摘要： 甘薯間座殼菌（Diaporthe batatas）是引起甘薯基腐病的病原菌之一，近年來在中國東南沿海發(fā)生較為普遍。由于效應(yīng)因子在致病過程中發(fā)揮著重要作用，本研究采用SignalP 5.0、GPI-SOM、WoLF PSORT、TMHMM-2.0和EffectorP 3.0等生物信息學(xué)軟件，對甘薯間座殼菌效應(yīng)因子進(jìn)行預(yù)測和分析。結(jié)果表明，從D. batatas全基因組編碼的13 864個蛋白質(zhì)中篩選到359個候選效應(yīng)因子，其中248個為質(zhì)外體效應(yīng)因子，68個為胞內(nèi)效應(yīng)因子，43個既可能是質(zhì)外體效應(yīng)因子又可能是胞內(nèi)效應(yīng)因子。在信號肽分析中，所有候選效應(yīng)因子信號肽長度為14～37個氨基酸，在信號肽切割位點-3位到+2位出現(xiàn)頻率最高的氨基酸分別為丙氨酸、絲氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸。利用HMMER、DIAMOND和eCAMI 3個軟件對359個候選效應(yīng)因子進(jìn)行碳水化合物活性酶（CAZyme）類分析，結(jié)果表明，有89個蛋白質(zhì)屬于CAZyme，其中糖苷水解酶類最多。eggNOG-mapper分析結(jié)果顯示，在359個候選效應(yīng)因子中有227個具有功能注釋，主要涉及碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶等生理過程。通過qRT-PCR檢測9個候選效應(yīng)因子基因在D. batatas侵染過程中的相對表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)有7個候選效應(yīng)因子基因在侵染過程中顯著上調(diào)，有2個沒有顯著變化。這些結(jié)果的獲得為明確甘薯間座殼菌效應(yīng)因子的功能，分析甘薯基腐病發(fā)病機理，篩選寄主抗性基因及研發(fā)特異性靶向農(nóng)藥提供了參考。

關(guān)鍵詞： 甘薯間座殼菌；分泌蛋白；效應(yīng)因子；基因功能分析；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

中圖分類號： S531 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）03-0665-09

Genome-wide prediction and analysis of the effector protein of Diaporthe batatas

TANG Wei1， ZHANG Cheng-ling1， MA Ju-kui1， YANG Dong-jing1， CHEN Jing-wei1， GAO Fang-yuan1，XIE Yi-ping1， WANG Fang2， SUN Hou-jun1

（1.Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Sweetpotato of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xuzhou 221131， China;2.Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315100， China）

Abstract： Diaporthe batatas is one of pathogens causing sweet potato foot rot disease， which is common in the southeast coastal areas of China in recent years. As the effectors played an important role in the pathogenesis， SignalP 5.0， GPI-SOM， WoLF PSORT， TMHMM-2.0， EffectorP 3.0 and other bioinformatic softwares were used to predict and analyze the effectors of D. batatas. The results showed that a total of 359 candidate effectors were screened from the 13 864 proteins in the whole genome of D. batatas. Among these effectors， 248 effectors were apoplastic effectors， 68 effectors were cytoplasmic effectors and 43 effectors were dual-localized （apoplastic/cytoplasmic）. The result of signal peptides analysis showed that the lengths of signal peptides were 14-37 amino acids， and the amino acids with the highest frequency at the position -3-+2 of signal peptides cleavage site were alanine， serine， alanine， alanine， proline， respectively. The 89 candidate effectors were predicted and analyzed to be the carbohydrate-active enzyme （CAZyme） through the HMMER， DIAMOND and eCAMI softwares， and most of them belonged to glycoside hydrolase （GH）. A total of 227 candidate effectors were functionally annotated among the 359 candidate effectors using eggNOG-mapper， mainly involving carbohydrate transport and metabolism， posttranslational modification， protein turnover， chaperones and other physiological and biochemical processes. The relative expression levels of nine effectors were tested by qRT-PCR. The results showed that seven of them significantly increased at different infection stages， while two of them showed no significant change. These results provide a reference for clarifying the function of the effector， analyzing the pathogenesis of sweet potato foot rot disease， screening new resistant gene and developing specific targeted pesticides.

Key words： Diaporthe batatas;secreted protein;effector;gene functional analysis;quantitative real-time PCR （qRT-PCR）

甘薯間座殼菌（Diaporthe batatas）屬于子囊殼菌綱（Ascomycota）間座殼目（Diaporthales）間座殼科（Diaporthaceae），其無性態(tài)為擬莖點霉屬（Phomopsis）真菌[1]，是近年來在中國東南沿海薯田新發(fā)甘薯基腐病的病原菌之一[2-3]，也可導(dǎo)致甘薯干腐病、甘薯蔓枯病等[4-5]。甘薯發(fā)病后莖基部產(chǎn)生褐色病斑，然后逐漸擴(kuò)展，莖基部腐爛，導(dǎo)致甘薯莖上部枯萎。甘薯基腐病于1916年在美國首次被發(fā)現(xiàn)[6]。而中國于1998年在臺灣地區(qū)首次報道發(fā)現(xiàn)該病[7]。近年來，D. batatas在中國東南沿海及日本、韓國均有報道[2，8-9]，具有向內(nèi)陸擴(kuò)展的趨勢，嚴(yán)重影響中國東南沿海甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

不同的病原菌采用不同的方式侵染寄主植物，但相同的是病原菌會將效應(yīng)因子傳遞到寄主中，通過抑制植物防御反應(yīng)或改變植物生理機能從而完成病原菌對寄主侵染[10]。從狹義上講，植物病原真菌中的效應(yīng)因子是病原體分泌到寄主植物細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)[11]；從廣義上講則是改變宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能并能夠促進(jìn)病原體定殖的蛋白質(zhì)與小分子[12]。根據(jù)亞細(xì)胞定位，真菌效應(yīng)因子可分為兩大類：一類是在細(xì)胞外空間發(fā)揮作用的質(zhì)外體效應(yīng)子，另一類是在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的胞內(nèi)效應(yīng)子[13]。

盡管由于病原菌的分化和寄主的選擇性，效應(yīng)因子彼此之間不具有明顯的序列相似性，但研究發(fā)現(xiàn)效應(yīng)因子可以通過經(jīng)典的分泌途徑即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-質(zhì)膜途徑侵入寄主。此類效應(yīng)因子具有分泌蛋白的典型特征，即，具有N-端信號肽；不含糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定位點；亞細(xì)胞定位為分泌型；不含有跨膜結(jié)構(gòu)域[14-16]。

隨著越來越多真菌基因組測序的完成以及生物信息學(xué)的飛速發(fā)展［17-18］，利用生物信息學(xué)從病原菌基因組中對其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行分析預(yù)測，篩選出其中的分泌蛋白以及效應(yīng)因子成為尋找病原菌致病基因的一種快速有效的方法，對研究真菌致病機制具有重要的指導(dǎo)意義。近年來，多種病原真菌的效應(yīng)因子已通過生物信息學(xué)的方法被預(yù)測分析，如何艷秋等[19]分析了尖孢鐮刀菌古巴?；?號小種（Foc1）基因組及蛋白質(zhì)，篩選到988個經(jīng)典分泌蛋白及378個候選效應(yīng)因子；范春霞等[20]利用甜瓜粉霉病病原菌粉紅單端孢（Trichothecium roseum）基因組進(jìn)行了效應(yīng)因子的分析和預(yù)測，篩選到154個候選效應(yīng)因子。

甘薯間座殼菌作為甘薯新發(fā)病原，其基因組測序已完成，為預(yù)測效應(yīng)因子提供了數(shù)據(jù)支撐[21]。本研究擬利用SignalP 5.0、GPI-SOM、WoLF PSORT、TMHMM-2.0和EffectorP 3.0等生物信息學(xué)軟件，對D. batatas分泌蛋白的效應(yīng)因子進(jìn)行預(yù)測和分析，并通過qRT-PCR檢測9個候選效應(yīng)因子在病原菌侵染過程中的表達(dá)水平，以期為甘薯間座殼菌侵染機制的研究和效應(yīng)因子的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 D. batatas基因組編碼的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)

D. batatas全基因組編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列從GenBank數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#！/proteins/104620/1662410%￣7￣C￣D￣i￣a￣p￣o￣rthe%20batatas/Un/）下載獲取，共計13 864個蛋白質(zhì)氨基酸序列。

1.2 D. batatas經(jīng)典分泌蛋白中效應(yīng)因子的預(yù)測分析

1.2.1 甘薯間座殼菌全基因組蛋白質(zhì)N-端信號肽的預(yù)測 利用SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0，設(shè)置參數(shù)Organism group，選擇Eukarya）對D. batatas 中13 864個基因組蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行N-端信號肽預(yù)測[22]。篩選得到具有N-端信號肽的蛋白質(zhì)進(jìn)行下一步分析。

1.2.2 GPI錨定位點 對篩選獲得的含有信號肽的蛋白質(zhì)，利用GPI-SOM（http：//gpi.unibe.ch/）進(jìn)行GPI錨定位點的分析[23]，篩除含有GPI錨定位點的蛋白質(zhì)。

1.2.3 亞細(xì)胞定位分析 對含有N-端信號肽，不含有GPI錨定位點的蛋白質(zhì)通過WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/，設(shè)置參數(shù)Organism type，選擇Fungi）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析[24]，篩選出分泌到胞外的蛋白質(zhì)。

1.2.4 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測 對上述篩選到的分泌到胞外的蛋白質(zhì)利用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）進(jìn)行分析[25]，篩選出不含有跨膜結(jié)構(gòu)域或僅有1個跨膜結(jié)構(gòu)域且在信號肽序列中的蛋白質(zhì)。

1.2.5 效應(yīng)因子預(yù)測 對上述篩選出的分泌蛋白利用EffectorP 3.0（http：//effectorp.csiro.au/）進(jìn)行分析，預(yù)測出效應(yīng)因子[26]。利用eggNOG-mapper（http：//eggnog-mapper.embl.de/）對篩選出的效應(yīng)因子進(jìn)行功能分析[27]。

D. batatas候選效應(yīng)因子預(yù)測流程見圖1。

1.2.6 候選效應(yīng)因子信號肽特征分析 通過SignalP 5.0確定候選效應(yīng)因子信號肽位置，統(tǒng)計信號肽長度以及信號肽切割位點氨基酸的出現(xiàn)頻率。

1.2.7 候選效應(yīng)因子碳水化合物活性酶類預(yù)測和功能注釋 利用碳水化合物活性酶類自動注釋服務(wù)器dbCAN2（https：//bcb.unl.edu/dbCAN2/）中的HMMER、DIAMOND和eCAMI 3個軟件對篩選出的甘薯間座殼菌候選效應(yīng)因子中的碳水化合物活性酶（CAZymes）類進(jìn)行預(yù)測和功能注釋[28]。

1.3 D. batatas候選效應(yīng)因子的qRT-PCR分析

1.3.1 樣品接種 將煙薯25的甘薯藤蔓去掉葉片，用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，用滅菌的刀片在莖稈上，切出長度約1 cm 的條形傷口。將D. batatas的分生孢子懸液接種至傷口處，置于25 ℃ 8 h光照16 h黑暗交替的光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。在接種1 d和7 d時分別在接種處進(jìn)行取樣，樣品迅速置于液氮中，并置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計和RNA提取 選取9個候選效應(yīng)因子，依據(jù)其mRNA序列設(shè)計引物（表1）。利用多糖多酚RNA提取試劑盒，提取菌絲和接種樣品的RNA，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 qRT-PCR分析 將提取的RNA利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物全部稀釋5倍后按照采用ABclonal 2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix使用說明進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系為2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 7.5 μl、H2O 5.9 μl、上下游引物各0.3 μl、cDNA 1.0 μl，總計15.0 μl。將反應(yīng)體系置于熒光定量PCR儀中，反應(yīng)程序為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 40個循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法計算基因的相對表達(dá)水平，利用SPSS 25進(jìn)行顯著性水平分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 N-端信號肽分析

利用SignalP 5.0對D. batatas 中13 864個基因組蛋白質(zhì)序列進(jìn)行N-端信號肽預(yù)測，結(jié)果表明，有1 625個蛋白質(zhì)序列含有N-端信號肽序列，占所有蛋白質(zhì)序列的11.72%。

2.2 GPI錨定分析

采用GPI-SOM軟件對含有N-端信號肽的1 625個蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，有298個蛋白質(zhì)序列含有GPI錨定位點，剩余1 327個蛋白質(zhì)不含有GPI錨定位點。

2.3 亞細(xì)胞定位分析

采用WoLF PSORT對上述1 327個蛋白質(zhì)序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明，有1 154個蛋白質(zhì)被預(yù)測分泌至胞外，其余173個蛋白質(zhì)被預(yù)測定位到質(zhì)膜或其他細(xì)胞器中，其中74個蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)膜，28個蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運到過氧化物酶體，28個蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運到線粒體，24個蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)，15個蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核，4個蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

2.4 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

對上述1 154個蛋白質(zhì)序列通過TMHMM-2.0進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有976個蛋白質(zhì)不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，152個蛋白質(zhì)含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，26個蛋白質(zhì)含有2個及以上的跨膜結(jié)構(gòu)域。在152個僅含有1個跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中，有80個蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域與N-端信號肽區(qū)域重疊，所以這些蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域可能為前期所預(yù)測的信號肽區(qū)域。因此，1 056個蛋白質(zhì)（包含976個無跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和80個跨膜結(jié)構(gòu)域與N-端信號肽區(qū)域重疊的蛋白質(zhì)）具有典型分泌蛋白特征，可用于下一步效應(yīng)因子的分析。

2.5 效應(yīng)因子預(yù)測分析

采用EffectorP 3.0對1 056個具有典型分泌蛋白特征的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，有359個蛋白質(zhì)被預(yù)測為效應(yīng)因子，占分泌蛋白總數(shù)的34.00%，其中68個蛋白質(zhì)為胞內(nèi)效應(yīng)因子，占所有候選效應(yīng)因子的18.94%；248個蛋白質(zhì)為質(zhì)外體效應(yīng)因子，占所有候選效應(yīng)因子的69.08%；43個蛋白質(zhì)既可能是質(zhì)外體效應(yīng)因子也可能是胞內(nèi)效應(yīng)因子，占所有候選效應(yīng)因子的11.98%（圖2）。

2.6 效應(yīng)因子信號肽特征分析

對359個候選效應(yīng)因子信號肽長度進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果表明，其信號肽長度最大為37個氨基酸，最小為14個氨基酸。信號肽長度主要集中在16～22個氨基酸的范圍中，其中長度為18個氨基酸的信號肽最多（70個），占候選效應(yīng)因子總數(shù)的19.50%；其次是長度為19個氨基酸的信號肽（68個），占候選效應(yīng)因子總數(shù)的18.94%（圖3）。

對效應(yīng)因子信號肽切割位點-3位到+2位氨基酸種類進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，在-3位，出現(xiàn)了丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸8種氨基酸，其中出現(xiàn)最多的是丙氨酸，占54.32%；在-2位出現(xiàn)了除色氨酸外的所有氨基酸，其中出現(xiàn)最多的是絲氨酸，占17.27%；在-1位出現(xiàn)了丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸8種氨基酸，其中出現(xiàn)最多的是丙氨酸，占80.22%；在+1位出現(xiàn)了除脯氨酸外的所有氨基酸，其中出現(xiàn)最多的是丙氨酸，占24.51%；在+2位所有氨基酸均有出現(xiàn)，其中出現(xiàn)最多的是脯氨酸，占34.26%。由此可見-3位和-1位氨基酸相對保守，其中氨基酸組成為AXA型的占43.73%，可被SpaseI型信號肽酶識別。

2.7 效應(yīng)因子功能預(yù)測

經(jīng)eggNOG-mapper分析，在359個候選效應(yīng)因子中有227個可以注釋到具體功能，其中146個蛋白質(zhì)在COG分類中分屬于A（RNA加工和修飾）、E（氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝）、G（糖類轉(zhuǎn)運和代謝）、M（細(xì)胞壁、質(zhì)膜、包膜生物建成）、O（翻譯后蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和伴侶蛋白）、Q（次生代謝物生物合成、運輸和分解代謝）、S（功能未知）、U（胞內(nèi)運輸、分泌和囊泡運輸） 8類（圖4），其中G類最多，有61個蛋白質(zhì)，包含57個質(zhì)外體效應(yīng)因子，1個胞內(nèi)效應(yīng)因子和3個2類效應(yīng)因子均可的效應(yīng)因子；其次是S類，有59個蛋白質(zhì)，包含49個質(zhì)外體效應(yīng)因子，7個胞內(nèi)效應(yīng)因子和3個2類效應(yīng)因子均可的效應(yīng)因子；O類有20個蛋白質(zhì)，包含16個質(zhì)外體效應(yīng)因子，4個胞內(nèi)效應(yīng)因子；其余類型蛋白質(zhì)中 A類、E類、M類均包含1個為質(zhì)外體效應(yīng)因子，Q類包含2個蛋白質(zhì)，分別是質(zhì)外體效應(yīng)因子和2類效應(yīng)因子均可的效應(yīng)因子，U類僅有1個蛋白質(zhì)，為胞內(nèi)效應(yīng)因子。

利用HMMER、DIAMOND和eCAMI 3個軟件對359個候選效應(yīng)因子進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)有89個蛋白質(zhì)屬于CAZyme類，分屬于糖苷水解酶 （GH）、糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）、多糖裂解酶 （PL）、碳水化合物酯酶 （CE）、輔助活性酶（AA）和碳水化合物結(jié)合模塊 （CBM），占所有候選效應(yīng)因子的24.79%。其中HMMER預(yù)測到85個蛋白質(zhì)，DIAMOND預(yù)測到39個蛋白質(zhì)，eCAMI預(yù)測到70個蛋白質(zhì)，3種軟件均預(yù)測到的蛋白質(zhì)有32個（圖5）。在預(yù)測到的CAZyme類中GH有36個，占40.45%；AA有21個，占23.60%；CE有14個，占15.73%；PL有13個，占14.61%；GT有1個，占1.12%；CBM有4個（表2），占4.49%。在預(yù)測到的36個GH中，包含了GH7、GH11、GH16、GH18、GH28等家族，可以歸到GH-A、GH-B、GH-C、GH-F、GH-K、GH-N 6類（表2）。在不同類型酶類中，AA類中AA9家族最多，有15個，其主要為裂解多糖或纖維素的單氧酶；CE類中CE5家族最多，有5個，其主要是乙酰木聚糖酯酶或角質(zhì)酶；GH類中GH28家族最多，有10個，其存在平行的β螺旋結(jié)構(gòu)，具有多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸水解酶等功能；PL類中PL3-2家族最多，有9個，其功能主要為果膠/果膠酸裂解。

在預(yù)測到的CAZyme類中，AA中有20個是質(zhì)外體效應(yīng)因子，1個既可能是質(zhì)外體效應(yīng)因子又可能是胞內(nèi)效應(yīng)因子；CE和CBM中均為質(zhì)外體效應(yīng)因子；GH中有35個是質(zhì)外體效應(yīng)因子，1個是胞內(nèi)效應(yīng)因子；PL中有10個是質(zhì)外體效應(yīng)因子，3個既可能是質(zhì)外體效應(yīng)因子又可能是胞內(nèi)效應(yīng)因子；GT中僅包含1個胞內(nèi)效應(yīng)因子（圖6）。

2.8 候選效應(yīng)因子qRT-PCR分析

qRT-PCR結(jié)果（圖7）顯示，甘薯間座殼菌侵染甘薯1 d時，候選的質(zhì)外體效應(yīng)因子基因均上調(diào)表達(dá)，其中基因Db8159084表達(dá)水平最高，是侵染0 d時的1.9倍，除基因Db8160770外，其他基因的表達(dá)量與侵染0 d相比均差異顯著（Plt;0.05），而侵染7 d時這些候選質(zhì)外體效應(yīng)因子基因中，除基因Db8160770的表達(dá)量與侵染0 d時基本一致外，其余基因仍上調(diào)表達(dá)但表達(dá)量較侵染1 d時有所下降，且僅有基因Db8168842的表達(dá)量與侵染0 d時相比具有顯著性差異。候選的胞內(nèi)效應(yīng)因子基因中，基因Db8163505在侵染0 d、1 d、7 d時的表達(dá)量無顯著差異，基因Db8160366和Db8168932的表達(dá)量均是在侵染1 d時顯著上調(diào)，侵染7 d時基因表達(dá)量較侵染0 d時差異不大。2個既可能是質(zhì)外體效應(yīng)因子也可能是胞內(nèi)效應(yīng)因子的基因在侵染1 d時和7 d時均顯著上調(diào)表達(dá)，侵染7 d時基因Db8165499的表達(dá)量顯著高于侵染1 d時的表達(dá)量；而侵染7 d時基因Db8168404 的表達(dá)量低于侵染1 d時的表達(dá)量。

3 討論

效應(yīng)因子是植物病原真菌重要的毒力因子，在病原菌侵染寄主過程中發(fā)揮著重要作用，編碼效應(yīng)因子的基因稱為Avr基因，寄主中與之對應(yīng)的抗性基因稱為R基因。對病原真菌效應(yīng)因子的預(yù)測很大程度上依賴于生物信息學(xué)軟件[29]。近年來，病原菌侵染寄主的機制研究不斷深入，隨著病原真菌全基因組序列的不斷測定，以及生物信息學(xué)軟件、數(shù)據(jù)庫的不斷涌現(xiàn)和在線化發(fā)展[30]，使通過生物信息學(xué)研究病原菌并預(yù)測效應(yīng)因子成為分析病原菌侵染機制較為便易的方法，在植物病原菌致病機制探索上進(jìn)行了廣泛應(yīng)用，如董章勇等[31]從茄子枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. melongenae）16 485個蛋白質(zhì)序列中篩選到29個候選致病效應(yīng)因子，Zhao等[32]分析了17 976個小麥葉銹病菌（Puccinia triticina）蛋白質(zhì)，篩選到904個具有保守基序的效應(yīng)因子并鑒定了PTTG_08198基因具有加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程并促進(jìn)活性氧（ROS）積累的作用。

本研究從13 864個甘薯間座殼菌基因組蛋白質(zhì)中預(yù)測到359個效應(yīng)因子，占全基因組蛋白質(zhì)的2.59%，其中質(zhì)外體效應(yīng)因子最多，占預(yù)測到的候選效應(yīng)因子的69.08%。候選效應(yīng)因子信號肽識別位點主要為AXA，屬于SpaseI型，這與范春霞等[18]對甜瓜粉霉病菌（Trichothecium roseum）的研究結(jié)果以及連小雨等[33]對向日葵柄銹菌（Puccinia helianthin Schw）的研究結(jié)果一致。

CAZyme不僅參與真菌自身的生長代謝過程，其中部分酶類還直接參與病原真菌和寄主的互作，如GH、PL和CE等酶類是已知細(xì)胞壁降解酶，參與對細(xì)胞壁組分的降解過程[34]。從CAZyme活性分析來看，有89個具有活性的候選效應(yīng)因子， 其中在AA和GH類型酶類中，最多的分別是AA9和GH28，這2個家族的酶類與細(xì)胞壁降解過程相關(guān)[35 ]，并在侵染豆科植物的尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）[36]和侵染小麥的黑曲霉（Aspergillus niger）中均上調(diào)表達(dá)[37]，一般而言，GH28等果膠降解家族酶類表達(dá)上調(diào)可能在發(fā)病過程中發(fā)揮作用[36]，因此在甘薯間座殼菌中這2類酶也可能在侵染過程中具有重要作用。在效應(yīng)因子類型上看，CAZyme主要為質(zhì)外體效應(yīng)因子，這與部分質(zhì)外體效應(yīng)因子降解細(xì)胞壁功能作用部位相關(guān)，而胞內(nèi)效應(yīng)因子僅有2個，分別參與糖苷水解和糖基轉(zhuǎn)移。

本研究中預(yù)測獲得的效應(yīng)因子以假定蛋白質(zhì)為主，這與范春霞等[20]對甜瓜粉霉菌（T. roseum）效應(yīng)因子的預(yù)測結(jié)果一致。通過eggNOG-mapper有功能注釋的候選效應(yīng)因子有227個，可按照COG分為A、E、G、M、O、Q、S、U 8類，以G類最多。質(zhì)外體效應(yīng)因子主要為G類和S類，胞內(nèi)效應(yīng)因子主要為O類和S類。在S類中部分候選效應(yīng)因子被注釋為與致死或毒素相關(guān)，如誘導(dǎo)壞死蛋白、蓖麻毒素-b鏈凝集素、CRISP家族蛋白質(zhì)等，盡管這類蛋白質(zhì)在甘薯間座殼菌侵染寄主過程中的功能并不清楚，但這為下一步挖掘甘薯間座殼菌致病基因并解析其功能提供了參考。

在侵染過程中，所測的大部分候選效應(yīng)因子基因在侵染過程中上調(diào)表達(dá)，這與在其他病原菌如甜瓜粉霉菌[20]、向日葵柄銹菌[33]中預(yù)測的效應(yīng)因子類似。在不同類型效應(yīng)因子中，候選質(zhì)外體效應(yīng)因子和質(zhì)外體/胞內(nèi)效應(yīng)因子在侵染過程中表達(dá)上調(diào)且表達(dá)水平較高，而胞內(nèi)效應(yīng)因子表達(dá)上調(diào)但表達(dá)水平較低。從時間上看，大部分基因在甘薯間座殼菌侵染1 d時表達(dá)上調(diào)水平較高，7 d時有所下降，說明這些基因在侵染前期發(fā)揮重要的作用。Db8165499基因表達(dá)量隨時間的推移而升高，經(jīng)eggNOG-mapper分析，Db8165499被注釋為多糖裂解酶家族3蛋白，經(jīng)CAZyme分析該蛋白質(zhì)是一種果膠酸裂解酶，可能在侵染過程降解甘薯細(xì)胞壁中發(fā)揮作用。qRT-PCR結(jié)果表明，盡管大部分預(yù)測的效應(yīng)因子在侵染過程中有顯著上調(diào)，但仍有部分預(yù)測的效應(yīng)因子在侵染過程中表達(dá)水平變化不大，一種可能是其在病原菌侵染的其他階段發(fā)揮作用，另一種可能是其并非該病原菌的效應(yīng)因子。

此外，盡管在研究中也發(fā)現(xiàn)通過囊泡或非囊泡運輸?shù)绕渌緩椒置诘男?yīng)因子具有重要作用，如大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）中的VdIsc1蛋白和玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）中的Cts1蛋白均通過非常規(guī)分泌途徑在侵染中發(fā)揮作用[38-39]。然而由于此類效應(yīng)因子的復(fù)雜性和生物信息技術(shù)的局限性，此類效應(yīng)因子目前還未有合適的生物信息學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測分析，因此本研究僅預(yù)測分析了通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-質(zhì)膜經(jīng)典分泌途徑進(jìn)行分泌的效應(yīng)因子。本研究篩選出的候選效應(yīng)因子，為下一步驗證候選效應(yīng)因子的作用，解析甘薯基腐病致病過程，指導(dǎo)甘薯抗病育種和農(nóng)藥靶標(biāo)研發(fā)等方面均奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2022-05-06

基金項目：國家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-10）

作者簡介：唐 偉（1989-），男，山東泰安人，碩士，助理研究員，主要從事甘薯病蟲害防治研究。（E-mail）tangv0001@163.com

通訊作者：孫厚俊，（E-mail）sunhoujun1980@163.com