毒的檢測(cè)提供特異、快速、準(zhǔn)確的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與病料 貓冠狀病毒、貓細(xì)小病毒(FPV)、貓杯狀病毒(FCV)、貓皰疹病毒(FHV)均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物生物安全與公共衛(wèi)生防控科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存;75份樣本來(lái)源于全國(guó)多地寵物醫(yī)院,所有樣本于-80℃條件下保存。

1.1.2 主要試劑 FastPure?Viral DNA/RNA Mini Kit為諾唯贊產(chǎn)品,南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品;Prime Star Max DNA Polymerase,TaKaRa公司產(chǎn)品;通用型DNA膠回收試劑盒、柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒, OMEGA公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒,TIANGEN公司產(chǎn)品;EZ-Blunt Zero pTOPO II Cloning Kit、2×Real Star Fast Probe Mix,北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司產(chǎn)品;DH5α感受態(tài)細(xì)胞和瓊脂糖,北京擎科生物科技有限公司產(chǎn)品;RNase-Free ddH2O ,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;Magpure病毒DNA/RNA純化試劑盒(預(yù)分裝板),杭州比格飛序生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像系統(tǒng),Tanon公司產(chǎn)品;-20℃冰箱,海爾股份有限公司產(chǎn)品;電泳儀、PCR儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品;旋渦震蕩儀,海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠(chǎng)生產(chǎn);細(xì)菌培養(yǎng)箱,上海一恒生物科技有限公司產(chǎn)品;超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),Life Real公司產(chǎn)品;細(xì)菌超凈工作臺(tái),北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開(kāi)發(fā)中心產(chǎn)品;4℃離心機(jī)、液氮罐、二氧化碳培養(yǎng)箱、小型臺(tái)式離心機(jī),生物安全柜、-80℃冰箱,Thermo公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀,西安天隆科技有限公司產(chǎn)品;全自動(dòng)核酸提取純化儀,杭州比格飛序生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 用SNAPGENE軟件對(duì)NCBI上FCoV的N基因序列進(jìn)行比對(duì),選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物及探針,由華大基因科技有限公司合成(表1)。

表1 Taqman熒光定量PCR引物及探針序列

1.2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 按照諾唯贊FastPure?Viral DNA/RNA Mini Kit說(shuō)明書(shū)提取病毒總RNA,參考TIANGEN反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)獲取病毒的cDNA,20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及程序如下:4 μL 5×FastKing-RT Super Mix,16 μL RNA;反轉(zhuǎn)錄程序:42℃ 15 min,95℃ 3 min。cDNA 置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,用FCoV-N-ZL-F和FCoV-N-ZL-R引物進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增片段長(zhǎng)260 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接至EZ-Blunt Zero pTOPO Ⅱ Cloning Kit載體,然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取多個(gè)單菌落分別接入LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)6～8 h。通過(guò)菌液PCR篩選含有陽(yáng)性重組質(zhì)粒的細(xì)菌并進(jìn)行測(cè)序,選擇含有FCoV目的片段基因的菌落進(jìn)行擴(kuò)增,使用柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取的質(zhì)粒即為標(biāo)準(zhǔn)品。用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度,計(jì)算其拷貝數(shù),進(jìn)行10倍梯度稀釋,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

計(jì)算公式:拷貝數(shù)=6.02×1023(copies/mol)×[標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/μL)×10-9]/標(biāo)準(zhǔn)品長(zhǎng)度(bp)×660(Dalton/bp)。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

1.2.3.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù) 2×Real Star Fast Probe Mix試劑說(shuō)明書(shū)推薦的20 μL反應(yīng)體系,分別對(duì)上、下游引物濃度(0.2～1.0 mol/L)、探針濃度(0.2～1.0 mol/L)、退火-延伸溫度(58～62℃) 進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)置陰性對(duì)照組,通過(guò)比較Ct值、熒光強(qiáng)度和擴(kuò)增效率來(lái)選定優(yōu)化結(jié)果。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 以100～10-9倍梯度稀釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸,Ct值為Y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.3.3 特異性試驗(yàn) 利用已經(jīng)建立的FCoV熒光定量PCR方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的FCV、FPV、FHV的核酸進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.3.4 敏感性試驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度連續(xù)稀釋作為模板,分別使用建立的熒光定量PCR方法和普通PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,比較二者的拷貝數(shù)檢測(cè)下限。

1.2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的3個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,并設(shè)置陰性對(duì)照組,每組設(shè)置3個(gè)平行進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),計(jì)算平均值,計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù);以同樣的反應(yīng)條件再分別進(jìn)行3次組間重復(fù)性試驗(yàn),計(jì)算平均值,計(jì)算組間變異系數(shù)。根據(jù)變異系數(shù)判定該方法的組內(nèi)及組間差異。

1.2.3.6 臨床樣品的檢測(cè) 使用全自動(dòng)核酸提取純化儀提取75份臨床樣品核酸,應(yīng)用已建立的FCoV熒光定量PCR方法和已發(fā)表的RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

以FCoV cDNA為模板,用FCoV-N-ZL-F和FCoV-N-ZL-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到與預(yù)期大小相符的片段(圖1)。將膠回收產(chǎn)物連接至EZ-Blunt Zero pTOPO Ⅱ Cloning Kit,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒菌落送測(cè)序鑒定。選擇正確菌落擴(kuò)增,用柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取的質(zhì)粒即為標(biāo)準(zhǔn)品。用分光光度儀測(cè)定重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度,通過(guò)計(jì)算得到拷貝數(shù)1.49×1011copies/μL,作為熒光定量PCR方法構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.目的片段

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)引物、探針濃度和退火溫度的優(yōu)化,以Ct值小、熒光值高為參考標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果表明該熒光定量PCR的最佳上、下游引物濃度為400 nmol/L,最佳探針濃度為200 nmol/L,最佳退火、延伸溫度為60℃。20 μL的熒光定量PCR反應(yīng)體系中含有10 μL 2×RealStar Fast Probe Mix、0.8 μL 上游引物 FCoV-N-F、0.8 μL下游引物 FCoV-N-R、0.4 μL探針 FCoV-N-P、0.4 μL cDNA、7.6 μL RNase free H2O。反應(yīng)程序:95℃ 2 min;95℃ 15 s,60℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

用優(yōu)化得到的方法,以10倍稀釋得到的濃度1.49×1011～1.49×102copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖2)。線(xiàn)性回歸方程為:y=-3.137 4x+41.47,R2=0.998 1,擴(kuò)增效率為108.3%,線(xiàn)性關(guān)系好。

圖2 FCoV的熒光定量PCR測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4 特異性試驗(yàn)

以FCV、FPV、FHV的基因組為模板,以FCoV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照,ddH2O為陰性對(duì)照,用優(yōu)化得到的方法驗(yàn)證其特異性。只有FCoV有特異性擴(kuò)增,其他病原及陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn),表明該方法特異性好(圖3)。

1.FCoV; 2～5.FPV,FCV,FHV,RNase-free H2O作為陰性對(duì)照。

2.5 敏感性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度連續(xù)稀釋后作為模板,分別用建立的FCoV熒光定量PCR方法和普通PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。建立的熒光定量PCR方法的最低檢測(cè)極限約為1.49×100copies/μL,常規(guī) PCR方法的最低檢測(cè)極限約為1.49×105copies/μL(圖4和圖5)。

1～12.1.49×1011～1.49×100copies/μL,13.RNase-free H2O作為陰性對(duì)照

1～12.1.49×1011～1.49×100copies/μL,13.RNase-free H2O作為陰性對(duì)照

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的1.49×107、1.49×106、1.49×105copies/μL 3個(gè)拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板,3個(gè)稀釋度分別設(shè)立3個(gè)重復(fù)孔進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn);同樣的反應(yīng)條件分別進(jìn)行3次組間重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果組內(nèi)和組間試驗(yàn)Ct值的變異系數(shù)均小于3.0%,表明該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好(表2)。

表2 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 臨床樣品檢測(cè)

用本試驗(yàn)優(yōu)化后的反應(yīng)體系及程序?qū)?5份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。普通RT-PCR方法只檢出1份陽(yáng)性病料,陽(yáng)性率為1.33%,而本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法則檢出28份陽(yáng)性病料,陽(yáng)性率為37.33%,說(shuō)明本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法比普通RT-PCR方法敏感性更強(qiáng)(表3)。

表3 熒光定量PCR和RT-PCR臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

3 討論

FCoV在世界各地貓群中流行。FECV傳染性強(qiáng),通過(guò)糞、口傳播,感染大多無(wú)癥狀或僅引起輕度、一過(guò)性腹瀉[10]。貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)無(wú)法通過(guò)糞-口途徑傳播,但在一小部分感染貓中,FIPV由無(wú)毒力的FECV突變產(chǎn)生,然后引起致死性的FIP。近年來(lái),FIP患病率逐年增加,病死率幾乎為100%[11],目前正在繼續(xù)努力尋找FIP的適當(dāng)治療方法,現(xiàn)在比較常見(jiàn)的方法是用抗病毒藥物進(jìn)行抑制[12],但是達(dá)到有效抑制劑量的藥物可能會(huì)有嚴(yán)重的毒副作用[13]。而由于FCoV會(huì)產(chǎn)生抗體依賴(lài)增強(qiáng)作用(ADE),一直以來(lái)對(duì)于FCoV疫苗的研發(fā)始終不順利。因此,有必要開(kāi)發(fā)一種可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)FCoV的方法,以盡早檢出FCoV感染,并及時(shí)治療。

病毒分離培養(yǎng)法是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病原的金標(biāo)準(zhǔn),該方法可以為后期病原特性研究提供重要材料并奠定試驗(yàn)基礎(chǔ),目前常用貓腎細(xì)胞(CRFK)或貓巨噬細(xì)胞(Fcwf-4)培養(yǎng)FCoV。在分離臨床樣本中FCoV時(shí),第1代或者盲傳數(shù)代后,可觀(guān)察到細(xì)胞皺縮、變圓、脫落等細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),但初期CPE不明顯、自然毒株對(duì)細(xì)胞系不適應(yīng)、臨床樣本混合感染都會(huì)造成病毒的分離培養(yǎng)失敗,而且該方法花費(fèi)時(shí)間較久,往往需要1～2周才可完成。而通過(guò)電鏡觀(guān)察,可直接觀(guān)察到表面有冠冕狀突起的病毒粒子,但是做電鏡要求樣本有較多的病毒粒子,該方法雖然直觀(guān)但敏感性不高,通常臨床病料中病毒粒子數(shù)量達(dá)不到電鏡觀(guān)察的要求。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是常用的血清學(xué)診斷方法之一,有研究建立了用組氨酸標(biāo)記的重組刺突蛋白檢測(cè)FCoV抗體的間接ELISA方法[8],但ELISA方法存在重復(fù)性不好,受自身抗體、嗜異性抗體等干擾易出現(xiàn)假陽(yáng)性,干擾因素較多等問(wèn)題。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)也常被用于FCoV診斷和流行病學(xué)調(diào)查[9],很早就被用來(lái)檢測(cè)貓糞便、組織中的FCoV 。不過(guò)RT-PCR比起熒光定量PCR方法敏感性較差。染料法熒光定量PCR方法可以較為高效的診斷FCoV[14-15],但比起探針?lè)晒舛縋CR特異性較差,有人在開(kāi)發(fā)FCoV熒光定量PCR方法并嘗試應(yīng)用于臨床[16]?？焖倏乖庖邔游鰴z測(cè)使用方便、快速,但是準(zhǔn)確性較差[17]。一些新的檢測(cè)方法如重組酶聚合酶擴(kuò)增熒光方法(RT-RPA)[18]和重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(RT-RAA)[19]用于檢測(cè)FCoV。

為了進(jìn)一步提高FCoV檢測(cè)靈敏度和診斷準(zhǔn)確率,本研究選取FCoV N基因保守區(qū)片段進(jìn)行引物與探針設(shè)計(jì),在保證特異性的同時(shí)優(yōu)化反應(yīng)條件,構(gòu)建重組質(zhì)粒,建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法可用于檢測(cè)FCoV,根據(jù)基因序列比對(duì),本研究選擇的FCoV序列與犬冠狀病毒(CCoV) 、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等冠狀病毒序列具有高度一致性,也可用于這些冠狀病毒的檢測(cè)。

本研究建立的方法可對(duì)微量病毒進(jìn)行檢測(cè),對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)下限為1.49×100copies/μL。通過(guò)特異性試驗(yàn),對(duì)貓常見(jiàn)病毒進(jìn)行檢測(cè),證明了該方法具備很強(qiáng)的特異性。本試驗(yàn)通過(guò)重復(fù)性試驗(yàn)和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)得到的變異系數(shù)均小于3.0%,顯示了該方法具有較好的重復(fù)性。

本試驗(yàn)基于FCoV N基因保守區(qū)域成功建立了FCoV的TaqMan熒光定量PCR方法,為FCoV的早期檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)支撐,可實(shí)現(xiàn)在臨床中對(duì)FCoV的全面篩查。