趙新貝，倪云霞，劉新濤，趙 輝，閆文慶，何碧珀，劉紅彥

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北南部作物有害生物綜合治理重點實驗室/河南省農(nóng)作物病蟲害防治重點實驗室/河南省生物農(nóng)藥工程研究中心/河南省作物保護(hù)國際聯(lián)合實驗室/河南省農(nóng)用微生物創(chuàng)新中心，鄭州 450002）

芝麻是重要的油料作物之一，在我國河南、湖北、安徽和江西等省份大面積種植。由于芝麻生育期短，且整個生育期處于高溫多雨的季節(jié)，導(dǎo)致芝麻易受多種病原菌的侵襲，嚴(yán)重影響芝麻產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。開發(fā)利用廣譜高效的生防菌株及其抑菌活性代謝物，是芝麻病害綠色防控的重要手段。拜賴青霉因其良好的促生能力受到科研人員的廣泛關(guān)注，近年來，其在植物病害防治中的潛力也逐漸被挖掘，拜賴青霉對立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、大麗輪枝菌Verticilliumdahliae、膠胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides和禾谷鐮刀菌F.graminearum等植物病原真菌具有良好的抑制作用[2-4]，研究發(fā)現(xiàn)該菌可產(chǎn)生抑真菌活性化合物，如倍半烯萜penicibilaenes A 和B[4]，此外，該菌還可產(chǎn)生多種殺線蟲活性化合物[5,6]。

在前期研究中，篩選到一株拜賴青霉Penicilliumbilaiae47M-1，該菌培養(yǎng)濾液的10 倍稀釋液對多種芝麻病原真菌具有顯著的抑菌活性，表明產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，是該菌發(fā)揮抑菌作用的重要方式[7]。然而，生防菌的抑菌作用通常是多種代謝物共同作用的結(jié)果，目前對拜賴青霉的抑菌活性代謝物的研究尚不充分?？焖侔l(fā)展起來的代謝組學(xué)技術(shù)，為生物代謝成分的高通量、整體全面的分析提供了保障，目前在微生物代謝成分研究中也得到了廣泛的應(yīng)用[8-10]。

本研究在明確菌株47M-1 最佳搖床培養(yǎng)條件和優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上[11]，通過基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)平臺，檢測菌株47M-1 在不同培養(yǎng)時間所產(chǎn)生的代謝物的差異，對上調(diào)差異代謝物在HMDB 數(shù)據(jù)庫二級結(jié)構(gòu)中的分布情況及KEGG 代謝通路富集情況進(jìn)行分析，結(jié)合文獻(xiàn)報道，進(jìn)一步篩選上調(diào)差異代謝物進(jìn)行聚類分析，并通過含藥平板法驗證部分上調(diào)差異代謝物的抑菌活性。本研究為揭示菌株47M-1 的抑菌機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，為微生物制劑的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究所用拜賴青霉菌株47M-1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為M 2018899，供試芝麻枯萎病病原尖孢鐮刀菌8F27，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心段迎輝博士提供，其他供試芝麻病原菌立枯絲核菌、球黑孢和索氏平臍蠕孢，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物防治研究室分離和保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

IM-CYA 培養(yǎng)基[11]：蔗糖30 g，蛋白胨 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1000 mL。

PDA 培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL。

1.3 菌株47M-1 生長曲線測定

將菌株47M-1 接種到PDA 培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)4～7 d 大量產(chǎn)孢時，用0.05%的吐溫80 溶液洗脫孢子，用血球計數(shù)板計數(shù)孢子濃度，并調(diào)整孢子濃度為3×108孢子/mL，即為接種用孢子懸浮液。取1 mL 孢子懸浮液接種到100 mL IM-CYA 培養(yǎng)液中，于25 ℃、160 r/min 培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)16、20、24、48、72、96、120、144、192 和240 h 取培養(yǎng)物，過濾收集菌絲球，用濾紙吸干水分后，置于80 ℃烘箱烘至恒重，稱量菌絲干重。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，菌絲干重為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.4 菌株47M-1 培養(yǎng)液對四種芝麻病原真菌的抑菌活性

將1 mL 孢子懸浮液接種到100 mL IM-CYA 培養(yǎng)液中，于25 ℃、160 r/min 培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)48、96和144 h 的培養(yǎng)液，過0.22 μm 的微孔濾膜除菌即為培養(yǎng)濾液，將培養(yǎng)濾液與PDA 培養(yǎng)基1∶9 混勻制備平板，分別在平板中央接種芝麻病原尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、球黑孢和索氏平臍蠕孢的菌餅（直徑6 mm），將無菌水與PDA 按1∶9 混勻制備平板，分別在其上接種四種病原菌，作為對照。將PDA 平板置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，測定菌落直徑，計算培養(yǎng)濾液對靶標(biāo)菌的抑制率。抑制率（%）=（對照組菌落直徑－處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.5 菌株47M-1 代謝組樣品收集、檢測和分析

1.5.1 菌株47M-1 代謝組樣品收集和檢測 將菌株47M-1 的孢子懸浮液（3×108孢子/mL）按1%接種到100 mL IM-CYA 培養(yǎng)液中，于25 ℃、160 r/min 培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)48、96 和144 h 時取樣，標(biāo)記為M2、M4 和M6，培養(yǎng)產(chǎn)物過無菌尼龍網(wǎng)后收集菌絲球，將菌絲球分裝到2 mL 的無酶管中，于4 ℃、6000 g/min離心5 min，棄上清，迅速將樣品放入液氮速凍1 min，置于-80 ℃冰箱保存，每樣點分別取6 瓶培養(yǎng)物的菌絲球作為6 個重復(fù)，待樣品收集完成，送至上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行代謝物提取和檢測，具體方法如下。

取20 mg 樣品，加入1 mL 含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物的提取液（甲醇：乙腈：水=2∶2∶1（V/V/V）），渦旋混勻30 s；35 Hz 研磨4 min，超聲5 min（冰水浴），重復(fù)3 次；-40 ℃靜置1 h；將樣品4 ℃、12000 r/min 離心15 min；取上清上機(jī)檢測。另取等量所有樣品的上清混合（QC 樣品）上機(jī)檢測。

使用Vanquish 超高效液相色譜儀和Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）液相色譜柱對目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜的A 相為水相（含25 mmol/L 乙酸銨和25 mmol/L 氨水），B 相為乙腈。梯度洗脫設(shè)置為：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，95%～65% B；7～8 min，65%～40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，40%～95% B；9.1～12 min，95% B。流動相流速：0.5 mL/min，柱溫：30℃，樣品盤溫度：4 ℃，進(jìn)樣體積3 μL。

高分辨質(zhì)譜（Q Exactive Orbitrap, QE）的電離源為電噴霧電離，有正離子模式（positive ion mode,POS）和負(fù)離子模式（negative ion mode, NEG）兩種電離方式，數(shù)據(jù)分析過程中對POS 和NEG 兩組數(shù)據(jù)分別分析。Thermo Q Exactive HFX 質(zhì)譜儀可在軟件（Xcalibur，Thermo）控制下采集二級質(zhì)譜（MS2）的數(shù)據(jù)。

1.5.2 代謝組數(shù)據(jù)預(yù)處理 使用ProteoWizard 軟件，將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML 格式，然后以R 程序包（內(nèi)核為XCMS）進(jìn)行峰識別、提取、對齊和積分等處理，然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，包括對單峰的過濾去除噪音，基于變異系數(shù)去除偏離值；對單個峰過濾時保留單組空值不多于50%，或所有組中空值不多于50%的峰面積數(shù)據(jù)；以最小值二分之一填補(bǔ)缺失值；利用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行歸一化處理。將處理過的數(shù)據(jù)與百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫BiotreeDB（V2.1）進(jìn)行匹配來注釋物質(zhì)，算法打分的Cutoff 值設(shè)為0.3。

1.5.3 主成分分析 使用SIMCA 軟件（V16.0.2，Umea，Sweden）進(jìn)行主成分分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換及中心化（CTR）格式化處理，然后進(jìn)行自動建模分析。

1.5.4 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA） 以SIMCA 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換和UV 格式化處理，然后對第一主成分進(jìn)行OPLS-DA 建模，并用七折交叉驗證的R2Y（模型對分類變量Y 的可解釋性）和Q2（模型的可預(yù)測性）對模型有效性進(jìn)行評判，最后通過置換檢驗及隨機(jī)多次（n= 200）改變分類變量（Y）的排序，獲取隨機(jī)模型的Q2值，避免模型的過擬合，對模型有效性進(jìn)行進(jìn)一步檢驗。

1.5.5 差異代謝物的篩選、HMDB 二級分類分析及上調(diào)差異代謝物的代謝通路富集分析 分別將48、96和144 h 時樣品的代謝組數(shù)據(jù)標(biāo)記為M2、M4 和M6，分別進(jìn)行M4 和M2、M6 和M4、M6 和M2 三組數(shù)據(jù)的對比分析。以學(xué)生t檢驗（Student’st-test）的P＜0.05，以及OPLS-DA 模型第一主成分變量投影重要度（VIP）＞1 為卡值標(biāo)準(zhǔn)，篩選顯著上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物，由于培養(yǎng)液的抑菌活性隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增強(qiáng)，本研究以上調(diào)差異代謝物為分析對象，分析正離子模式和負(fù)離子模式中3 組對比共有和特有的上調(diào)差異代謝物數(shù)量，進(jìn)一步進(jìn)行去冗余后的上調(diào)差異代謝物在HMDB 數(shù)據(jù)庫超類中的分布情況分析，以及KEGG 通路富集分析。

1.5.6 目標(biāo)差異代謝物的篩選和層次聚類分析 對涉及上調(diào)差異代謝物的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，將上調(diào)差異代謝物分布最多的超類中的代謝物，及其它超類中有抑菌活性相關(guān)報道的上調(diào)差異代謝物作為目標(biāo)差異代謝物（表1），對目標(biāo)差異代謝物的定量值計算歐式距離矩陣，以完全連鎖方法對這些差異代謝物進(jìn)行聚類，對具有相同特征的代謝物進(jìn)行歸類，并明確代謝物的組間變化特性。

表1 38 種目標(biāo)代謝物的信息表Table 1 Information table of 38 target metabolites

1.6 目標(biāo)差異代謝物對四種病原菌的抑菌作用測定

明確目標(biāo)代謝物的CAS 號，并對其市售試劑或標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢索，最終選擇其中17 種代謝物的標(biāo)準(zhǔn)品（表2），使用含藥平板法測定這17 種標(biāo)準(zhǔn)品對芝麻病原尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、索氏平臍蠕孢和球黑孢的抑菌作用。擬定目標(biāo)化合物的初篩濃度為2 mg/mL，由于規(guī)格限制，部分化合物初篩濃度為1 mg/mL。每平板倒10 mL PDA 培養(yǎng)基，待凝固后，再倒5 mL 含藥的PDA 培養(yǎng)基制備平板，并以含等量相應(yīng)溶劑的PDA 平板作為對照，在平板中央接種病原菌的菌餅（直徑6 mm），將平板置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～8 d，以十字交叉法測定菌落直徑，計算抑制率。以2 mg/mL 的終濃度制備橙皮素、原卟啉、3,4-二羥基苯基丙酸、柚皮素、3(3-羥基苯基)丙酸、4',5,7-三羥黃烷酮、原兒茶酸、D-(-)-奎寧酸和尿囊素的含藥平板。以1 mg/mL 的終濃度制備山奈素、迷迭香酸、表兒茶素、圣草酚、染料木苷、(-)-表沒食子兒茶素、佛手苷內(nèi)酯和隱綠原酸的含藥平板。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用軟件SPSS 17.0 對抑菌活性相關(guān)試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計及方差齊性檢測，并采用Duncan's 新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析，利用GraphPad Prism 9.0 軟件作圖，圖中不同小寫字母代表同一系列不同處理間在P＝0.05 水平上存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株47M-1 的生長曲線

將菌株47M-1 的孢子懸浮液接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在接種后240 h 內(nèi)取樣測量菌絲球干重，由測量結(jié)果可知，在培養(yǎng)16～144 h 之間，菌絲生長較快，菌絲干重迅速增長，為菌絲快速生長期，在培養(yǎng)144 h 之后，菌絲干重開始下降，進(jìn)入衰亡期，即菌株47M-1 的最佳培養(yǎng)時間是144 h（圖1）。

圖1 菌株47M-1 在IM-CYA 中培養(yǎng)時的生長曲線Fig.1 Growth curve of strain 47M-1 cultured in IM-CYA

2.2 菌株47M-1 的培養(yǎng)液對四種芝麻病原真菌的抑菌活性

分別測定菌株47M-1 培養(yǎng)48、96 和144 h 時培養(yǎng)濾液對尖孢鐮刀菌、球黑孢、立枯絲核菌和索氏平臍蠕孢的抑菌活性，由結(jié)果可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)濾液的抑菌活性逐漸增強(qiáng)，培養(yǎng)48 h 時的濾液抑菌活性較低，尤其是對尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌的抑制率僅為32.5%和17.7%，培養(yǎng)96 h 時的濾液對尖孢鐮刀菌、球黑孢、立枯絲核菌和索氏平臍蠕孢的抑菌活性均顯著增強(qiáng)，抑制率分別為100%、99.0%、52.8%和72.0%（圖2A，B），培養(yǎng)144 h 時的濾液對立枯絲核菌和索氏平臍蠕孢的抑菌活性相比96 h 時仍在增長，尤其對索氏平臍蠕孢的抑制率顯著增加，達(dá)86.7%（圖2C，D）。結(jié)合菌株47M-1 的生長曲線及其對四種芝麻病原真菌抑菌活性測定結(jié)果，將對其液體培養(yǎng)48、96 和144 h 的代謝物進(jìn)行對比分析，來挖掘潛在的抑菌活性物質(zhì)。

圖2 菌株47M-1 培養(yǎng)濾液對四種芝麻病原菌的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of culture filtrate of strain 47M-1 on four kinds of sesame pathogens

2.3 代謝組數(shù)據(jù)處理和分析

2.3.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理 經(jīng)過數(shù)據(jù)處理后，正離子模式23871 個峰被保留，通過二級質(zhì)譜（MS2）定性匹配到599 種物質(zhì)；負(fù)離子模式13480 個峰被保留，通過二級質(zhì)譜（MS2）定性匹配到225 種物質(zhì)（表3）。

表3 代謝組預(yù)處理后數(shù)據(jù)Table 3 Clean data of metabolome

2.3.2 主成分分析 由圖3A 和3B 可知，在正離子和負(fù)離子模式中，樣本全部處于95%的置信區(qū)間內(nèi)，正離子模式和負(fù)離子模式中第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)值分別達(dá)到了76%和62.8%，兩種模式中M2、M4 和M6 主要由PC1 進(jìn)行區(qū)分，三組樣本間分離趨勢明顯，表明M2、M4 和M6 的代謝物存在顯著差異。

圖3 正離子（A）和負(fù)離子（B）模式下樣本PCA 模型的得分散點圖Fig.3 Score scatter plot for PCA model in postive ion mode (A) and negative ion mode (B)

2.3.3 OPLS-DA 置換檢驗 由圖4 可知，在正離子模式和負(fù)離子模式的六組對比中，原模型（橫坐標(biāo)為1處對應(yīng)的R2Y 和Q2值）的R2Y 均趨近1，表明原模型符合樣本數(shù)據(jù)真實情況，原模型Q2趨近1，表明原模型可以很好的解釋兩組樣本之間的差異，且置換檢驗隨機(jī)模型的Q2均小于原模型的Q2值，Q2的回歸線與縱軸的截距小于0，隨著置換保留度的降低，置換中Y 變量占比上升，隨機(jī)模型的Q2逐漸下降，表明原模型具有良好的穩(wěn)健性，不存在過擬合現(xiàn)象。

圖4 正離子和負(fù)離子模式下三個對比組的OPLS-DA 模型的置換檢驗Fig.4 Permutation test of OPLS-DA model for three groups in postive ion mode and negative ion mode

2.3.4 差異代謝物的篩選 以t檢驗的P＜0.05 和OPLS-DA 模型的VIP＞1 為卡值篩選差異代謝產(chǎn)物（圖5A）。正離子模式中，在M4-M2、M6-M4 和M6-M2 三組對比中分別篩選到下調(diào)差異代謝物15223、9361和16006 個，上調(diào)差異代謝物487、446 和420 個（圖5B，C）；在負(fù)離子模式中，在M4-M2、M6-M4和M6-M2 三組對比中分別篩選到下調(diào)差異代謝物4873、2117 和4885 個，上調(diào)差異代謝物2804、1546和2857 個（圖5B，C）；綜合正離子模式和負(fù)離子模式篩選到的差異代謝物可知，上調(diào)差異代謝物在差異代謝物中占比僅為14.0%，且48～96 h（M4-M2）的上調(diào)差異代謝物數(shù)量較96～144 h（M6-M4）高出65%。

圖5 正離子和負(fù)離子模式下三組中差異代謝物的篩選Fig.5 Screening of differential metabolites for three groups in postive ion mode (POS) and negative ion mode (NEG)

2.3.5 非冗余上調(diào)差異代謝物的篩選及其在HMDB 數(shù)據(jù)庫二級分類中的分布 對代謝物進(jìn)行注釋，在正離子模式中，M4-M2、M6-M4 和M6-M2 三組對比的差異代謝物分別有397、349 和429 種匹配到物質(zhì)，其中上調(diào)差異代謝物分別有21、9 和20 種（圖6 A）；在負(fù)離子模式下，4-2、6-4 和6-2 三組對比的差異代謝物分別有141、84 和151 種匹配到物質(zhì)，其中上調(diào)差異代謝物分別為61、29 和64 種（圖6 B）。正離子模式和負(fù)離子模式中分別篩選到非冗余上調(diào)差異代謝物28 個和77 個（圖6 A, B），分析篩選到的105個非冗余上調(diào)差異代謝物在HMDB 數(shù)據(jù)庫二級分類中的分布情況，發(fā)現(xiàn)其主要富集在脂質(zhì)和類脂分子、有機(jī)酸及其衍生物、苯丙素和聚酮類化合物、有機(jī)雜環(huán)化合物、有機(jī)氧化合物、核苷和核苷酸及其類似物、苯環(huán)型化合物超類中，其中苯丙素和聚酮類化合物超類中富集上調(diào)差異代謝物最多，達(dá)29 個（圖6 C）。

圖6 非冗余上調(diào)差異代謝物的篩選及其在HMDB 數(shù)據(jù)庫二級分類中的分布Fig.6 Screening of non-redundant up-regulated differential metabolites and their distribution in secondary classification of HMDB database

2.3.6 非冗余上調(diào)差異代謝物的代謝通路富集分析 對篩選到的105 個非冗余上調(diào)差異代謝物中的68個可注釋到KEGG 數(shù)據(jù)庫的化合物，進(jìn)行KEGG 通路富集分析，富集的B 級通路涉及氨基酸代謝、碳水化合物代謝、細(xì)胞生長和死亡、全局和概述圖譜、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和核苷酸代謝，包括的C 級通路有代謝途徑、輔因子生物合成、嘌呤代謝、氨基酸生物合成、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體、酪氨酸代謝、半乳糖代謝和戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換途徑，其中代謝途徑富集比例最高，達(dá)84.4%，其次為輔因子生物合成途徑，富集比例為20%（圖7）。

圖7 上調(diào)差異代謝物的KEGG 富集分析Fig.7 KEGG enriched analysis of up-regulated differential metabolites

2.3.7 目標(biāo)差異代謝物的篩選及聚類分析 對篩選出來的105 種非冗余上調(diào)差異代謝物進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，檢索結(jié)果表明，苯丙素和聚酮類化合物中上調(diào)的差異代謝物共29 種，其中文獻(xiàn)報道有抑菌活性的有17種，其中12 種有抑制真菌活性，分別為3-羥基根皮素[12]、4-甲基表兒茶素[13]、二氫芒柄花黃素[14]、甘草素[15]、橙皮素[16]、表兒茶素[13]、櫻花素[17]、茶堿[18]、迷迭香酸[19,20]、染料木苷[21-22]、柚皮素[23-24]和佛手苷內(nèi)酯[25]。其中11 種具有抑制細(xì)菌活性，分別為4-甲基表兒茶素[13]、3-羥基根皮素[26]、燕麥生物堿1p[27]、水飛薊亭[28]、山奈素[29]、表兒茶素[13]、迷迭香酸[19,20]、圣草酚[30]、染料木苷[21,22]、(-)-表沒食子兒茶素[31,32]和柚皮素[23,24]。其中甘草素同時具備抗真菌和抗病毒活性，表兒茶素、迷迭香酸、染料木苷和柚皮素同時具備抑制真菌和細(xì)菌活性，而3-羥基根皮素和橙皮素對植物病原真菌表現(xiàn)抑菌活性。除苯丙素和聚酮類化合物外，其他超類中有抑菌活性報道的上調(diào)差異代謝物有9 種，分別為原卟啉[33]、N-(2-糠酰)甘氨酸[34]、異檸檬酸、原兒茶酸[35]、苯線磷、奎寧酸[36]、尿囊素[37]、新綠原酸[38]和隱綠原酸[38]。

以苯丙素和聚酮類化合物超類中的29 種上調(diào)差異代謝物，及其他超類中有抑菌活性報道的9 種上調(diào)的差異代謝物為目標(biāo)差異代謝物（表1），進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，38 種代謝物被分為三類，從48 h 至96 h 至144 h，第一類代謝物積累量先降低再升高，僅包含3 種化合物；第二類代謝物積累量先升高，之后為持平狀態(tài)，包含13 種化合物；第三類代謝物積累量持續(xù)升高，包含22 種化合物（圖8）。

圖8 38 種代謝物的聚類分析熱力圖Fig.8 Heatmap of hierarchical clustering analysis of 38 metabolites

2.4 目標(biāo)差異代謝物對四種病原菌的抑菌作用測定

測定17 種目標(biāo)差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌活性，結(jié)果表明，供試標(biāo)準(zhǔn)品對病原真菌均有一定的抑菌活性。在以2 mg/mL 的濃度篩選的化合物中，對尖孢鐮刀菌抑菌活性最強(qiáng)的為柚皮素，其次為原兒茶酸和D-(-)-奎寧酸，對球黑孢抑菌活性最強(qiáng)的為橙皮素，其次為3-(3-羥基苯基)丙酸，對立枯絲核菌抑菌活性最強(qiáng)的為3-(3-羥基苯基)丙酸，其次為3, 4-二羥苯基丙酸、4’, 5, 7-三羥黃烷酮和D-(-)-奎寧酸，對索氏平臍蠕孢抑菌活性最強(qiáng)的為3, 4-二羥苯基丙酸，其次為原兒茶酸和D-(-)-奎寧酸（圖9 A）。在以1 mg/mL 的濃度篩選的化合物中，對四種供試病原菌抑菌活性最強(qiáng)的均為迷迭香酸，除迷迭香酸外，對尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌抑菌活性最強(qiáng)的均為佛手苷內(nèi)酯，對索氏平臍蠕孢抑菌活性最強(qiáng)的為圣草酚（圖9 B）。即通過含藥平板法，篩選到抑菌作用明顯的化合物柚皮素、原兒茶酸、D-(-)-奎寧酸、橙皮素、3-(3-羥基苯基)丙酸、3, 4-二羥苯基丙酸、4’, 5, 7-三羥黃烷酮、迷迭香酸、佛手苷內(nèi)酯和圣草酚，對4 種病原真菌均有抑菌活性的抑菌化合物有3, 4-二羥苯基丙酸、3(3-羥基苯基)丙酸、原兒茶酸、D-(-)-奎寧酸、尿囊素、迷迭香酸和佛手苷內(nèi)酯。

圖9 17 種化合物對四種病原菌菌絲生長的抑制率Fig.9 Inhibition rates of 17 compounds on mycelial growth of four pathogens

3 討論

青霉是植物病害防治中重要的生防資源之一，青霉代謝產(chǎn)物極其豐富，可產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)抑制植物病原菌生長。研究人員從疣狀青霉P.verrucosum、變灰青霉P.canescens、簡青霉P.simplicissimum、產(chǎn)黃青霉P.chrysogenum和棘孢青霉P.aculeatum等多種青霉中分離到抗真菌化合物[39-44]。本研究中供試拜賴青霉菌株47M-1 是具備促生、誘導(dǎo)抗病性和廣譜抑菌活性的高效生防菌株，其培養(yǎng)濾液對芝麻多種病原菌具備強(qiáng)烈的抑制作用[7]，對其代謝產(chǎn)物的研究具有重要意義。本研究通過LC-MS/MS 技術(shù)檢測菌株47M-1 發(fā)酵產(chǎn)物中的化合物，并去冗余分析后，從三組對比中共篩選出105 種上調(diào)差異代謝物，在苯丙素和聚酮類化合物超類中富集了29 種。據(jù)報道，2014—2017 年海洋真菌來源的天然產(chǎn)物中，聚酮類化合物占比僅次于生物堿[45]，本研究中菌株47M-1 來自植物根際土壤，其產(chǎn)生的潛在的抑菌活性物質(zhì)，以苯丙素類和聚酮類化合物為主。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)差異代謝物主要富集在代謝途徑、輔因子生物合成、嘌呤代謝、氨基酸生物合成、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體等通路，其中代謝途徑富集比例高達(dá)84.44%，其次為輔因子生物合成途徑，富集比例為20%。輔因子在代謝網(wǎng)絡(luò)中通過調(diào)控胞內(nèi)關(guān)鍵酶，廣泛參與物質(zhì)合成和分解代謝反應(yīng)，從而顯著影響細(xì)胞生長和代謝速率，在微生物細(xì)胞中進(jìn)行調(diào)控的輔因子主要包括NAD(P)H/NAD(P)+、乙酰輔酶A 和ATP/ADP，其中乙酰輔酶A 可以作為?；d體和代謝物前體，可用于合成脂質(zhì)、聚酮、類異戊二烯等化合物[46]，同時，乙酰輔酶A 還參與了三羧酸循環(huán)、糖酵解、脂肪酸生物合成及氨基酸生物合成等重要的中心代謝途徑[47]。由苯丙氨酸脫氨基開始的合成途徑是苯丙素類化合物的主要合成途徑，過氧化物酶體NAD+載體將輔酶A 從胞質(zhì)向過氧化物酶體轉(zhuǎn)運(yùn)，為其中所有輔酶A 連接酶提供重要底物，而過氧化物酶體ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)子對肉桂酰輔酶A 的轉(zhuǎn)運(yùn)和催化是β-氧化途徑合成苯丙素類化合物的第一步[48]。此外，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要從事胞內(nèi)外的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，它可以結(jié)合輔因子ATP，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體的轉(zhuǎn)膜蛋白在跨膜區(qū)組成通道，胞漿內(nèi)的ATP 結(jié)合區(qū)在Mg2+參與下水解ATP 完成底物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[49,50]，從而協(xié)助菌體細(xì)胞完成一系列的代謝。綜上，菌株47M-1 的上調(diào)差異代謝物在輔因子生物合成途徑的富集比例僅次于代謝途徑，輔因子不僅可以作為聚酮類化合物合成的前體，參與苯丙素類化合物的合成，為化合物的合成和分解提供必須的能量，調(diào)控化合物的合成和分解代謝，同時可與ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體協(xié)作進(jìn)行胞內(nèi)外化合物運(yùn)輸，因此輔因子生物合成途徑是菌株47M-1 抑菌活性代謝物發(fā)揮作用的關(guān)鍵途徑。

對上調(diào)差異代謝物中部分代謝物的抑菌活性進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)供試標(biāo)準(zhǔn)品中10 種化合物：柚皮素、原兒茶酸、D-(-)-奎寧酸、橙皮素、3-(3-羥基苯基)丙酸、3,4-二羥苯基丙酸、4′,5,7-三羥黃烷酮、迷迭香酸、佛手苷內(nèi)酯和圣草酚，對芝麻病原真菌抑菌作用較好，其中柚皮素、原兒茶酸、橙皮素、迷迭香酸和佛手柑內(nèi)脂均有抑制植物病原真菌的相關(guān)報道。柚皮素是黃酮途徑的第一個中間體，其對稻瘟病菌黃單胞菌的生長和孢子萌發(fā)均有抑制作用[51]，從紅豆樹莖枝中分離的柚皮素，對禾谷鐮孢、西瓜尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌的菌絲生長顯示出了中等強(qiáng)度的抑制作用[24]；原兒茶酸對引起水果腐爛病的擴(kuò)展青霉的生長有抑制作用[52]；橙皮素是一種天然的黃烷酮類化合物，具有抗氧化、消炎、抗菌的作用，其在柑橘果實與膠孢炭疽菌互作中起到防御作用[16]，另外施用到種子表面或種植溝中均可促進(jìn)豌豆結(jié)瘤[53]，該化合物可能通過激活宿主免疫系統(tǒng)，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，干擾微生物酶來發(fā)揮抗細(xì)菌特性[54]；迷迭香酸是一種植物來源的天然化合物，對尖孢鐮刀菌和灰葡萄孢等6 種植物病原真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用[20]；無花果葉的正丁醇提取物中分離到的佛手柑內(nèi)脂，對油菜菌核病菌、蘋果腐爛病菌和黃瓜枯萎病菌等5 種供試病原真菌均有抑制作用，且該化合物具有強(qiáng)光敏抑菌作用，可見光照射顯著增強(qiáng)了佛手柑內(nèi)脂的抑菌活性[25]。在10 種具有良好抑菌活性的化合物中，D-(-)-奎寧酸、3(3-羥基苯基)丙酸、3, 4-二羥苯基丙酸、4',5,7-三羥黃烷酮和圣草酚并無對植物病原真菌抑制作用的相關(guān)報道。

Meng 等[4]從海洋來源的拜賴青霉MA-267 分離到的抑真菌活性化合物倍半烯萜A 和B，屬于脂質(zhì)和類脂分子超類倍半萜類化合物，通過代謝組檢測鑒定，在拜賴青霉菌株47M-1 中注釋到的倍半萜類化合物13 種，但是并未注釋到倍半烯萜A 和B，可能是由于菌株來源不同，不同分離株間存在個體差異，也可能是由于分離檢測手段不同，且LC-MS 定性數(shù)據(jù)庫也尚在完善中。本研究基于代謝組分析，明確了菌株47M-1抑菌活性物質(zhì)以聚酮類化合物為主，菌株47M-1 發(fā)揮抑菌作用的關(guān)鍵途徑是輔因子生物合成途徑。在具備抑菌活性的化合物中，一部分已有抑制植物病原菌的相關(guān)報道，也有一部分尚未檢索到植物病原菌抑菌活性相關(guān)報道，且抑菌活性化合物的抑菌作用均未超越培養(yǎng)濾液10 倍稀釋液，表明其培養(yǎng)濾液廣譜顯著的抑菌活性，是大量活性代謝物共同作用的結(jié)果，將篩選到的化合物復(fù)配使用，可能增強(qiáng)對病原菌的抑制作用。本研究將為拜賴青霉菌株47M-1 的深入研發(fā)提供理論依據(jù)。