顧小敏，余嘉雯，朱天輝，陳有忠，劉 韓，李姝江*

（1.長(zhǎng)江上游森林資源保育與生態(tài)安全國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，成都 611130；2.四川省甘孜州林業(yè)科學(xué)研究所，康定 626001；3.四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司，成都 610100）

撐×綠雜交竹Bambusapervariabilis×Dendrocalamopsisgrandis是以撐篙竹Bambusapervariabilis為母本，大綠竹Bambusagrandis為父本雜交而成的一個(gè)新型竹種[1]，主要分布于華南和西南地區(qū)[2]。該竹種具有易繁殖，適應(yīng)性廣及抗性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以在維護(hù)生態(tài)平衡、防止水土流失、涵養(yǎng)水源等方面發(fā)揮重要作用[1,3]；其稈勁直，尖削度小，壁厚，纖維含量高，為上等用材竹，具有顯著的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]?；∈且环N可由立枯絲核菌Rhizoctoniasolani[5]、腹?fàn)铉牭毒鶩usariumvenfricosum[6]和層出鐮刀菌F.prolifertum等多種病原菌引起的一種病害。F.prolifertum所引起的撐×綠雜交竹基腐病最初從稈基部第一節(jié)侵入，呈黑色至黃褐色條狀或塊狀病斑，并在水平和垂直方向上迅速發(fā)展，嚴(yán)重者可導(dǎo)致整株枯萎[7]。

木霉Trichodermaspp.是世界性分布的一種生存能力極強(qiáng)的益生絲狀真菌，在土壤、植物、植物殘?bào)w和根際普遍存在。研究證明，木霉對(duì)18 個(gè)屬的29 種植物病原菌具有拮抗作用[8]。其具有抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、孢子存活期長(zhǎng)、對(duì)病原菌具有較強(qiáng)的重寄生作用、對(duì)環(huán)境影響小、以及不易使病原菌產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)且控制病害發(fā)生。木霉的生防機(jī)理主要包括競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用[9]、誘導(dǎo)植物抗性等。這些研究都表明了木霉是一種具有較高生防潛力的真菌。前人已成功研發(fā)出多種類別的木霉制劑，其中包含木霉分生孢子的腐殖酸吸附制劑、硅藻酸鈉制劑[10]。木霉制劑也已應(yīng)用到植物病害防治中，如擬康寧木霉T.koningiopsis治療番茄枯萎病[11]、棘孢木霉T.asperellum治療柑橘黑點(diǎn)病[12]等。不同木霉種類對(duì)植物病害防治效果影響顯著，就目前研究來看哈茨木霉T.harzianum、棘孢木霉和綠色木霉T.viride研究個(gè)例較多且防治效果也較高[13,14]。迄今，世界上已有木霉的商品化制劑有250 余種，如美國(guó)的Topshieild（哈茨木霉T-22 菌株）、深綠木霉T.atroviride、擬康寧木霉[15]。研究表明，螺旋木霉可拮抗病原菌數(shù)量超過13 種以上，其中對(duì)小麥紋枯菌、玉米小斑菌、草莓根腐菌、板栗栗疫病等病原菌均具有較好的拮抗效果[16]；可抑制尖孢鐮刀菌F.oxysporum，對(duì)土傳枯萎病也具有一定生防潛力[17]；同時(shí)螺旋木霉對(duì)大豆南方莖潰瘍病菌和大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌也表現(xiàn)出良好的抑菌效果和拮抗作用[18]；螺旋木霉的代謝產(chǎn)物對(duì)3 種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用[19]。雖然螺旋木霉對(duì)上述病原菌均具有抑制作用，但研究?jī)H停留在理論水平，將其做成生防制劑并用于病害防治的還未曾報(bào)道。本研究以在健康雜交竹根際土中篩選到的螺旋木霉作為對(duì)象，通過對(duì)該菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化、載體與助劑篩選，確定了最佳配方的水分散粒劑，為雜交竹基腐病的生物防治提供了可靠保障，同時(shí)也彌補(bǔ)了螺旋木霉用于生防制劑實(shí)例的空白。

1 材料與方法

1.1 材料

供試培養(yǎng)基：PDA（馬鈴薯葡萄瓊脂培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1000 mL；PSA（馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1000 mL；PMA（馬鈴薯麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、麥芽糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1000 mL；Czpeak培養(yǎng)基：硫酸氫二鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1000 mL；Richard 培養(yǎng)基：硝酸鉀10 g、磷酸二氫鉀5 g、七水硫酸鎂2.5 g、氯化鐵0.02 g、蔗糖50 g、瓊脂15-20 g、蒸餾水1000 mL；孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g、瓊脂15～20 g、1/3000 孟加拉紅溶液100 mL、蒸餾水1000 mL、氯霉素0.1 g；燕麥片瓊脂培養(yǎng)基：燕麥片30 g、瓊膠15～20 g、蒸餾水1000 mL；胡蘿卜培瓊脂培養(yǎng)：胡蘿卜20 g、蛋白胨2 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀0.46 g、硫酸鎂0.5 g、磷酸氫二鉀1 g、瓊脂15 g、水1000 mL；番茄瓊脂培養(yǎng)基：番茄浸粉5 g，酵母浸粉5 g，乳糖20 g，葡萄糖2 g，磷酸氫二鉀2 g，吐溫-80 1 g，乙酸鈉5 g，瓊脂15 g。

供試病原菌：層出鐮刀菌，2020 年6 月從四川省仁壽縣撐×綠雜交竹基腐病的病竹中分離所得[7]；病原菌孢子液制備：將層出鐮刀菌菌餅（6 mm）接種至PDB 液體培養(yǎng)基中（5 塊/100 mL），置于28 ℃下160 r/min 培養(yǎng)8 d，用2 層紗布過濾去除菌絲，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)孢子濃度至1×106cfu/mL，4℃下儲(chǔ)存待用。

供試植物：兩年生、高度為50～70 cm，直徑3～5 cm 的撐×綠雜交竹405 株，2022 年8 月購(gòu)置于四川內(nèi)江，種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)溫室大棚內(nèi)，溫度在25 ℃～28 ℃，相對(duì)濕度70%～80%，光照8～12 h。

試劑與儀器：真菌基因組DNA 提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、血球計(jì)數(shù)板（上海市求精生化試劑儀器有限公司）、人工智能氣候箱GZ-380-GSL(韶光廣智科技設(shè)備公司)、振蕩培養(yǎng)箱SPX-100B-D（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、沃隆顆粒機(jī)WL-150（朕閱五金）、凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)VnIversalHooD+2（Bio-RAD 公司，美國(guó)）、水平電泳槽DYCP-31DN（華信科學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器商城）、基因擴(kuò)增儀A600（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）、五硝·多菌靈（江西中訊農(nóng)化有限公司）、甲霜·噁霉靈（河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司）、寡雄腐霉菌（捷克生物制劑股份有限公司）、10 種載體、4 種紫外保護(hù)劑、4 種潤(rùn)濕劑、4 種穩(wěn)定劑、4 種黏結(jié)劑、4 種崩解劑。載體與助劑詳細(xì)信息見表1。

表1 供試載體及助劑信息表Table 1 Test vector and auxiliary information table

1.2 生防真菌的分離、篩選與鑒定

生防真菌分離：2021 年6 月從四川省仁壽縣撐×綠雜交竹基腐病發(fā)生區(qū)附近500 m 的健康植株上利用五點(diǎn)取樣法采集根際土每點(diǎn)5 g[20]，混合均勻，利用平板稀釋法，稱取10 g 土樣加入盛有90 mL 無菌水的三角瓶中，在25 ℃的恒溫?fù)u床上振蕩20 min，使土樣與無菌水充分混勻，得到濃度為10-1的土壤懸浮液。使用移液槍吸取1 mL 的土壤懸浮液，加入盛有9 mL 無菌水的試管中，充分搖勻，得到濃度為10-2的土壤稀釋液。以此類推，獲得濃度依次為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的土壤稀釋液。取不同濃度的稀釋液0.1 mL均勻的涂布在PDA 平板上，每個(gè)濃度梯度進(jìn)行3 次重復(fù)，倒置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)5～8 d，挑選菌落形態(tài)特征有明顯差異的單菌落接于PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化并編號(hào)。

生防真菌的篩選：將活化后的層出鐮刀菌菌餅（6 mm）置于PDA 平板一側(cè)，同時(shí)在右側(cè)3 cm 處接種純化后的待選菌種進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)[21]，每個(gè)菌落處理3 個(gè)重復(fù)。放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d 后運(yùn)用十字交叉法進(jìn)行抑制率的計(jì)算[22]。抑制率（%）=（對(duì)照菌落生長(zhǎng)半徑—處理菌落生長(zhǎng)半徑）/對(duì)照菌落生長(zhǎng)半徑×100。

生防真菌RS05 的鑒定：取新鮮菌體，采用DNA 提取試劑盒提取真菌DNA，采用引物ITS1 和ITS4[23]、EF1-526F 和EF1-1567R[24]、frpb2-5f 和frpb2-7cr[25]進(jìn)行分子檢測(cè)，各序列上傳至NCBI GenBank。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系如表2 所示，取DNA marker 和PCR 反應(yīng)產(chǎn)物各5 μL，依次小心加入點(diǎn)樣孔中，設(shè)置電泳儀電壓為120 V，電泳25 min。電泳結(jié)束后，將凝膠取下置于凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)觀察PCR 產(chǎn)物片段大小并掃描拍攝電泳圖。PCR 產(chǎn)物送往成都擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并登陸NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)分析比較所得各個(gè)基因的同源性，根據(jù)比對(duì)結(jié)果確定建樹用序列集，通過多基因聯(lián)合建樹分析，運(yùn)用MEGA11做同源性分析并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定目標(biāo)真菌的系統(tǒng)進(jìn)化地位。

表2 真菌目的基因序列的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件Table 2 System and condition of PCR amplification of fungal target gene sequence

1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

將活化的生防真菌RS05 接種到PDA 培養(yǎng)基、PSA 培養(yǎng)基、PMA 培養(yǎng)基、Czpeak 培養(yǎng)基、Richard培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基、胡蘿卜培瓊脂培養(yǎng)基、番茄瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～8 d，根據(jù)1.2 計(jì)算抑制率，運(yùn)用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子數(shù)的計(jì)數(shù)確定出最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

將所得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基制作成液體培養(yǎng)基，采用單因素試驗(yàn)，對(duì)接種量、發(fā)酵時(shí)間、pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、光照條件等進(jìn)行不同梯度的測(cè)定，根據(jù)孢子數(shù)和抑制率來確定最佳發(fā)酵條件。各因素梯度如下：（1）接種量：2%、4%、6%、8%、10%、12%和14%；（2）pH：4、5、6、7、8、9 和10；（3）發(fā)酵時(shí)間：2、4、6、8、10 和12 d；（4）溫度：22 ℃、23 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃、27 ℃、28 ℃、29 ℃和30 ℃；（5）搖床轉(zhuǎn)速：80、100、120、140、160、180、200 和220 r/min；（6）光照：全光照、全黑暗、12 h光照12 h 黑暗。

1.5 生防真菌RS05 水分散粒劑的制備及質(zhì)量檢測(cè)

1.5.1 載體的篩選 將紅薯粉、糯米粉、玉米渣、生燕麥片、高嶺土、硅藻土、活性炭、硅膠、凹凸棒土、木屑等分別按5%的濃度加入到最佳液體培養(yǎng)基中，滅菌后接入最適接種量的種子液。將沒有加入載體的最佳培養(yǎng)基設(shè)置為對(duì)照。在28 ℃、180 r/min 的搖床中培養(yǎng)6 d 后抽取發(fā)酵液用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每處理3 個(gè)重復(fù)，根據(jù)孢子數(shù)確定最佳載體。

1.5.2 紫外保護(hù)劑的篩選 將熒光素鈉、抗壞血酸、腐殖酸、糊精以3000 μg/mL（0.3%）加入最佳液體培養(yǎng)基中，滅菌后接入最適接種量的種子液。設(shè)置對(duì)照CK1：經(jīng)紫外不加紫外保護(hù)劑、CK2：不經(jīng)紫外不加紫外保護(hù)劑。CK3：不經(jīng)紫外加紫外保護(hù)劑。放置于28 ℃、180 r/min 搖床，待錐形瓶?jī)?nèi)種子液與液體培養(yǎng)基混勻后取出。置于（38 w，波長(zhǎng)365 nm）的紫外燈下照射2 min 后置于28 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)6 d后取發(fā)酵液用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每處理3 個(gè)重復(fù)。確定了最佳種類后，對(duì)其進(jìn)行濃度梯度篩選，設(shè)置為0.1%、0.3%、0.5%和0.7%，在28 ℃、180 r/min 的搖床中培養(yǎng)6 d 后取發(fā)酵液用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每處理3 個(gè)重復(fù)，根據(jù)孢子數(shù)確定紫外保護(hù)劑最佳濃度。

1.5.3 潤(rùn)濕劑的篩選 將十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、拉開粉BX、吐溫20 以（30000 μg/mL）3%添加量加入最佳液體培養(yǎng)基中，滅菌后接入最適接種量的種子液。于28 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)6 d 后取發(fā)酵液用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每處理3 個(gè)重復(fù)。根據(jù)孢子數(shù)和潤(rùn)濕時(shí)間測(cè)定選出最適宜的潤(rùn)濕劑種類。潤(rùn)濕時(shí)間按GB/T5451-2001[26]執(zhí)行（≤1 min）。確定種類后，對(duì)潤(rùn)濕劑進(jìn)行濃度梯度篩選，設(shè)置為1%、3%、5%、7%，在28 ℃、180 r/min 的搖床中培養(yǎng)6 d 后取發(fā)酵液用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組處理三個(gè)重復(fù)，根據(jù)孢子數(shù)確定潤(rùn)濕劑的最佳濃度。

1.5.4 穩(wěn)定劑的篩選 取碳酸鈣、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、磷酸鈣分別以0.5%加入最佳固體培養(yǎng)基，滅菌后用接種鏟將真菌菌餅（6 mm）接種到上述平板上。每組處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后，根據(jù)孢子數(shù)確定一種最佳穩(wěn)定劑。然后將選出的穩(wěn)定劑以0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的濃度梯度加入最適培養(yǎng)基，再次重復(fù)上述試驗(yàn)。根據(jù)孢子數(shù)確定穩(wěn)定劑的最佳濃度。

1.5.5 黏結(jié)劑的篩選 取可溶性淀粉、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮4 種不同類型的黏結(jié)劑以4%加入最佳固體培養(yǎng)基，篩選方法同穩(wěn)定劑的篩選。濃度梯度為1%、3%、5%、7%，篩選方法同穩(wěn)定劑的篩選。

1.5.6 崩解劑的篩選 將5%尿素、氯化鈉、海藻酸鈉、硫酸鈉將載體、分別與孢子懸浮液（1×1010cfu/mL）、紫外保護(hù)劑、潤(rùn)濕劑、穩(wěn)定劑、黏結(jié)劑混合后制成粒劑。采用刻度量筒試驗(yàn)法測(cè)定其崩解時(shí)間，根據(jù)崩解時(shí)間長(zhǎng)短篩選適合的崩解劑[27]。然后將適宜的唯一崩解劑按1%、3%、5%、7%的濃度梯度進(jìn)行與穩(wěn)定劑、黏結(jié)劑的相同實(shí)驗(yàn)，選出最適宜的崩解劑濃度。

1.5.7 水分散粒劑的制備 將所篩選的潤(rùn)濕劑、紫外保護(hù)劑、穩(wěn)定劑、黏結(jié)劑、崩解劑按照所篩選的最佳濃度與20%孢子液（1.8×1010cfu/mL）混合，載體補(bǔ)足100%，加水稀釋混勻到一定黏度運(yùn)用沃隆顆粒機(jī)WL-150 進(jìn)行擠壓造粒，得到1.5 mm×（2～3 mm）的粒劑。

1.5.8 水分散粒劑質(zhì)量指標(biāo)的檢測(cè) （1）潤(rùn)濕時(shí)間：參考GB/T5451-85[26]，重復(fù)5 次。（2）懸浮率：按照GB/T14825-93[28]，重復(fù)3 次。懸浮率（%）＝上懸液濾質(zhì)千重/（上懸液濾質(zhì)干重＋下懸液濾質(zhì)干重）×100。（3）含孢量：稱取0.01 g 收獲的生防真菌發(fā)酵料分生孢子粉懸于10 mL 0.5%吐溫80 溶液中，磁力攪拌30 min，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子數(shù)，重復(fù)3 次。（4）pH：參考GB/T1601-1993[29]。（5）起泡性：參考GB/T 28137-2011[30]。（6）崩解性：將0.5 g 樣品顆粒倒入含有90 mL 蒸餾水的100 mL 具塞量筒中，塞住筒口，夾住量筒的中部，以8 r/min 的速度繞中心旋轉(zhuǎn)，記下樣品在水中完全崩解的時(shí)間。（7）熱貯穩(wěn)定性：參考GB/T 19136-2003[31]。按照上述相同的方法測(cè)定pH、起泡性、等指標(biāo)。

1.6 盆栽防效試驗(yàn)

在溫度為25 ℃～28 ℃，相對(duì)濕度為70%～80%的溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。將兩年生雜交竹栽至塑料培育盆（40 cm×30 cm×38 cm）。盆栽土壤基質(zhì)經(jīng)甲醛消毒（甲醛50 mL/m2，加水6～12 L，噴灑處理）后按營(yíng)養(yǎng)土：普通土壤：蛭石=6∶2∶1 進(jìn)行混合[32]。共設(shè)置9 個(gè)處理，水分散粒劑分別稀釋至50 倍、100倍、200 倍、500 倍、1000 倍；CK1：化學(xué)可濕性粉劑40%五硝·多菌靈（江西中訊農(nóng)化有限公司）稀釋1000 倍；CK2：化學(xué)水分散粒劑30%甲霜·噁霉靈（河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司）稀釋1000 倍；CK3：生防可濕性粉劑106cfu/g 寡雄腐霉菌（捷克生物制劑股份有限公司）稀釋1000 倍；CK4：無菌水。將撐×綠雜交竹分成3 組，每組每處理5 株（共計(jì)405 株）：（1）先用106cfu/mL 的病原孢子液5 mL/株進(jìn)行灌根[33]處理，15 d 后灌根上述5 種濃度的水分散粒劑和4 種對(duì)照試劑各50 mL/株；（2）先灌根上述5 種濃度的水分散粒劑和4 種對(duì)照試劑各50 mL/株，15 d 后灌根106cfu/mL 的病原孢子液5 mL/株；（3）同時(shí)灌根106cfu/mL 的病原孢子液5 mL/株和上述5 種濃度的水分散粒劑和4 種對(duì)照試劑各50 mL/株。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。30 d 后觀察發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果，病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如表3 所示。發(fā)病率（%）=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100；病情指數(shù)＝Σ（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù)）/（最大病級(jí)數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對(duì)照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

表3 撐×綠雜交竹基腐病病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 B.pervariabilis ×D.grandis base rot disease index

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

抑菌率以及孢子數(shù)量統(tǒng)計(jì)等數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2020 進(jìn)行；應(yīng)用SPSS 19.0 軟件鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析；采用GraphPad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防真菌分離篩選結(jié)果

從土壤中分離得到菌株20 個(gè)，對(duì)峙培養(yǎng)后不同菌株對(duì)層出鐮刀菌的抑制率如表4 所示，其中RS05 菌株對(duì)層出鐮刀菌抑制率最高，達(dá)到52%（圖1A）。顯微觀察拮抗帶如圖1B、C 所示，層出鐮刀菌菌絲被RS05 纏繞，且發(fā)生斷裂。故確定RS05 菌株為生防真菌。

圖1 菌株RS05 對(duì)峙培養(yǎng)及顯微觀察Fig.1 Stand-off culture and microscopic observation of strain RS05

表4 不同菌株對(duì)層出鐮刀菌的抑制率Table 4 Inhibition rate of different strains to F.prolifertum

2.2 生防真菌RS05 的鑒定

菌株RS05 菌落正面白色，反面綠色，氣生菌絲相對(duì)發(fā)達(dá)，5 d 左右中心開始色素堆積，并布滿灰綠色粉末，為產(chǎn)生的大量分生孢子（圖2A）；顯微形態(tài)（圖2B）所示，分生孢子?；看侄痰目捎齻?cè)枝和桶形至安瓶形瓶梗，分生孢子梗具有主軸，寬線狀分枝少（圖2B a）。分生孢子為光滑的長(zhǎng)方形至窄橢圓形，大小為2～5 μm（圖2B b）。綜上，形態(tài)學(xué)初步鑒定為木霉菌。

圖2 螺旋木霉RS05 的形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of Morphology and molecular biology of T.spiralis RS05

PCR 反應(yīng)后，分別得到長(zhǎng)度為620、329 和1137 bp 的DNA 片段（圖2C）。將各序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)（ITS，K605030、TEF1，OK905444、RPB2，OK905445）。通過多基因聯(lián)合建樹分析（圖2D），可以看出RS05 與螺旋木霉T.spiraleTAMA022 以100%的基因核苷酸序列相似性和較高的自展值支持聚為1 個(gè)分支，而與其他木霉菌相距較遠(yuǎn)，表明RS05 與螺旋木霉的親緣關(guān)系最近，并保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.4001。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，將RS05鑒定為螺旋木霉。

2.3 螺旋木霉RS05 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

結(jié)果顯示（表5），確定最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PSA，第3 d 在該培養(yǎng)基上菌落已長(zhǎng)滿，第5 d 孢子數(shù)達(dá)到1.46×1010cfu/mL。

表5 螺旋木霉RS05 在不同培養(yǎng)基上第5 d 的菌落直徑和孢子數(shù)Table 5 Colony diameter and sporulation of T.spiralis RS05 on different medium on the fifth day

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

由（圖3A）可以看出，隨著接種量增加，RS05 抑制率和孢子數(shù)逐漸增加，當(dāng)接種量增長(zhǎng)至8%時(shí)，抑制率和孢子數(shù)達(dá)到峰值，且與更高接種量差異不顯著。pH 6 時(shí)，抑制率和孢子數(shù)均為最高（圖3B）。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，抑制率和孢子數(shù)逐漸增加，從第6 d 開始，抑制率和孢子數(shù)均開始出現(xiàn)增長(zhǎng)緩慢（圖3C）。溫度對(duì)生防真菌抑制率和孢子數(shù)的影響并不顯著，當(dāng)溫度為26 ℃～27 ℃時(shí)相對(duì)最佳（圖3D）。隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，抑制率和孢子數(shù)相應(yīng)增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速在180 r/min 后，繼續(xù)提高，抑制率和孢子數(shù)增長(zhǎng)不明顯（圖3E）。光照對(duì)RS05 菌抑制率和孢子數(shù)的影響較大，隨著光照的增加，二者均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（圖3F）。綜上所述，最優(yōu)發(fā)酵條件為：8%接種量、pH=6、發(fā)酵6 d、轉(zhuǎn)速180 r/min、在26 ℃～27 ℃下全光照培養(yǎng)。

圖3 不同發(fā)酵條件優(yōu)化匯總圖Fig.3 Summary of optimization of different fermentation conditions

2.5 載體和助劑的篩選結(jié)果

圖4A 所示，添加高嶺土、硅藻土、硅膠3 種載體，螺旋木霉RS05 的產(chǎn)孢量均為1010cfu/mL 級(jí)，顯著高于其他載體。且硅膠經(jīng)濟(jì)成本較低，故確定硅膠為水分散粒劑的最佳載體。

圖4 載體與不同助劑對(duì)螺旋木霉RS05 孢子數(shù)的影響Fig.4 Effect of carrier and different auxiliaries on spore count of T.spiralis RS05

紫外保護(hù)劑初篩結(jié)果如圖4B 所示，添加抗壞血酸和糊精RS05 的孢子數(shù)略低于CK2（1.39×1010cfu/mL），熒光素鈉（9.96×108cfu/mL）明顯抑制RS05 的產(chǎn)孢。加入糊精的RS05 孢子數(shù)達(dá)1.29×1010cfu/mL，顯著高于添加抗壞血酸（8.23×109cfu/mL），可以得出4 種紫外保護(hù)劑中糊精最利于RS05 的產(chǎn)孢作用，且可以保護(hù)RS05 在紫外照射之后孢子數(shù)的驟減，故初篩確定紫外保護(hù)劑為糊精。由圖4C 可以看出添加吐溫20RS05 的孢子數(shù)最高，為1.27×1010cfu/mL，初選吐溫20 為最佳潤(rùn)濕劑。圖4D 所示，加入碳酸鈣RS05 的孢子數(shù)最高（1.41×1010cfu/mL），初選碳酸鈣為最佳穩(wěn)定劑。圖4E 所示，加入可溶性淀粉RS05 的孢子數(shù)最高（1.48×1010cfu/mL），初篩確定黏結(jié)劑為可溶性淀粉。四種崩解劑的崩解時(shí)間均滿足行業(yè)標(biāo)注，且圖4F 所示，加入氯化鈉RS05 的孢子數(shù)最高（1.38×1010cfu/mL），故初篩確定氯化鈉為最佳崩解劑。

紫外保護(hù)劑糊精復(fù)篩結(jié)果如圖5A 所示，各濃度梯度差異不大，當(dāng)濃度為0.3%時(shí)RS05 有最大孢子數(shù)（1.42×1010cfu/mL），故確定紫外保護(hù)劑糊精濃度為0.3%。潤(rùn)濕劑吐溫20 各濃度梯度差異不大，當(dāng)吐溫20 濃度為1%和、3%、5%時(shí)各濃度梯度差異不顯著，選取中間3%濃度梯度為潤(rùn)濕劑的最適濃度梯度；隨著穩(wěn)定劑碳酸鈣濃度的增加，RS05 的孢子數(shù)增加，當(dāng)其濃度為0.3%時(shí)，孢子數(shù)相對(duì)達(dá)到最大值（1.48×1010cfu/mL），與其他梯度差異顯著，之后孢子數(shù)逐漸呈下降趨勢(shì)（圖5C），故確定穩(wěn)定劑碳酸鈣的最佳濃度為0.3%。隨著黏結(jié)劑可溶性淀粉濃度的增加，RS05 的孢子數(shù)增加，當(dāng)黏結(jié)劑可溶性淀粉濃度為3%時(shí)，孢子數(shù)相對(duì)達(dá)到最大值（1.51×1010cfu/mL），之后隨著可溶性淀粉含量的增加，孢子數(shù)逐漸下降（圖5D），故確定黏結(jié)劑可溶性淀粉的最佳濃度為3%。隨著崩解劑氯化鈉濃度的增加，RS05 的孢子數(shù)增加，當(dāng)濃度為5%時(shí)，孢子數(shù)相對(duì)達(dá)到最大值（1.38×1010cfu/mL），之后隨著氯化鈉濃度的增加，孢子數(shù)逐漸明顯下降（圖5E），故確定崩解劑氯化鈉的最佳濃度為5%。

圖5 不同助劑濃度梯度篩選試驗(yàn)Fig.5 Concentration gradient screening test of different auxiliaries

2.6 水分散粒劑質(zhì)量檢測(cè)

水分散粒劑制備完成后對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，如表6 所示，質(zhì)量檢測(cè)均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可用于下一步盆栽防效試驗(yàn)。

2.7 盆栽防效試驗(yàn)

如表7 所示，無菌水處理撐×綠雜交竹基腐病發(fā)病率在62.3%左右，經(jīng)過藥劑處理發(fā)病率顯著降低，其中五硝·多菌靈和甲霜·噁霉靈效果最好，發(fā)病率降低至7%和9%左右，市售生防可濕性粉劑寡雄腐霉菌為42.3%。從制劑濃度看，螺旋木霉RS05 水分散粒劑稀釋倍數(shù)為200 倍以下時(shí)發(fā)病率最高不超過27%，防治效果在89%～94%之間，該制劑濃度防治效果略高于化學(xué)制劑，顯著高于同類生防制劑；500 倍液防效（74%）也高于生防制劑。從不同處理組看，先接種病原（第1 組）和先接種水分散粒劑和對(duì)照試劑（第3 組）病情指數(shù)低、防效好，差異不顯著，說明螺旋木霉RS05 水分散粒劑既可有效治療撐×綠雜交竹基腐病也可預(yù)防該病。綜上所述，在生產(chǎn)應(yīng)用中可以用該制劑200-500 倍液直接灌根達(dá)到保護(hù)雜交竹的目的，也可以在雜交竹產(chǎn)生基腐病時(shí)施用100～200 倍液防治基腐病進(jìn)一步蔓延。

表7 盆栽試驗(yàn)發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果匯總表Table 7 Summary table of pot experiment incidence, disease index and control effect

3 討論

撐×綠雜交竹基腐病是一種新型土傳病害，現(xiàn)目前對(duì)于此類病害的防治以化學(xué)措施為主，隨著人們對(duì)綠色生活的要求，化學(xué)農(nóng)藥的危害也更受重視，生物防治則顯得愈加重要。因此開發(fā)環(huán)境友好、防效較高的生防制劑具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)通過對(duì)病原菌層出鐮刀菌所在地的健康雜交竹根際土中分離出20 種真菌；并分別與層出鐮刀菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，篩選出對(duì)層出鐮刀菌具有52%抑制作用的生防真菌；通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的聯(lián)合鑒定，確定為螺旋木霉RS05。進(jìn)一步顯微觀察對(duì)層出鐮刀菌菌絲的抑制作用，與前人在木霉對(duì)辣椒疫霉菌Phytophthoracapsicum、茄腐鐮刀菌F.solanum、灰葡萄孢菌Botrytiscinerea[34]、尖孢鐮刀菌、接骨鐮刀菌F.osteonicum[35]的生防作用結(jié)果相似，可以推斷螺旋木霉RS05 對(duì)層出鐮刀菌具有重寄生、競(jìng)爭(zhēng)等作用，但其具體生防機(jī)制還需要更深入研究。

為開發(fā)對(duì)層出鐮刀菌具有抑制作用的菌劑，必須篩選出能夠在適宜的條件下能快速獲得大量螺旋木霉RS05 孢子的發(fā)酵條件。本試驗(yàn)確定了PSA 為螺旋木霉RS05 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，最佳發(fā)酵條件為：8%接種量、pH=6、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、26 ℃～27 ℃下全光照發(fā)酵6 d，此條件下，產(chǎn)孢量從基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1.46×1010cfu/mL提高至1.8×1010cfu/mL。相較于其他相關(guān)研究，本試驗(yàn)在產(chǎn)孢數(shù)量上均大于長(zhǎng)枝木霉T6（8.4×108cfu/mL）[36]、棘孢木霉（4.48×109cfu/mL）和綠色木霉（4.48×109cfu/mL）[37]，本試驗(yàn)的工藝僅需要制作更少的孢子懸浮液便能達(dá)到相同甚至更高數(shù)量級(jí)的孢子數(shù)，且接種量和發(fā)酵時(shí)間均小于以上3 種木霉菌劑，增加產(chǎn)孢量的同時(shí)降低了發(fā)酵時(shí)間和培養(yǎng)周期。通過對(duì)生防真菌發(fā)酵條件的優(yōu)化，對(duì)病原層出鐮刀菌的抑制率也從52%提高到了70%，高于已有報(bào)道的螺旋木霉對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率64.57%[17]，且顯著高于細(xì)菌菌株YM-8對(duì)層出鐮刀菌的抑制率41.36%[38]。

盆栽試驗(yàn)中螺旋木霉RS05 水分散粒劑200 倍及以下稀釋液對(duì)撐×綠雜交竹基腐病的防效不低于88%，在其他竹類根腐病防治中，化學(xué)農(nóng)藥效果一般為59%～75%[39,40]，本試驗(yàn)結(jié)果顯著優(yōu)于同類病害防效的報(bào)道。另外，與深綠木霉水分散粒劑防治黃瓜枯萎病的防效（80.95%）[41]相比，螺旋木霉RS05 水分散粒劑所展現(xiàn)的防效也較為突出。從制劑質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果可知，RS05 水分散粒劑各項(xiàng)結(jié)果均比長(zhǎng)枝木霉水分散粒劑[42]、哈茨木霉水分散粒劑[43]優(yōu)異，潤(rùn)濕時(shí)間短、穩(wěn)定性強(qiáng)、懸浮率高、崩解時(shí)間短。另外，RS05 水分散粒劑200 倍稀釋液防效略高于化學(xué)水分散粒劑甲霜.噁霉靈、顯著高于生防可濕性粉劑寡雄腐霉菌。可見該制劑在雜交竹基腐病及層出鐮刀菌引起的其他植物病害上具有良好的應(yīng)用前景。在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步研究螺旋木霉生防真菌劑在大田中的病害防治效果，并擴(kuò)大防治對(duì)象范圍，以期為該制劑的開發(fā)與應(yīng)用提供新的借鑒。