張 坤，王凱樂，張鵬九，劉中芳，楊 靜，樊建斌，趙勁宇，范仁俊，高 越

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

近年來，蘋果種植產(chǎn)業(yè)遇到諸多蟲害問題，嚴(yán)重影響了果實(shí)的數(shù)量和品質(zhì)。蘋果全爪螨Panonychusulmi(Koch)別名蘋果紅蜘蛛，屬真螨目葉螨科，是世界性果樹害螨[1]。主要分布于中國(guó)的山西、河南、遼寧、山東等省，其體長(zhǎng)約0.45 mm，寬0.29 mm，體態(tài)呈圓紅色，在中國(guó)北方果區(qū)年生6～9 代，產(chǎn)卵力較強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，發(fā)育周期短，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)[2-4]，伴隨著近年來果樹耕作制度、栽培技術(shù)的轉(zhuǎn)變以及過度使用化學(xué)殺蟲劑對(duì)生態(tài)平衡的影響，蘋果全爪螨已由次要害蟲上升為主要害蟲。針對(duì)蘋果樹螨害問題，目前的防治措施主要為化學(xué)防治，由于化學(xué)農(nóng)藥的頻繁使用，導(dǎo)致了土壤化學(xué)農(nóng)藥的高殘留、果樹上耐藥性害螨的出現(xiàn)等一系列生態(tài)環(huán)境問題，這些因素嚴(yán)重限制了化學(xué)農(nóng)藥的使用和蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

植物精油作為一種植物源物質(zhì)，可隨水蒸氣蒸餾出來而又與水不相混溶，是植物的次生代謝產(chǎn)物[5]。植物精油在自然界中分布廣泛，化學(xué)成分繁多，主要有萜類化合物、酸性化合物（如苯甲酸）、醇類化合物（如香葉醇、薄荷醇）、醛類化合物（如檸檬醛、肉桂醛）、酮體以及酚類等，其中萜烯類、萜類和芳香酚類化合物在精油活性中起重要作用[6-9]。已有的文獻(xiàn)研究證明了植物精油中具有一定的殺蟲、殺螨活性物質(zhì)，作用方式多樣，包括觸殺、熏蒸、驅(qū)避、拒食、抑制種群生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等[10-12]，具有開發(fā)成為防治螨類害蟲的植物源殺螨劑的潛力。截至目前，國(guó)內(nèi)外已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了如薄荷精油、陳皮精油、松樹油、檸檬精油、桉葉油、青蒿精油、生姜精油等植物精油對(duì)各類蟲害具有一定的防治作用[13-19]，作用于靶標(biāo)生物時(shí)其作用機(jī)理各不相同，作用原理為影響蟲害的生長(zhǎng)發(fā)育和水分代謝，或者抑制其體內(nèi)的代謝解毒酶、破壞其體壁結(jié)構(gòu)，溶解角質(zhì)層，增強(qiáng)化學(xué)物質(zhì)的滲透性等[20]。但是，目前關(guān)于植物精油在果樹螨害防治領(lǐng)域中的應(yīng)用研究較少，為防治蘋果全爪螨，本研究探索7 種植物精油對(duì)蘋果全爪螨的生物活性，篩選出較高活性的薄荷精油，并通過GC-MS 分析了薄荷精油的化學(xué)成分，評(píng)價(jià)薄荷精油對(duì)蘋果全爪螨的觸殺、熏蒸、驅(qū)避活性，旨在為蘋果全爪螨的綠色防治和天然殺螨劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試螨源

蘋果全爪螨Panonychusulmi(Koch)為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院果蔬病害實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)用蘋果苗和枝葉連續(xù)飼養(yǎng)的敏感品系，培養(yǎng)箱飼養(yǎng)條件：溫度（25±1） ℃、相對(duì)濕度60%～80%、光周期16L∶6D。

1.2 供試植物

植物采集名錄見表1。

表1 植物采集名錄Table 1 Eight plants directory

1.3 試劑及儀器

儀器：連續(xù)蒸餾裝置（上海五相儀器儀表有限公司），SHZ-DIII 循環(huán)水式真空泵（上海臥泉泵業(yè)有限公司），RE-52CS 型號(hào)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)A1604B 萬分之一電子分析天平（上海精密儀器儀表有限公司），KQ-300E 超聲波振蕩器（上海五相儀器儀表有限公司），ULUP-Ⅱ超濾除熱源型超純水器（西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司），Potter 噴霧塔（英國(guó)波特有限公司），安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀（深圳市三莉科技有限公司），HWS-80 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

試劑：正己烷、無水硫酸鈉、瓊脂、吐溫-80（市售化學(xué)純）、丙酮（市售分析純）均購(gòu)于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，聚四氟乙烯購(gòu)于上海三愛富新材料股份有限公司。

1.4 精油提取

將供試的7種植物采集樣品曬干后進(jìn)行粉碎，每種樣品用分析天平準(zhǔn)確稱取100 g樣品分別放入到2500 mL水中浸泡24 h，然后控制蒸餾裝置溫度為100 ℃蒸餾6 h，所得油水混合物用正己烷萃取6 h，萃取產(chǎn)物經(jīng)無水硫酸鈉脫水12 h 后過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)濃縮（40 ℃）回收正己烷，殘存的油狀液即為精油，測(cè)比重后收集產(chǎn)品于棕色磨口精油瓶中，置于4 ℃冰箱中密封保存?zhèn)溆谩＞吞崛÷剩?）＝提取的精油質(zhì)量/原材料質(zhì)量×100%。

1.5 精油活性測(cè)定

1.5.1 觸殺活性測(cè)定 蘋果全爪螨為刺吸式口器，采用Potter 噴霧法進(jìn)行室內(nèi)觸殺活性測(cè)定。將供試精油用丙酮溶解后配制成母液，再用吐溫-80 水溶液將母液稀釋至0.391、0.781、1.563、3.125、6.250 g/L。將接有蘋果全爪螨的蘋果樹葉片置于Potter 噴霧塔下噴霧處理（壓力100 kPa，體積4 mL，沉降2 min）后密封倒扣，重復(fù)3 次，以只有丙酮和吐溫-80 水溶液的處理為對(duì)照，然后置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于12、24、48 h 后調(diào)查結(jié)果，記錄蘋果全爪螨的死亡頭數(shù)并統(tǒng)計(jì)7 種精油噴霧觸殺蘋果全爪螨的毒力參數(shù)。以毛筆觸動(dòng)后無反應(yīng)或不能正常爬行者視為死亡，計(jì)算LC50。死亡率（%）＝死亡蟲數(shù)/總蟲數(shù)×100；校正死亡率（%）＝100×（處理組死亡率―對(duì)照組死亡率）/（1―對(duì)照組死亡率）。

1.5.2 熏蒸活性測(cè)定 采用培養(yǎng)皿密閉熏蒸法進(jìn)行室內(nèi)熏蒸活性測(cè)定。培養(yǎng)皿（9.0 cm×2.0 cm），剪取一條濾紙（長(zhǎng)度3.0 cm×寬度1.0 cm），用雙面膠將濾紙條兩端固定在培養(yǎng)皿蓋上（濾紙條與皿蓋留有空隙）。分別在濾紙條上滴加3.18、6.36、12.72、25.44、50.88 μL 精油，并快速用封口膜密封，使得培養(yǎng)皿密閉空氣中精油濃度為25、50、100、200、400 μL/L。其余步驟同1.5.1，計(jì)算其熏蒸毒力，計(jì)算LC50。

1.5.3 驅(qū)避活性測(cè)定 參照Zhang 等[21]采用的藥膜法進(jìn)行驅(qū)避活性測(cè)定。剪取直徑為9 cm 的圓形濾紙片，對(duì)折后裁成兩半備用。用移液槍吸取濃度為L(zhǎng)C50（熏蒸處理24 h 后）的精油丙酮稀釋液滴于其中一半濾紙片上，另一半為丙酮對(duì)照，濾紙片自然晾干1 min 后用雙面膠粘貼于直徑為9 cm 的瓊脂培養(yǎng)皿底部（培養(yǎng)皿壁涂聚四氟乙烯防止蘋果全爪螨逃脫）。把30 頭蘋果全爪螨用吸蟲器接入培養(yǎng)皿中間位置，使其自行向處理區(qū)和對(duì)照區(qū)擴(kuò)散，重復(fù)3 次。放置于26 ℃培養(yǎng)箱中，分別觀察記錄3、6、12、24 h 后處理與對(duì)照濾紙上的蘋果全爪螨個(gè)數(shù)，計(jì)算驅(qū)避率。驅(qū)避率（%）＝（對(duì)照區(qū)蟲數(shù)－處理區(qū)蟲數(shù)）/對(duì)照區(qū)蟲數(shù)×100。

驅(qū)避結(jié)果按照表2 的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)。

表2 驅(qū)避活性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Classification criteria of repellent activity

1.5.4 精油成分分析 采用安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)精油化學(xué)成分。氣相色譜條件：采用HP-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），起始溫度設(shè)置60 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 升至280 ℃，保持5 min，進(jìn)樣溫度280 ℃，載氣為高純氦氣，氦氣流速為2.0 mL/min，分流比50∶1，進(jìn)樣量1.0 μL。質(zhì)譜條件為：EI 離子源，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描質(zhì)量范圍20～650 m/z，質(zhì)譜采集延遲時(shí)間2 min。使用NIST 譜庫(kù)圖譜檢索進(jìn)行定性，定量方法為氣相色譜面積歸一法。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用Microsoft Office Excel 2010 和Data Processing System（DPS 7.05）進(jìn)行分析。采用Duncan’s 檢驗(yàn)，在P＜0.05 顯著水平下測(cè)定各處理間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油對(duì)蘋果全爪螨的觸殺毒力

測(cè)定7 種植物精油對(duì)蘋果全爪螨的觸殺毒力見表3。結(jié)果表明，處理12 h 后，薄荷精油對(duì)供試螨的LC50為2.13 g/L，95%置信區(qū)間為1.63～2.79 g/L；陳皮精油對(duì)供試螨的LC50為4.79 g/L，95%置信區(qū)間為2.41～9.54 g/L；松樹油、檸檬精油、生姜精油、桉葉油、青蒿精油對(duì)供試螨的LC50均大于5 g/L，觸殺毒力顯著低于中國(guó)《國(guó)家農(nóng)藥產(chǎn)品微毒劑量標(biāo)準(zhǔn)》[22]的臨界值5 g/L，因此可認(rèn)為上述4 種精油在處理12 h 后對(duì)供試螨無觸殺毒力。處理24 h 后，薄荷精油對(duì)供試螨的LC50為0.83 g/L，95%置信區(qū)間為0.81～0.86 g/L。最后，處理48 h 后，薄荷精油對(duì)供試螨的LC50為0.77 g/L，95%置信區(qū)間為0.71～0.84 g/L。綜上，在密閉環(huán)境條件下薄荷精油對(duì)供試螨的噴霧觸殺活性強(qiáng)于其他6 種植物精油，且觸殺毒力隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

表3 七種植物精油對(duì)蘋果全爪螨的觸殺毒力Table 3 Contact toxicity of seven plant essential oils to Panonychus ulmi

2.2 植物精油對(duì)蘋果全爪螨的熏蒸毒力

測(cè)定7 種植物精油對(duì)蘋果全爪螨的熏蒸毒力見表4。結(jié)果表明，處理12 h 后，薄荷精油對(duì)供試螨的LC50為382.86 μL/L，95%置信區(qū)間為326.16～449.47 μL/L；處理24 h后，薄荷精油對(duì)供試螨的LC50為73.89 μL/L，95%置信區(qū)間為69.64～78.39 μL/L；處理48 h 后，薄荷精油對(duì)供試螨的LC50為16.08 μL/L，95%置信區(qū)間為10.78～23.98 μL/L，說明精油對(duì)供試螨的熏蒸毒力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增強(qiáng)。此外，在3 種不同的處理時(shí)間下，其他6 種精油對(duì)供試螨的熏蒸毒力均明顯低于薄荷精油。綜上，在密閉環(huán)境條件下薄荷精油對(duì)供試螨的熏蒸活性強(qiáng)于其他6 種植物精油。

表4 七種植物精油對(duì)蘋果全爪螨的熏蒸毒力Table 4 Fumigation toxicity of seven plant essential oils to Panonychus ulmi

2.3 植物精油對(duì)蘋果全爪螨的驅(qū)避活性和驅(qū)避等級(jí)

為了探究開放環(huán)境中精油氣味對(duì)蘋果全爪螨移動(dòng)行為的影響，取熏蒸處理24 h 時(shí)各精油的LC50為精油驅(qū)避活性測(cè)試濃度，測(cè)定3、6、12、24 h 時(shí)蘋果全爪螨的驅(qū)避活性。由表5 可見，7 種植物精油對(duì)供試螨的驅(qū)避活性均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，具有較強(qiáng)的時(shí)間依賴性。其中薄荷精油、陳皮精油在驅(qū)避處理24 h 后，驅(qū)避率超過70.00%。此結(jié)果說明在開放環(huán)境中，精油通過揮發(fā)產(chǎn)生的氣味可以對(duì)蘋果全爪螨產(chǎn)生驅(qū)避作用，使得精油處理區(qū)域的供試螨數(shù)量減少。當(dāng)處理時(shí)間由3 h 延長(zhǎng)到24 h 后，薄荷精油、陳皮精油、松樹油、檸檬精油、生姜精油、桉葉油、青蒿精油對(duì)供試螨的驅(qū)避率分別增加了2.62、3.06、3.29、3.92、3.95、5.18、5.64 倍，且處理時(shí)間持續(xù)到24 h 后，薄荷精油的驅(qū)避等級(jí)可以達(dá)到Ⅳ級(jí)，驅(qū)避活性具有持效性。

表5 植物精油對(duì)蘋果全爪螨的驅(qū)避效果Table 5 Repellent effects of essential oils on Panonychus ulmi

2.4 薄荷精油的化學(xué)成分分析

最后，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析了薄荷精油的化學(xué)成分。薄荷精油經(jīng)過GC-MS 檢測(cè)共鑒定出34 個(gè)峰，所檢測(cè)出的化學(xué)成分占精油總含量的99.67%，由表6 可知，相對(duì)含量在0.3%以上的峰有31 個(gè)，其中出峰時(shí)間在10.757 min 時(shí)的物質(zhì)含量最高，供試薄荷精油的主要成分為薄荷醇（32.16%）、D-檸檬烯（16.44%）、4-異丙基甲苯（11.32%）、3-蒈烯（10.27%）、丙二酸二乙酯（9.57%）、薄荷酮（3.91%）、主要成分總含量為83.67%。

表6 薄荷精油的化學(xué)成分分析Table 6 Chemical composition analysis of peppermint essential oil

3 討論

與化學(xué)殺螨劑相比，植物源殺螨劑不僅對(duì)螨蟲具有拒食、毒殺、麻醉、抑制生長(zhǎng)發(fā)育及干擾正常行為等生物活性，而且還具有對(duì)環(huán)境友好、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、作用方式特異、促進(jìn)作物生長(zhǎng)并提高抗蟲性等特點(diǎn)[23]。

植物精油不僅具有農(nóng)用活性（殺蟲、抑菌、除螨、除草等），同時(shí)也具有醫(yī)療、食品保鮮作用[24-26]。但薄荷精油作為新興的殺螨產(chǎn)品，想要取代化學(xué)制品仍然面臨很多問題，如薄荷精油的作用機(jī)理尚未完全清晰、提取技術(shù)的應(yīng)用難以走進(jìn)工業(yè)化車間、揮發(fā)性強(qiáng)等。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)薄荷精油對(duì)蘋果樹常見病害中的蘋果樹腐爛?。ㄖ饕虏【诟俨【┖桶唿c(diǎn)落葉病（主要致病菌鏈格孢蘋果?；途┮簿哂幸志饔肹27]，可嘗試將薄荷精油的抑菌和殺螨作用結(jié)合起來，進(jìn)行蘋果樹專用的植物源抑菌-殺螨制劑研究。

本文采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析了薄荷精油的化學(xué)成分，相對(duì)百分含量最高的是薄荷醇（32.16%），D-檸檬烯（16.44%）次之。而精油的毒性主要是醇、醛類化合物的存在[28]，也有可能是各種主要成分與其他次要活性成分發(fā)生某種類型的協(xié)同作用[29]。所以，薄荷精油能夠?qū)μO果全爪螨具有較強(qiáng)的生物活性可能與其中薄荷醇、檸檬烯含量較高且其他次要成分能夠?qū)χ饕煞制饏f(xié)同作用有關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)分析，薄荷醇主要由薄荷葉片產(chǎn)生[30]，是植物所產(chǎn)生的高揮發(fā)性精油，因?yàn)楸『纱季哂休^強(qiáng)的滲透作用，所以臨床上常用于幫助主體藥物更好地進(jìn)入靶標(biāo)被受體吸收[31-33]。而在農(nóng)業(yè)中，薄荷醇與其他活性成分相結(jié)合后，表現(xiàn)出與薄荷醇單體不同的理化性質(zhì)，能夠降低薄荷精油整體的表面張力，增加了其展布能力，促進(jìn)了害螨對(duì)薄荷精油的滲透、吸收，有利于破壞害螨的體壁結(jié)構(gòu)，溶解其角質(zhì)層[34]。本研究中由于薄荷醇的滲透作用，可能增強(qiáng)了薄荷精油對(duì)供試螨背部體表的滲透性，在觸殺和熏蒸處理中幫助薄荷精油的其它有效成分透過蟲體，與靶標(biāo)高效結(jié)合，提高有效成分的透皮吸收量。此外，薄荷醇屬于環(huán)類單萜的一種[35]，是典型的揮發(fā)性化合物，具有與甲基溴類似的熏蒸作用[36]，它們可以迅速滲透到昆蟲體內(nèi)阻礙或干擾其生理功能。除此之外，單萜類化合物還具有與除蟲菊酯（pyrethrin）類似的觸殺作用[37]。而檸檬烯作為一種小分子化合物被多篇文獻(xiàn)報(bào)道具有一定的抑菌、殺蟲作用，對(duì)一些細(xì)菌、線蟲、螨蟲均具有防治作用[38-40]，尤其對(duì)二斑葉螨和蘋果全爪螨均具有極強(qiáng)的生物活性[41]。胡軍華等[42]研究了柑橘提取物中主要?dú)Ⅱ钚猿煞?，證明檸檬烯殺螨活性高于檸檬醛、松油醇、芳樟醇、β-蒎烯，且檸檬烯作為一種天然成分，能減少傳統(tǒng)農(nóng)藥帶來的弊端。關(guān)于檸檬烯的殺蟲機(jī)理，有文獻(xiàn)提到檸檬烯通過破壞昆蟲體壁蠟質(zhì)層，導(dǎo)致水分喪失，同時(shí)體壁破壞使體液排泄，堵塞氣孔，干擾氧氣交換，從而使昆蟲窒息、失水死亡[43,44]。綜上，本研究中薄荷醇的促透作用可能增強(qiáng)了檸檬烯及其它活性成分被蘋果全爪螨吸收的速度和強(qiáng)度，使得高濃度的檸檬烯及其它活性成分進(jìn)入蘋果全爪螨體內(nèi)展開作用。此外，薄荷精油的化學(xué)成分鑒定結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道基本相同，如楊二妹等[45]通過同樣的方法測(cè)定了薄荷精油的化學(xué)成分，其主要成分為薄荷醇（21.17%）、檸檬烯（12.59%），與本文研究結(jié)果雖含量有差別，但主要成分一致，可能是由于原材料的產(chǎn)地及采集時(shí)間和提取部位不同所導(dǎo)致。由此可見，雖然薄荷精油的生物活性低于化學(xué)農(nóng)藥，但是薄荷精油中含有對(duì)蘋果全爪螨有效的活性成分，且具有低毒、環(huán)保的特點(diǎn)，是一種具有開發(fā)價(jià)值的天然殺螨劑。但本文僅在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)定了薄荷精油對(duì)蘋果全爪螨的生物活性，考慮到蘋果全爪螨在溫室環(huán)境中接觸到精油的含量及精油的作用方式及精油的光熱穩(wěn)定性可能與實(shí)驗(yàn)室操作環(huán)境存在差異，因此，下一步要進(jìn)行相關(guān)溫室試驗(yàn)，以便更精確客觀地評(píng)價(jià)薄荷精油對(duì)蘋果全爪螨的生物活性，從而為開發(fā)防治蘋果全爪螨的綠色植物源殺螨劑提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，研究薄荷精油的微膠囊或納米乳液制備，有效防止精油揮發(fā)，降低光熱因子對(duì)精油的影響。最后，將微膠囊或納米乳液制備技術(shù)與其他高新技術(shù)（如超臨界流體技術(shù)）相結(jié)合，開發(fā)出能滿足市場(chǎng)不同需求的產(chǎn)品，大力拓展薄荷精油的應(yīng)用領(lǐng)域。