王巧娟,隋 麗,*,劉建成,汪 越,馬立秋,朱 潤(rùn),郭 剛,*

(1.中國(guó)原子能科學(xué)研究院,北京 102413;2.國(guó)家原子能機(jī)構(gòu)抗輻照應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新中心,北京 102413)

黑色素瘤全稱為惡性黑色素瘤,是一種具有高侵襲性、惡性度高、預(yù)后差和死亡率高等特點(diǎn)的惡性腫瘤,多發(fā)生于皮膚,也會(huì)出現(xiàn)在黏膜和內(nèi)臟。近年來(lái),惡性黑色素瘤的發(fā)生率和死亡率逐步上升,雖然皮膚黑色素瘤僅占皮膚惡性腫瘤的第3位(約占6.8%～20%),但其死亡率卻占皮膚惡性腫瘤的第1位[1-2],2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)中,新增黑色素瘤病例32萬(wàn)以上,新增死亡病例5.7萬(wàn)[3]。此外,2022年《柳葉刀》發(fā)表的首個(gè)針對(duì)我國(guó)兒童和青少年癌癥發(fā)病率的數(shù)據(jù)顯示,青少年中惡性上皮癌和黑色素瘤居第一[4]。

黑色素瘤常用的治療方法有手術(shù)切除、免疫療法、化療和放射治療,但手術(shù)切除會(huì)造成部分功能喪失或出現(xiàn)不良并發(fā)癥,化療和免疫療法有較高的不良反應(yīng)發(fā)生率[5],黑色素瘤對(duì)常規(guī)放療高度抗拒,因此,常規(guī)放療在黑色素瘤的臨床應(yīng)用中受到一定限制。隨著核技術(shù)的飛速發(fā)展,粒子束治療成為治療惡性腫瘤的重要手段之一[6]。質(zhì)子束同時(shí)擁有優(yōu)越的腫瘤物理劑量分布和良好的生物效應(yīng)雙重優(yōu)勢(shì),已成為國(guó)際上治療腫瘤的重要物理療法之一[7-11]。國(guó)際粒子治療協(xié)作委員會(huì)(PTCOG)2022年9月發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示,截至2021年底,全球接受質(zhì)子重離子治療的患者已超過(guò)32萬(wàn)例,其中接受質(zhì)子治療的患者近28萬(wàn)例。因此,質(zhì)子束在治療具有輻射抗性的黑色素瘤中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。已有的臨床數(shù)據(jù)顯示,質(zhì)子治療葡萄膜黑色素瘤(一種眼部黑色素瘤),可以達(dá)到較高的生存率(5年生存率在80%以上)和較好的預(yù)后[12],但這些報(bào)道大多都是回顧性或術(shù)后隨訪研究,對(duì)于質(zhì)子治療黑色素瘤的具體機(jī)理機(jī)制的研究較少。

因此,本研究擬利用北京HI-13串列加速器提供的15 MeV質(zhì)子及標(biāo)準(zhǔn)鈷源提供的γ射線,以人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞為研究對(duì)象,以腫瘤放療中常規(guī)分割(約2 Gy)和大分割(通常為3～5 Gy,甚至?xí)哌_(dá)8 Gy)兩種分割療法中常用的劑量為參考,選擇輻照劑量為1、2、4、8 Gy,以與DNA損傷相關(guān)的細(xì)胞存活、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及γH2AX表達(dá)為生物學(xué)終點(diǎn)指標(biāo),開(kāi)展不同射線對(duì)A375細(xì)胞損傷效應(yīng)研究,以期為質(zhì)子治療黑色素瘤的優(yōu)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 細(xì)胞及其培養(yǎng)

人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞,國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)——協(xié)和細(xì)胞資源中心;胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基,Hyclone公司。

細(xì)胞培養(yǎng):將A375細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃、含5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞增殖至80%～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。輻照實(shí)驗(yàn)前24 h將A375細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi),用于細(xì)胞克隆存活、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn);免疫熒光實(shí)驗(yàn)樣品于照射前24 h接種于蓋玻片上,置于培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 輻照實(shí)驗(yàn)

本研究采用的細(xì)胞克隆、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和γH2AX檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。將A375細(xì)胞樣品隨機(jī)分為對(duì)照組和輻照組,其中,對(duì)照組不進(jìn)行射線誘導(dǎo),輻照組的照射劑量為1、2、4、8 Gy。對(duì)照組和輻照組均設(shè)3個(gè)平行樣品。

圖1 細(xì)胞克隆、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和γH2AX焦點(diǎn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Flow chart of cell cloning, cell cycle, apoptosis and γH2AX focu detection

1) 質(zhì)子輻照

A375細(xì)胞的質(zhì)子輻照實(shí)驗(yàn)在北京HI-13串列加速器上進(jìn)行。加速器引出的15 MeV質(zhì)子經(jīng)異步二維磁鐵擴(kuò)束及均勻化后,從R20支線T4靶室引出,經(jīng)100 μm封真空膜后引入大氣。質(zhì)子束流穿過(guò)用5 μm mylar膜(滅菌)封口的培養(yǎng)皿,到達(dá)細(xì)胞表面后質(zhì)子能量降為13.7 MeV,此時(shí)的質(zhì)子傳能線密度(LET水)為3.6 keV/μm,質(zhì)子束斑面積為5.0 cm×5.0 cm。

輻照前利用五路塑料閃爍體探測(cè)器對(duì)質(zhì)子束流均勻性進(jìn)行測(cè)量,結(jié)果顯示均勻性好于97%。然后利用塑料閃爍體探測(cè)器S1和CsI閃爍體探測(cè)器M在線監(jiān)測(cè)質(zhì)子注量的相對(duì)準(zhǔn)確性,通過(guò)改變質(zhì)子注量率,同時(shí)監(jiān)測(cè)M和S1在束時(shí)60 s內(nèi)的計(jì)數(shù),計(jì)算質(zhì)子注量率,根據(jù)式(1)計(jì)算照射劑量。調(diào)節(jié)質(zhì)子注量率,使照射劑量率為0.8 Gy/min。輻照實(shí)驗(yàn)中以上游的M為監(jiān)督器,監(jiān)測(cè)樣品的受照注量。

(1)

式中:D為吸收劑量,Gy;F為質(zhì)子注量,cm-2;ρ為水的密度,g/cm3。

由于質(zhì)子束流為水平出射,細(xì)胞輻照前先將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基倒掉,然后用PBS潤(rùn)洗。輻照時(shí)將培養(yǎng)皿面向束流進(jìn)行輻照(圖2,箭頭所指為細(xì)胞樣品放置處),輻照完成后立即加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

圖2 HI-13串列加速器的輻射生物效應(yīng)研究平臺(tái)Fig.2 HI-13 tandem accelerator platform for radiation bioeffect research

2) γ射線輻照

A375細(xì)胞的60Co γ射線輻照實(shí)驗(yàn)在國(guó)防科技工業(yè)電離輻射一級(jí)計(jì)量站的γ射線輻照實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,γ射線的LET水為0.3 keV/μm,輻照劑量為1、2、4、8 Gy。

1.3 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)

輻照實(shí)驗(yàn)后,立即收集細(xì)胞,計(jì)數(shù)后以單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)接種于培養(yǎng)皿內(nèi),置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。采用Giemsa對(duì)細(xì)胞染色后,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)大于50 個(gè)的克隆數(shù)。按式(2)計(jì)算克隆形成率:

(2)

其中,PE為對(duì)照組的克隆形成率。

根據(jù)克隆形成率繪制劑量-細(xì)胞存活曲線,利用線性二次方模型進(jìn)行擬合,其表達(dá)式如下:

S=e-(αD+βD2)

(3)

其中:S為細(xì)胞存活率;α為線性效應(yīng);β為平方效應(yīng)。

獲取α、β參數(shù)后可得到不同射線下細(xì)胞的模型方程,采用該方程計(jì)算細(xì)胞經(jīng)兩種射線照射后的存活率,以γ射線為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算質(zhì)子的相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)(RBE)。

1.4 細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞周期測(cè)試:輻照后12、24、48 h,收集對(duì)照組和輻照組細(xì)胞,加入1 mL預(yù)冷的75%酒精,-20 ℃固定過(guò)夜;棄酒精,PBS清洗后收集細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞量,加入50～300 μL PI染液,室溫避光孵育10～15 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

細(xì)胞凋亡測(cè)試:輻照后12、24、48 h,收集對(duì)照組和輻照組細(xì)胞,加入預(yù)先配置好的Binding Buffer溶液,制成終濃度約為1×106mL-1的細(xì)胞懸液;取100 μL細(xì)胞懸液,分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI染液,混勻后,室溫避光孵育15 min;再次加入100 μL稀釋的Binding Buffer,混勻后立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 輻射誘導(dǎo)細(xì)胞γH2AX表達(dá)實(shí)驗(yàn)

以2 Gy的γ射線和質(zhì)子輻照A375細(xì)胞,輻照后0.5、1、2、4、8、24 h收集長(zhǎng)有細(xì)胞的玻片,PBS洗2遍后,用4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定過(guò)夜;用0.3% Triton-100破膜后進(jìn)行PBS清洗,然后使用3%胎牛血清白蛋白(BSA)常溫下封閉1 h;4 ℃孵育抗γH2AX的一抗過(guò)夜;用1%BSA清洗后,使用熒光標(biāo)記的二抗(FITC)室溫避光孵育1 h;利用DAPI對(duì)細(xì)胞樣品染色后,再用10%甘油封片。免疫熒光標(biāo)定后,用激光共聚焦掃描顯微鏡40×物鏡觀察γH2AX焦點(diǎn)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞克隆結(jié)果

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力和對(duì)殺傷因素敏感性的重要方法,本研究首先從細(xì)胞層次研究了不同射線對(duì)A375細(xì)胞的殺傷效果。γ射線和質(zhì)子以0、1、2、4、8 Gy劑量輻照A375細(xì)胞后,形成的典型克隆結(jié)果如圖3所示,劑量-存活曲線如圖4所示。由圖4可看出,在相同射線輻照下,隨著劑量的增加,γ射線和質(zhì)子均能導(dǎo)致細(xì)胞的存活率下降;與γ射線的結(jié)果相比,相同劑量輻照后,質(zhì)子輻照造成的A375細(xì)胞存活率更低,尤其是在4、8 Gy。

圖3 細(xì)胞克隆的典型照片F(xiàn)ig.3 Typical pictures of cell clones

圖4 A375細(xì)胞劑量-存活曲線Fig.4 Dose-survival curve of A375 cell

通過(guò)線性二次方模型S=e-(αD+βD2)擬合,可得A375細(xì)胞在γ射線和質(zhì)子輻照后的細(xì)胞存活曲線方程及相應(yīng)的參數(shù)α、β及二者的比值α/β,以及細(xì)胞10%存活率所對(duì)應(yīng)的輻照劑量(D10),如表1所列。質(zhì)子的α值大于γ射線的,說(shuō)明質(zhì)子的單擊效應(yīng)導(dǎo)致A375細(xì)胞的死亡率高于γ射線;質(zhì)子的α/β值較γ射線高得多,說(shuō)明當(dāng)細(xì)胞受到質(zhì)子照射后,其基因組穩(wěn)定性下降,細(xì)胞修復(fù)能力變差,在1～8 Gy劑量下,與γ射線相比,A375細(xì)胞對(duì)質(zhì)子輻照更敏感。而由存活參數(shù)D10可知,在相同存活率時(shí),所需的質(zhì)子劑量低于γ射線的劑量,這也說(shuō)明質(zhì)子對(duì)A375細(xì)胞的殺傷作用大于γ射線。根據(jù)RBE的定義,以γ射線為參考,A375細(xì)胞10%存活水平下,13.7 MeV質(zhì)子的RBE值為1.52。

表1 γ射線及質(zhì)子輻照后A375細(xì)胞的克隆存活參數(shù)Table 1 Survival parameters of A375 cell after γ-ray and proton irradiation

本研究中,A375細(xì)胞的存活率隨劑量的增加(1～8 Gy)而降低,且相比于γ射線,相同劑量的質(zhì)子輻照后A375細(xì)胞存活率更低,該結(jié)果與已報(bào)道的不同LET的輻射誘導(dǎo)鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F0的劑量存活曲線的趨勢(shì)一致[13]。這可能是由于與低LET輻射相比,高LET的射線可使細(xì)胞DNA產(chǎn)生大比例無(wú)法修復(fù)的雙鏈斷裂和集簇性DNA損傷,使細(xì)胞呈現(xiàn)較低的存活率。質(zhì)子輻照時(shí)的劑量-存活曲線的α和β值更高,表明質(zhì)子的單擊效應(yīng)和損傷累積效應(yīng)更顯著,獲得的RBE10=1.52,較接近重離子的RBE,說(shuō)明質(zhì)子有良好的生物學(xué)效應(yīng)特性。

2.2 細(xì)胞周期結(jié)果

細(xì)胞周期是細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程,是細(xì)胞增殖過(guò)程的控制中心。細(xì)胞周期阻滯是細(xì)胞對(duì)DNA損傷的一種響應(yīng)方式,當(dāng)細(xì)胞受到外界(如輻射)刺激,引起DNA損傷時(shí)會(huì)造成細(xì)胞周期紊亂。本文以細(xì)胞周期為生物學(xué)終點(diǎn)指標(biāo),檢測(cè)不同射線輻照后,A375細(xì)胞的周期進(jìn)程隨照射劑量和照后時(shí)間的變化。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)的周期結(jié)果如圖5所示,對(duì)A375細(xì)胞輻照后12、24、48 h的周期分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果示于圖6,圖5中PE-A為PI染色液在流式細(xì)胞儀中的通道。由圖5～6可知,對(duì)于γ射線,輻照后12 h,1～8 Gy誘導(dǎo)A375細(xì)胞G1期和G2/M期阻滯,其中,1～4 Gy時(shí)的G1期阻滯與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05),在4 Gy時(shí)G1期阻滯最強(qiáng),G1期細(xì)胞由對(duì)照組的22.56%增加至4 Gy時(shí)的42.09%;2～8 Gy時(shí)的G2/M期阻滯與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05),8 Gy時(shí)G2/M期阻滯最強(qiáng),G2/M期細(xì)胞由對(duì)照組的19.58%增加至61.05%。輻照后24 h,與對(duì)照組相比,輻照組由12 h時(shí)的G2/M期阻滯轉(zhuǎn)為明顯的G1期阻滯,且與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05),由對(duì)照組的34.87%增加至8 Gy時(shí)的54.81%。輻照后48 h,與對(duì)照組相比,除8 Gy表現(xiàn)為明顯的G2/M期阻滯外,1～4 Gy輻射造成的細(xì)胞周期阻滯已基本解除。

a～e——質(zhì)子輻照后12 h,輻照劑量為0、1、2、4、8 Gy,f～j——γ射線輻照后12 h,輻照劑量為0、1、2、4、8 Gy圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞周期結(jié)果Fig.5 Diagram of cell cycle result measured by flow cytometry

與對(duì)照組相比,1) P<0.05,2) P<0.01圖6 A375細(xì)胞在照后不同時(shí)間的周期阻滯結(jié)果Fig.6 Cell cycle arrest of A375 cell at different time after irradiation

對(duì)于質(zhì)子輻射,輻照后12 h,輻照組主要表現(xiàn)為G2/M期阻滯,且與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05),照射劑量越大,G2/M期阻滯越嚴(yán)重,G2/M期阻滯程度由對(duì)照組的13.16%增加至8 Gy時(shí)的63.67%。輻照后24 h,輻照引起的G2/M期阻滯有所緩解,但1～8 Gy仍表現(xiàn)為G2/M期阻滯,且與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05);輻照后48 h,2～8 Gy誘導(dǎo)的A375細(xì)胞的G2/M期阻滯尚未完全解除,且與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。

通過(guò)對(duì)比不同射線對(duì)A375周期阻滯的程度可以看出,在輻照后12 h,相同射線條件下,輻照引起的A375細(xì)胞G2/M期阻滯程度隨照射劑量的增加而增加。隨著照后時(shí)間的延長(zhǎng),γ射線造成的細(xì)胞周期阻滯在48 h時(shí)已基本解除,而質(zhì)子輻照造成的細(xì)胞周期阻滯在48 h時(shí),2～8 Gy引起的G2/M期阻滯尚未完全解除,說(shuō)明質(zhì)子誘導(dǎo)的A375細(xì)胞G2/M期阻滯較γ射線強(qiáng)。

本研究中,輻照誘導(dǎo)A375細(xì)胞的周期阻滯程度具有一定的劑量依賴性。γ射線在低劑量誘導(dǎo)G1期阻滯,高劑量誘導(dǎo)G2/M期阻滯,到48 h時(shí)低劑量誘導(dǎo)的周期阻滯已基本解除,8 Gy誘導(dǎo)的G2/M期阻滯有所緩解,但沒(méi)有解除。而質(zhì)子誘導(dǎo)的A375細(xì)胞周期阻滯以G2/M期阻滯為主,到48 h時(shí)除1 Gy誘導(dǎo)的周期阻滯已基本解除外,2～8 Gy誘導(dǎo)的G2/M期阻滯有所緩解,但沒(méi)有解除。說(shuō)明質(zhì)子輻射對(duì)A375細(xì)胞的周期進(jìn)程影響更大,需要更多的時(shí)間來(lái)修復(fù)損傷。細(xì)胞周期阻滯可為DNA損傷修復(fù)提供時(shí)間,有研究認(rèn)為正是由于細(xì)胞周期阻滯這種細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制,使得腫瘤細(xì)胞能逃避射線的殺傷,進(jìn)而影響惡性腫瘤的放療效果[14]。

第三方支付是指具備一定實(shí)力和信譽(yù)保障的獨(dú)立機(jī)構(gòu)，通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)對(duì)接而促成雙方進(jìn)行交易的網(wǎng)絡(luò)支付模式。第三方支付作為獨(dú)立的中間平臺(tái)，它的兩端連接著消費(fèi)者，商戶和國(guó)內(nèi)外的各大商業(yè)銀行，可以提供較為安全，獨(dú)立，有保障的交易服務(wù)。第三方支付已經(jīng)不僅僅是一種簡(jiǎn)單的互聯(lián)網(wǎng)支付，現(xiàn)在運(yùn)用第三方支付進(jìn)行線上線下交易已成為主流。兩種模式，一種運(yùn)營(yíng)模式是完全獨(dú)立于電子商務(wù)網(wǎng)站，僅為用戶提供支付解決方案而不負(fù)擔(dān)保功能；另一種以B2C、C2C電子商務(wù)網(wǎng)站并提供擔(dān)保功能的第三方支付模式。

2.3 細(xì)胞凋亡結(jié)果

射線引起的細(xì)胞增殖死亡與細(xì)胞分裂過(guò)程密切相關(guān),但究其關(guān)鍵,還是靶分子的DNA損傷。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激,誘發(fā)DNA損傷時(shí),會(huì)啟動(dòng)DNA損傷應(yīng)答通路,當(dāng)DNA損傷不能有效修復(fù)時(shí),會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡。本文以細(xì)胞凋亡為生物學(xué)終點(diǎn)指標(biāo),檢測(cè)不同射線輻照后,A375細(xì)胞的凋亡率隨照射劑量和照后時(shí)間的變化。細(xì)胞凋亡率的流式檢測(cè)結(jié)果如圖7所示,其中FITC-A為FITC染液在流式細(xì)胞儀中的通道。對(duì)A375細(xì)胞輻照后12、24、48 h不同劑量誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果如表2、3所列。

表2 γ射線輻照后12、24、48 h A375細(xì)胞凋亡率Table 2 Apoptosis rate of A375 cell induced by γ-ray irradiation after 12, 24 and 48 h

表3 質(zhì)子輻照后12、24、48 h誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡率的結(jié)果Table 3 Apoptosis rate of A375 cells induced by proton irradiation after 12, 24 and 48 h

圖7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Apoptosis detected result

由表2、3可知,A375細(xì)胞輻照后12、24、48 h,在相同射線下,在1～8 Gy范圍內(nèi),細(xì)胞凋亡率隨輻照劑量的增加而增加,具有劑量依賴性,輻照誘導(dǎo)的凋亡率與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),同種射線誘導(dǎo)凋亡比例逐漸增加,γ射線輻照后,48 h相比于24 h有顯著性差異(P<0.05),而質(zhì)子輻射誘導(dǎo)的凋亡,輻照后24 h相比于12 h以及48 h均具有顯著性差異(P<0.05)。不同射線輻照相同劑量時(shí),在輻照后12 h,質(zhì)子輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率與γ射線無(wú)顯著差異;輻照后24 h,在1～8 Gy劑量輻照下,質(zhì)子誘導(dǎo)的A375細(xì)胞凋亡率顯著高于γ射線(P<0.05)。輻照后48 h,輻照劑量為1～2 Gy時(shí),質(zhì)子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與γ射線無(wú)顯著差異,輻照劑量為4～8 Gy時(shí),質(zhì)子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡顯著高于γ射線(P<0.05)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞針對(duì)所處環(huán)境的某種特定因素而產(chǎn)生的一種應(yīng)答,電離輻射也是環(huán)境因素之一。γ射線和質(zhì)子輻射對(duì)A375細(xì)胞凋亡的影響如下:1～8 Gy內(nèi),隨著輻照劑量的增加,細(xì)胞的凋亡率也顯著升高,具有明顯的劑量依賴性;輻照后48 h內(nèi),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡率也逐漸升高,具有較明顯的時(shí)間依賴性。閔鳳玲等[15]比較了等存活劑量的高LET12C6+離子(70 keV/μm,4.2 Gy)和低LET X射線(1.5 keV/μm,7.5 Gy)誘導(dǎo)A375的細(xì)胞凋亡,高LET輻射誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞比例增加,細(xì)胞凋亡高峰出現(xiàn)在輻照后48～72 h,凋亡率最高約為12%。本研究中,4 Gy的13.7 MeV質(zhì)子輻照后48 h,A375細(xì)胞凋亡比例為10.4%,略低于閔鳳玲等的結(jié)果,根據(jù)文獻(xiàn)[15]中A375細(xì)胞凋亡隨時(shí)間的變化趨勢(shì),推測(cè)輻照后72 h,4 Gy質(zhì)子輻照后A375細(xì)胞凋亡比例還會(huì)有所增加。

目前,已有研究表明細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[16]。綜合分析本研究中不同射線對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞的周期和凋亡變化,發(fā)現(xiàn)在照后12 h,2、4、8 Gy組均開(kāi)始出現(xiàn)較明顯的凋亡,并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多,結(jié)合細(xì)胞周期變化發(fā)現(xiàn),輻照后12 h,γ射線在輻照2 Gy后開(kāi)始出現(xiàn)明顯G2/M期阻滯,質(zhì)子在輻照1 Gy后開(kāi)始出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯,這說(shuō)明A375細(xì)胞在周期阻滯啟動(dòng)時(shí),有可能細(xì)胞凋亡也被啟動(dòng)。

2.4 A375細(xì)胞形成的γH2AX焦點(diǎn)數(shù)和大小

在對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂(DSB)的應(yīng)答過(guò)程中,H2AX是最早被磷酸化的底物,是細(xì)胞中感應(yīng)DNA雙鏈損傷最敏感的分子,可作為DNA DSB損傷的標(biāo)志物,并且γH2AX焦點(diǎn)數(shù)與DSB數(shù)基本是1∶1的關(guān)系[17-18],能實(shí)現(xiàn)DSB的準(zhǔn)確定量。為深入研究輻射對(duì)細(xì)胞DNA的損傷情況,以DNA DSB標(biāo)志物——γH2AX為生物學(xué)終點(diǎn)指標(biāo),用免疫熒光檢測(cè)A375細(xì)胞照射后形成的γH2AX焦點(diǎn)數(shù)和大小隨照后時(shí)間和射線的變化,結(jié)果如圖8所示。

圖8 2 Gy輻照下不同時(shí)間點(diǎn)A375細(xì)胞中的γH2AX焦點(diǎn)分布Fig.8 γH2AX foci distribution of A375 cell irradiated by 2 Gy at different time points

從圖8a可見(jiàn),與對(duì)照組細(xì)胞相比,γ射線輻照后0.5 h,細(xì)胞中γH2AX焦點(diǎn)數(shù)明顯增加,隨著時(shí)間的增加,焦點(diǎn)數(shù)呈先增大后減小的變化趨勢(shì),到輻照后24 h,γH2AX表達(dá)水平顯著下降,只有在極少數(shù)細(xì)胞中能觀察到γH2AX焦點(diǎn)。γH2AX焦點(diǎn)在細(xì)胞核中的分布較均勻和分散,在焦點(diǎn)數(shù)很多的細(xì)胞中表現(xiàn)出相同的分布趨勢(shì),體現(xiàn)了γ射線稀疏電離輻射的特點(diǎn)。

從圖8b可見(jiàn),2 Gy質(zhì)子輻照后,隨著時(shí)間的增加,γH2AX的表達(dá)也呈先增加后減小的變化趨勢(shì),與γ射線輻照下的趨勢(shì)相同。但在相同時(shí)刻,質(zhì)子輻射誘導(dǎo)A375細(xì)胞形成的γH2AX焦點(diǎn)的大小、亮度以及分布規(guī)律與γ射線輻照明顯不同,質(zhì)子誘導(dǎo)的γH2AX在細(xì)胞核有些區(qū)域十分集中,形成了尺寸較大的大焦點(diǎn),焦點(diǎn)亮度較大,而且焦點(diǎn)在核內(nèi)局部區(qū)域成簇出現(xiàn),表現(xiàn)出與高LET射線造成的DSB簇?fù)p傷類(lèi)似的情況。

統(tǒng)計(jì)γ射線和質(zhì)子輻照后不同時(shí)間點(diǎn)A375細(xì)胞樣品中的γH2AX焦點(diǎn)和細(xì)胞數(shù),得到2種射線誘導(dǎo)的平均每個(gè)細(xì)胞中γH2AX焦點(diǎn)數(shù)隨時(shí)間的變化,如圖9所示。對(duì)于γ射線,輻照后0.5 h焦點(diǎn)數(shù)增加到1.2,至1 h時(shí)γH2AX表達(dá)達(dá)到峰值,焦點(diǎn)數(shù)增加至7.9,是0.5 h時(shí)的6倍以上,而后迅速減少,4 h時(shí)的焦點(diǎn)數(shù)與0.5 h時(shí)的相當(dāng),到24 h時(shí)焦點(diǎn)數(shù)與對(duì)照組水平一致,僅有0.056個(gè)焦點(diǎn)。質(zhì)子輻照后0.5 h時(shí),焦點(diǎn)數(shù)為3.1,到1 h時(shí)達(dá)到峰值,焦點(diǎn)數(shù)增加至9.6,1～8 h時(shí),焦點(diǎn)數(shù)迅速下降,2 h時(shí)的焦點(diǎn)數(shù)為8.89,較γ射線峰值大,8 h時(shí)的焦點(diǎn)數(shù)為2.5,8～24 h焦點(diǎn)數(shù)減少十分緩慢,24 h時(shí)每個(gè)細(xì)胞中還有1.7個(gè)焦點(diǎn),是γ射線的28倍,表明質(zhì)子誘導(dǎo)的γH2AX表達(dá)持續(xù)的時(shí)間更長(zhǎng)。焦點(diǎn)數(shù)的減少過(guò)程反映了細(xì)胞對(duì)DNA DSB損傷的修復(fù)水平。γH2AX高表達(dá)的持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng),表明細(xì)胞進(jìn)入快速修復(fù)的時(shí)間越滯后,細(xì)胞對(duì)DNA DSB損傷的修復(fù)能力越弱。

圖9 每個(gè)細(xì)胞的焦點(diǎn)數(shù)與照后時(shí)間的關(guān)系Fig.9 Relationship between average number of γH2AX foci per cell and time after irradiation

輻射誘導(dǎo)的γH2AX焦點(diǎn)尺寸也能反映DNA的損傷情況,焦點(diǎn)尺寸越大,說(shuō)明在該區(qū)域形成的損傷越復(fù)雜并難以修復(fù)。圖10為統(tǒng)計(jì)得到2 Gy γ射線和質(zhì)子輻照后不同時(shí)間點(diǎn)(0.5、2、8 h)A375細(xì)胞γH2AX焦點(diǎn)平均尺寸。γ射線輻照后,0.5、2、8 h焦點(diǎn)尺寸均處于0.4～0.7 μm2范圍內(nèi)。質(zhì)子誘導(dǎo)的γH2AX尺寸在2 h時(shí)最大,為2 μm2,0.5 h和8 h時(shí)焦點(diǎn)平均尺寸均為0.8 μm2。相同照后時(shí)間,質(zhì)子輻射形成的γH2AX焦點(diǎn)尺寸較γ射線大,且有顯著性差異(P<0.05),說(shuō)明在照后0.5～8 h,質(zhì)子輻射對(duì)A375細(xì)胞的DNA損傷更嚴(yán)重。

與γ射線相比,1) P<0.05,2) P<0.01圖10 不同LET射線輻照后不同時(shí)間點(diǎn)平均每個(gè)細(xì)胞的焦點(diǎn)尺寸Fig.10 Average focal size of each cell at different time points after irradiation by different rays

DSB損傷形成后,在損傷位點(diǎn)可迅速形成γH2AX焦點(diǎn),在0.5～1 h達(dá)到峰值,然后隨著DSB損傷的修復(fù)而逐漸消退,在24 h內(nèi)迅速下降,并在幾天內(nèi)下降到基線水平(其修復(fù)時(shí)間與輻照劑量有關(guān)),故γH2AX焦點(diǎn)分析可較準(zhǔn)確反映電離輻射誘導(dǎo)的DSB損傷修復(fù),是理想的DSB損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)[19]。董雋等[20]、王依朝等[21]的研究顯示,輻射誘導(dǎo)細(xì)胞DSB損傷后,細(xì)胞γH2AX焦點(diǎn)在1 h內(nèi)迅速達(dá)到峰值并隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少,呈現(xiàn)出動(dòng)力學(xué)變化過(guò)程。本研究以不同射線誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷,照后1 h出現(xiàn)γH2AX焦點(diǎn)峰值,隨時(shí)間的延長(zhǎng),焦點(diǎn)數(shù)逐漸減少,反映了DSB損傷修復(fù)的動(dòng)力學(xué)修復(fù)過(guò)程,且LET較高的質(zhì)子輻射誘導(dǎo)的γH2AX焦點(diǎn)數(shù)及尺寸大于LET值較低的γ射線。本研究利用質(zhì)子誘導(dǎo)的γH2AX焦點(diǎn)尺寸在照后2 h為2 μm2,與前期利用重離子射線(Li和C)誘導(dǎo)的MEF細(xì)胞的γH2AX焦點(diǎn)尺寸[22]類(lèi)似,說(shuō)明質(zhì)子可能誘發(fā)了DNA較復(fù)雜的集簇性損傷,實(shí)際觀察到的γH2AX焦點(diǎn)數(shù)與DSB數(shù)在數(shù)量上不完全是1∶1,這有可能是質(zhì)子誘導(dǎo)的DNA損傷有復(fù)雜集簇性損傷,使得多個(gè)γH2AX焦點(diǎn)聚集,形成了尺寸較大的γH2AX焦點(diǎn)。由此可見(jiàn),本文結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果基本相符,γH2AX焦點(diǎn)分析可較準(zhǔn)確地反映A375細(xì)胞受輻射后,DNA DSB的損傷修復(fù)過(guò)程。

此外,γH2AX不僅參與DNA DSB的識(shí)別與修復(fù),還可與p53相互作用,激活細(xì)胞周期檢查點(diǎn),阻滯細(xì)胞周期[23],使DNA損傷有時(shí)間修復(fù),以此來(lái)保證遺傳信息的正確性;當(dāng)修復(fù)不能完成時(shí),啟動(dòng)凋亡通路,使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡[24]。

此外,近年來(lái),隨著先進(jìn)的高通量測(cè)序技術(shù)出現(xiàn),已有研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)有抑癌或促癌作用,如已在肝細(xì)胞癌、胃癌、肺癌、乳癌等多種癌癥中都異常表達(dá)的lncRNA[2]和miRNA[25]。因此,在今后的研究中,或許可以利用測(cè)序手段篩選出的lncRNA和miRNA,并采用沉默或過(guò)表達(dá)干預(yù)的方法,結(jié)合質(zhì)子輻射,篩選可用于惡性黑色素瘤早期診斷的敏感標(biāo)志物或治療的分子靶點(diǎn),為惡性黑色素瘤治療提供新技術(shù)。

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)探討了輻射誘導(dǎo)A375細(xì)胞DNA損傷時(shí),γH2AX焦點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)變化及其在DSB損傷評(píng)估中的應(yīng)用,以及由DNA損傷引起的細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活,結(jié)果表明,質(zhì)子輻射對(duì)A375細(xì)胞的DNA損傷更嚴(yán)重,A375細(xì)胞的存活率明顯降低、周期阻滯程度更嚴(yán)重、凋亡率也更高,說(shuō)明質(zhì)子輻射可有效殺傷A375細(xì)胞,這表明質(zhì)子束在治療具有輻射抗性的惡性黑素瘤中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

感謝北京HI-13串列加速器運(yùn)行人員在輻照實(shí)驗(yàn)中給予的幫助與支持,感謝國(guó)防科技工業(yè)電離輻射計(jì)量一級(jí)站在60Co γ射線照射實(shí)驗(yàn)中給予的幫助和支持。