摘要要：【目的】桂花葉斑病嚴(yán)重影響桂花的觀賞價(jià)值，為明確其病原菌，并篩選出可用于防治桂花葉斑病的殺菌劑?！痉椒ā繌母Ｖ菔薪鹕焦珗@采集桂花葉斑病樣品，切片鏡檢，采用組織分離法獲得真菌菌株，通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證所獲菌株是否為桂花葉斑病的致病菌；綜合形態(tài)特征和多基因（ITS、TUB、TEF、 CAL 和 HIS ）序列的系統(tǒng)發(fā)育分析將該菌鑒定到種；在此基礎(chǔ)上，測(cè)定了該菌的生物學(xué)特性，采用含藥平板法測(cè)定了4種殺菌劑對(duì)病原菌的毒力。【結(jié)果】明確了菌株FZ-GH-1是福州桂花葉斑病的病原菌，其被鑒定為Diaporthe grandiflori；FZ-GH-1在12 h光暗交替和全黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)速率最快，生長(zhǎng)最適溫度為24～28℃，最適pH值為5.0，生長(zhǎng)所需最適碳源為葡萄糖，最適氮源為硝酸鈉和蛋白胨；在供試藥劑中，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和450 g/L咪鮮胺水乳劑對(duì)FZ-GH-1菌絲生長(zhǎng)的EC50分別為0.108 mg / L

和0.053 mg/L，明顯低于30%代森錳鋅可濕性粉劑和20%三唑酮乳油?！窘Y(jié)論】確定了福州桂花葉斑病的病原菌為Diaporthe grandiflori，甲基硫菌靈和咪鮮胺對(duì)該菌抑制作用強(qiáng)，研究結(jié)果可為后續(xù)研究桂花葉斑病的發(fā)病規(guī)律和化學(xué)防治提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：桂花葉斑??；間座殼屬；多基因系統(tǒng)發(fā)育分析；生物學(xué)特性；室內(nèi)毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S436.8" " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " "文章編號(hào)：2095-5774（2024）04-0250-10

Identification，Biological Characterization，and Fungicide Screening of Pathogen Causing Leaf Spot Disease of Osmanthus fragrans（Thunb.）Lour.

Liu Xiangguo

（Administrative Office of Jinshan Park in Fuzhou，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350001，China）

Abstract：【Objective】Leaf spot disease of Osmanthus fragrans seriously affects its ornamental value. This study aims to identify its pathogen and screen fungicides for controlling the disease.【Method】Spotted leave samples of

O. fragrans were collected from Jinshan Park in Fuzhou and sample section was examined under a microscope. Fungal strains were obtained by tissue isolation method，and Koch’s postulates were used to confirm the pathogenicity of the obtained strains. The strain was identified to species level though morphological characteristics and phylogenetic analysis of multilocus sequences（ITS，TUB，TEF， CAL and HIS）. On this basis，the biological characteristics of the strain were determined. The toxic effects of four fungicides against pathogen were evaluated in vitro. 【Result]】The strain FZ-GH-1 was clarified as the pathogen of leaf spot disease of O. fragrans，and was identified as Diaporthe grandiflori. The mycelial growth rate of FZ-GH-1 was fastest under 12-hour light/dark alternation and complete darkness conditions，with the optimal growth temperature being 24-28℃，optimal pH 5.0，optimal carbon source being glucose，and optimal nitrogen source being sodium nitrate and peptone. Of the tested fungicides，the EC50 of 70% thiophanate -methyl wettable powder and 450 g/L prochloraz aqueous emulsion on the growth of FZ-GH-1 mycelia was 0.108 mg/L and 0.053 mg/L，respectively，which was significantly lower than that of 30% mancozeb wettable powder and 20% triazolone emulsion. 【Conclusion】This study confirmed D. grandiflori as the pathogen of leaf spot disease of O. fragrans，and thiophanate-methyl and prochloraz had strong inhibition effects on this fungus. The findings of this study provided a theoretical basis for investigating the pathogenesis and chemical control of leaf spot disease of O. fragrans in future research.

Key words：Leaf spot disease of Osmanthus fragrans；Diaporthe grandiflori；Multi-loci phylogenetic analyses；Biological characteristics；Fungicides screening

桂花（Osmanthus fragrans （Thunb.） Loureiro）又名木犀，是木犀科（Oleaceae）木犀屬（Osmanthus）植物，其花為名貴香料，并可作食品香料［1］。桂花原產(chǎn)我國(guó)西南部，在四川、廣東、廣西、云南、湖北等多個(gè)省區(qū)均有分布，國(guó)外也普遍栽種，如印度、尼泊爾、柬埔寨等地，具有很高的經(jīng)濟(jì)、觀賞和藥用價(jià)值［2］。桂花在生長(zhǎng)過(guò)程中容易遭受病害的感染，其中葉斑類病害是桂花常見(jiàn)病害，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致樹(shù)葉枯死，影響桂花的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［3］。該類病害老葉更易感染，多發(fā)生于4-10月份，7-8月份高溫高濕的環(huán)境下易大范圍發(fā)生，在我國(guó)臺(tái)灣、廣西、江西、福建、安徽等多個(gè)省份均有發(fā)生［4-8］。前人曾研究報(bào)道交鏈孢菌（Alternaria sp.）、細(xì)交鏈孢菌 （A. tenuissima （ Fr.） Wiltshi）、葡萄座腔菌（Botryosphaeri dothidea）、木犀生尾孢（Cerospora osmanthicola P.K. Chi et Pai）、Diaporthe fusicola、變?nèi)~木葉點(diǎn)霉（Phyllosticta ghaesembillae Koorders）、木犀生葉點(diǎn)霉（P. osmanthicola Train.）等真菌可引起桂花葉斑病，造成的病害癥狀相似，病原難以明確［9-15］。不同的病原真菌對(duì)殺菌劑的敏感性存在差異，對(duì)于不同真菌引起的桂花葉斑病，應(yīng)篩選相應(yīng)的防治藥劑，采取有針對(duì)性的防治措施和方法。在化學(xué)防治方面，可在發(fā)病初期用波爾多液進(jìn)行預(yù)防，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可施用代森鋅、波爾多液、多菌靈、高錳酸鉀、苯來(lái)特、可殺得和阿米西達(dá)等，但對(duì)于不同的病原真菌而言，防治藥劑會(huì)有所不同［4，16］?；诖?，本文對(duì)福州市金山公園桂花葉斑病的病原菌進(jìn)行了系統(tǒng)地種類鑒定和生物學(xué)特性分析，并測(cè)定了4種常用殺菌劑對(duì)病原菌的抑制作用，旨在明確福州桂花葉斑病的病原，并為制定科學(xué)的病害防治措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病樣

2021年9月，從福州市金山公園采集的具有桂花葉斑病典型癥狀的樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

主要采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）、察氏培養(yǎng)基和燕麥培養(yǎng)基（Oats Agar，OA），依據(jù)方中達(dá)（1998）描述的方法制備［17］。

1.1.3 儀器設(shè)備

離心機(jī)（JIDI-17R，廣州吉迪儀器有限公司）；PCR 儀（ETC821，蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司）；凝膠成像儀（HT8500，北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；鴻基電泳儀（HT-SUB03，北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；生物顯微鏡（UB203i，重慶澳浦光電技術(shù)有限公司）；生化培養(yǎng)箱（TRY-250，寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；植物生長(zhǎng)箱（ZRY-380，寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.1.4 殺菌劑

80%代森錳鋅可濕性粉劑（四川瀾爾科技有限公司）、45%咪鮮胺水乳劑（上海滬聯(lián)生物藥業(yè)（夏邑）股份有限公司）、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（江蘇龍燈化學(xué)有限公司）和20%三唑酮懸浮劑（四川瀾爾科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與病原菌的分離純化

2021年9月在福州市金山公園進(jìn)行病害調(diào)查時(shí)，觀察拍攝桂花葉斑病的田間癥狀，同時(shí)采集具有典型癥狀的葉斑病樣品。

用無(wú)菌水清洗植物病樣表面后擦干，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌剪刀剪取植物病樣病健交界處

5 mm×5 mm的組織塊，依次放入75%酒精、2%次氯酸鈉、75%酒精中消毒30 s、1 min、30 s，后用滅過(guò)菌的ddH2O各漂洗 3次，每次漂洗30 s，再用無(wú)菌濾紙將其表面水分吸干，最后放入事先備好的9 cm的PDA平板上，每皿PDA平板上放4塊組織塊。將PDA平板倒置放入26 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3～4 d 后挑取植物組織塊周圍有明顯特征差異的菌絲塊轉(zhuǎn)移到新的PDA平板中，置于26℃、12 h光暗交替的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)3～4 d后觀察純化后培養(yǎng)的菌落是否為單一純菌落，若為單一純菌落，則表示純化成功；若不是，則需繼續(xù)純化，直到每個(gè)培養(yǎng)皿上的菌落都是單一純菌落。從培養(yǎng)7 d的純化菌株挑取菌絲塊，將其轉(zhuǎn)移至PDA凍存管斜面中，在26 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d后，置于4 ℃冷藏保存。

1.2.2 病原菌的致病性測(cè)定

采用柯赫氏法則驗(yàn)證分離菌株的致病性。將供試菌株置于26 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，用打孔器在菌落邊緣打取直徑0.5 cm菌餅，備用。摘取健康的桂花葉片用清水洗凈后擦干表面；在干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)放入滅過(guò)菌的濾紙并用無(wú)菌水潤(rùn)濕，然后將準(zhǔn)備好的葉片放入培養(yǎng)皿中，用水噴濕葉片表面；用10 μL 槍頭在葉片葉脈左右兩邊上、中、下三個(gè)部位進(jìn)行輕微造傷，將菌餅放于右側(cè)造傷處，左側(cè)放上同樣大小的PDA培養(yǎng)基塊作為空白對(duì)照，每個(gè)葉片3個(gè)重復(fù)；將培養(yǎng)皿蓋好蓋子放于26℃的植物生長(zhǎng)箱中，每日進(jìn)行噴水保濕，培養(yǎng)7 d 后觀察發(fā)病情況。再采用組織分離法分離發(fā)病葉片的病原菌，觀察分離后獲得的真菌菌株的形態(tài)特征是否與最初分離純化得到的形態(tài)特征吻合。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)特征觀察

將供試菌株在26 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)特征，并拍照記錄。在顯微鏡下觀察供試菌株的孢子產(chǎn)生情況，如已產(chǎn)孢，觀察記錄產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)，并進(jìn)行初步鑒定。

1.3.2 多基因序列分析

選擇北京聚合美生物科技有限公司提供的試劑盒，并按照其說(shuō)明進(jìn)行DNA提取。用通用引物ITS1/ITS4對(duì)提取的菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)成功后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgj）中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。根據(jù)序列同源性和形態(tài)特征初步確定病原菌種類。然后在NCBI搜索該種病原菌的ITS、TUB、TEF、CAL、HIS序列，將所獲得的序列作為靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物。各基因?qū)?yīng)的引物名稱及其序列見(jiàn)表1。25 μL PCR反應(yīng)體系包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，相應(yīng)退火溫度（表1）下退火30 s，72℃延伸45 s，ITS 32個(gè)循環(huán)，TUB、TEF、CAL和HIS 35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)成功后，將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至尚亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

檢查測(cè)序結(jié)果，及時(shí)修正，并將5個(gè)基因的序列上傳到NCBI。用Clustalx v.1.83軟件對(duì)單個(gè)基因的序列與靶標(biāo)序列進(jìn)行比對(duì)［18］，再在BioEdit中對(duì)比對(duì)后的序列進(jìn)行人工校正［19］，選擇Diaporthella corylina作為外群種，然后在IQ – TREE中構(gòu)建最大似然樹(shù)（maximum likelihood，ML）［20］，和在MrBayes中構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Bayesian inference，BI）［21］。接著使用PhyloSuite v1.2.1［22］的Concatenate Sequence 選項(xiàng)將5個(gè)基因序列進(jìn)行串聯(lián)，用Partitionfinder2計(jì)算每個(gè)基因的最佳核苷酸替換模型以及相關(guān)參數(shù)，隨后用MrBayes建立多基因的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和IQ-TREE建立多基因的最大似然樹(shù)，最后將所得的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)在Powerpoint中進(jìn)行美化。

1.4" 病原菌生物學(xué)特性研究

1.4.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

將供試菌株26 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，用打孔器在菌落邊緣打取直徑0.5 cm菌餅，將菌餅轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基平板，分別置于24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃ 和32 ℃ 等5個(gè)溫度梯度，12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次［22-24］。

1.4.2 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

將供試菌株26 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，用打孔器在菌落邊緣打取直徑0.5 cm菌餅，將菌餅轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基平板，分別置于持續(xù)黑暗、12 h 光暗交替和持續(xù)光照等3個(gè)光照條件，28 ℃的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4.3 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

將供試菌株26 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，用打孔器在菌落邊緣打取直徑0.5 cm菌餅，分別轉(zhuǎn)接至pH值為5.0、 6.0、7.0、8.0、9.0等5個(gè)pH值梯度的PDA培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 d。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次［22-24］。

1.4.4 碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

將察氏培養(yǎng)基中蔗糖換成相同含量的葡萄糖、乳糖、麥芽糖和可溶性淀粉，并設(shè)置不加任何碳源的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，備用。將其中硝酸鈉換成相同含量的硝酸鉀、蛋白胨、氯化銨、尿素和硫酸銨，并設(shè)置以不加任何氮源的培養(yǎng)基為對(duì)照，備用。將供試菌株在26 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，用打孔器在菌落邊緣打取直徑0.5 cm菌餅，分別轉(zhuǎn)接至上述培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次［22-24］。

1.5 室內(nèi)防治藥劑篩選

將供試殺菌劑用無(wú)菌水配置為有效成分含量為10 000 mg/L的母液，置于65℃恒溫水浴待用；取事先制備的PDA培養(yǎng)基加熱融化；分別將供試殺菌劑稀釋為系列濃度倒入培養(yǎng)基，制成終濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 mg/L的系列含藥培養(yǎng)基并倒板備用。將供試菌株在26 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，用打孔器在菌落邊緣打取直徑0.5 cm菌餅，分別將菌餅轉(zhuǎn)接至含藥PDA培養(yǎng)基平板，置于28 ℃、12 h 光暗交替的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。以無(wú)菌水為對(duì)照。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)6次。利用Excel計(jì)算供試殺菌劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

以供試藥劑各濃度的對(duì)數(shù)值為自變量（X），以菌絲生長(zhǎng)抑制率對(duì)應(yīng)的機(jī)率值為因變量（Y） 建立毒力回歸方程，并計(jì)算各藥劑對(duì)供試菌株的抑制中濃度（EC50） 及相關(guān)系數(shù)（r）。采用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)在不同溫度、pH、光照、碳氮源等培養(yǎng)條件下得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以及 EC50進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

本研究在采集到的桂花葉斑病樣品中分離培養(yǎng)獲得了20個(gè)菌落形態(tài)相似的菌株，通過(guò)菌落形態(tài)觀察和ITS序列比對(duì)初步確定這20個(gè)菌株為同一種菌，且為間座殼屬真菌。后續(xù)的研究均用菌株號(hào)為FZ-GH-1的菌株。

2.1 形態(tài)特征描述

病害癥狀：病害從葉尖開(kāi)始，逐步蔓延至接近葉片中間處。病斑為淡黃褐色至淡褐色，病健交界處為黃褐色，病斑上密生黑色小點(diǎn)（見(jiàn)圖1 A-B）。

培養(yǎng)性狀：FZ-GH-1菌絲生長(zhǎng)較快，在28 ℃、12 h 光暗交替的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后，菌落直徑達(dá)6.5 cm左右。菌落正面初期為灰色，后期變?yōu)榛揖G色，氣生菌絲較多，從菌落中間開(kāi)始產(chǎn)生黑色顆粒狀物，并向四周擴(kuò)散（見(jiàn)圖1 C）；菌落背面初期為灰色，后期中間部分顏色較深，灰黑色至灰綠色，邊緣顏色較淺，多為灰色（見(jiàn)圖1 D）。

顯微特征：在PDA培養(yǎng)基上，較難產(chǎn)生分生孢子，可產(chǎn)生厚垣孢子（見(jiàn)圖1 G）。在OA培養(yǎng)基上，可產(chǎn)生A型和B型兩種類型的分生孢子。A型分生孢子梭形至長(zhǎng)紡錘狀，無(wú)色，內(nèi)含1～2個(gè)油滴，大小為（6.6～10.3）μm×（1.4～2.9）μm，能萌發(fā)（見(jiàn)圖1 E）；B型分生孢子細(xì)長(zhǎng)，鉤狀，大小為（19.7 ～25.6）μm×（0.9～1.5）μm，不能萌發(fā)（見(jiàn)圖1 F）。

Sun等人2021年發(fā)表的新種Diaporthe grandiflori（菌株號(hào)SAUCC194.22）［28］，A型分生孢子的大小為8.3 μm×（2.8～3.3）μm，B型分生孢子的大小為 （21.5～30.5）μm×（1.5～2.1）μm，菌株FZ-GH-1形態(tài)特征和分生孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)與其相似，因此，將菌株FZ-GH-1初步鑒定為Diaporthe grandiflori。

2.2 病原菌的致病性測(cè)定

桂花葉片在接種FZ-GH-1的第7 d 后出現(xiàn)明顯病斑，且有擴(kuò)大趨勢(shì)。病斑內(nèi)部淡褐色，外部棕褐色（見(jiàn)圖2）。對(duì)發(fā)病部位進(jìn)行再分離發(fā)現(xiàn)，獲得的菌株的形態(tài)特征與最初分離得到的菌株的形態(tài)特征一致，說(shuō)明FZ-GH-1是引起桂花葉斑病的病原菌。

2.3病原菌的分子鑒定

對(duì)菌株FZ-GH-1 的ITS、TUB、TEF、CAL 和

HIS基因進(jìn)行測(cè)序，分別獲得909 bp、 659 bp、981 bp、485 bp和416 bp的序列，合并后做系統(tǒng)發(fā)育分析的5個(gè)基因序列（含gap）總長(zhǎng)為3 450 bp。將菌株FZ-GH-1和其他間座殼屬真菌一起構(gòu)建了ITS、TUB、TEF、CAL 和HIS 等5個(gè)基因聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌株FZ-GH-1和Diaporthe grandiflori（菌株號(hào)SAUCC194.22）形成獨(dú)立分支，最大似然支持率為100%，后驗(yàn)概率為0.99（見(jiàn)圖3）。

此發(fā)育樹(shù)以 Diaporthella corylina（CBS 121124） 作為外群種；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上顯示貝葉斯后驗(yàn)概率（PP）≥ 0.80 和最大似然支持 （MLBS）≥ 50%，貝葉斯后驗(yàn)概率低于 0.80 和最大似然支持低于 50% 用 - 表示。本研究獲得的菌株用紅色標(biāo)記；比例尺表示每個(gè)位點(diǎn)的預(yù)期核苷酸替換數(shù)。

2.4 病原菌的生物學(xué)特性

觀察比較菌株FZ-GH-1在不同培養(yǎng)條件下的菌絲生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)供試的幾個(gè)條件均能影響FZ-GH-1的菌絲生長(zhǎng)。

FZ-GH-1在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃ 和32 ℃ 等5個(gè)溫度中均能生長(zhǎng)，但在24～28 ℃ 菌絲生長(zhǎng)快，菌落直徑顯著大于30 ℃和32 ℃的菌落直徑（見(jiàn)圖4A）。

FZ-GH-1對(duì)光照要求不高，在光照條件為12 h

光暗交替和全黑暗情況下菌絲均能快速生長(zhǎng)，菌落直徑差異不顯著，但其菌落直徑顯著大于全光照培養(yǎng)條件下的菌落直徑（見(jiàn)圖4B）。

FZ-GH-1在pH值 5.0～9.0的條件下均能生長(zhǎng)，在pH值為5.0時(shí)生長(zhǎng)速度最快，其菌落直徑與在其他pH值條件下生長(zhǎng)的菌落直徑差異顯著；pH值為6.0和7.0條件下的菌落直徑相似，雖小于pH值為5.0的菌落直徑，但顯著大于pH值為8.0和9.0的菌落直徑（圖4C）。

供試的幾種碳源中，葡萄糖最利于FZ-GH-1的菌絲生長(zhǎng)，其菌落直徑顯著大于其他供試碳源的菌落直徑；其次是麥芽糖和可溶性淀粉；蔗糖、乳糖和不加糖的菌落直徑則顯著較?。▓D4D）。

在選擇的幾種不同氮源中，硝酸鈉和蛋白胨作為氮源時(shí)，F(xiàn)Z-GH-1的菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑顯著大于其他氮源；在氮源為尿素的培養(yǎng)基中，F(xiàn)Z-GH-1的菌絲幾乎不生長(zhǎng)，菌落直徑顯著小于其他供試氮源（圖4E）。

2.5 室內(nèi)防治藥劑篩選

室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定結(jié)果表明，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和450 g/L咪鮮胺水乳劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用強(qiáng)，EC50分別為0.108 mg/L和

0.053 mg/L；30%代森錳鋅可濕性粉劑和20%三唑酮乳油對(duì)菌絲生長(zhǎng)的EC50分別為3.253 mg/L和0.755 mg/L，30%代森錳鋅可濕性粉劑在稀釋倍數(shù)達(dá)到10 000倍時(shí)菌絲已可以較為正常地生長(zhǎng)，但20%三唑酮乳油不同稀釋倍數(shù)對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制作用不明顯（見(jiàn)表2）。

3 結(jié)論與討論

本研究從福州市金山公園內(nèi)采集了有葉斑病典型癥狀的桂花葉片，通過(guò)分離純化，獲得了葉斑病的病原菌FZ-GH-1菌株，結(jié)合形態(tài)特征和5個(gè)基因（ITS、TUB、TEF、CAL和HIS）的系統(tǒng)發(fā)育分析，將FZ-GH-1鑒定為D.grandiflori。間座殼屬（Diaporthe）真菌隸屬于子囊菌門（Ascomycota）盤菌亞門（Pezizomycotina）糞殼綱（Sordariomycetes）間座殼目（Diaporthales）間座殼科（Diaporthaceae），無(wú)性階段為擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）［26］。該屬真菌的分類跟其他真菌類群相同，以前主要以形態(tài)特征為主，現(xiàn)在綜合形態(tài)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析可以更準(zhǔn)確的分類鑒定到種［23，27］。

此外，本研究還系統(tǒng)地研究了溫度、光照、pH值、碳氮源等對(duì)FZ-GH-1的菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FZ-GH-1的適宜生長(zhǎng)溫度為24～28℃，光暗交替培養(yǎng)和全黑暗培養(yǎng)有利于該菌株的菌絲生長(zhǎng)，這與賈鑫宇等的研究結(jié)果類似［28］。FZ-GH-1的最適生長(zhǎng)pH值為 5.0，在pH 8.0的條件下則生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明在酸性環(huán)境下有利于病原菌生長(zhǎng)，可適當(dāng)噴堿性殺菌劑或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來(lái)控制桂花葉斑病。最適碳源為葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉，最適氮源為硝酸鈉和蛋白胨。病原菌FZ-GH-1對(duì)碳氮源的要求不嚴(yán)格，這說(shuō)明D. grandiflori的潛在寄主可能較為廣泛，為防控桂花葉斑病，需要進(jìn)一步明確該病原菌的寄主范圍和侵染來(lái)源。

為了更好地防治該病害，本研究對(duì)FZ-GH-1菌株進(jìn)行室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和450 g/L咪鮮胺水乳劑2種藥劑對(duì)于病菌的抑制效果好。年文楷等研究發(fā)現(xiàn)氟啶胺對(duì)D. amygdali的抑菌活性最高［29］，這說(shuō)明不同種類的間座殼菌對(duì)殺菌劑的敏感性不同。本研究中僅測(cè)定了4類藥劑對(duì)FZ-GH-1的抑制效果，后面仍需進(jìn)行更多種類的殺菌劑篩選，以方便防治桂花葉斑病的過(guò)程中交替用藥，避免產(chǎn)生抗藥性。

總之，本研究證明福州市金山公園桂花葉斑病的病原菌為D. grandiflori，并明確了其基本生物學(xué)特性和2種有效防治藥劑，為該病的防控提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：黃雄峰）