周 輝， 牛 斌， 宓余強， 劉勇鋼， 李 萍

1 天津醫(yī)科大學第二人民醫(yī)院臨床學院， 天津 300070； 2 天津市第二人民醫(yī)院 a.肝病科， b.病理科，天津 300192

原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC，舊稱原發(fā)性膽汁性肝硬化）是一種慢性自身免疫性肝內(nèi)膽汁淤積性疾病。盡管PBC 比較少見，但它對患者的生活質(zhì)量和生存率有重大影響，且PBC 的全球患病率正呈現(xiàn)上升趨勢［1］。由于長期膽汁淤積，PBC 可出現(xiàn)進行性肝纖維化、肝硬化，最終可演變?yōu)榻K末期肝病。免疫學相關(guān)指標通常用于PBC 的評估，本文主要分析了血清補體C3在PBC患者中的變化及其與肝纖維化分期的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2012年1月—2022年10月于天津市第二人民醫(yī)院就診并行肝穿刺活檢的PBC 患者108 例。納入標準：（1）符合PBC 診斷和治療共識［2-3］的診斷標準；（2）進行肝穿刺活檢；（3）在肝活檢1周內(nèi)行血清學檢測；（4）臨床資料完整。排除標準：（1）合并其他慢性肝病，如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、重疊綜合征、原發(fā)性硬化性膽管炎、IgG4相關(guān)膽管炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、藥物性肝損傷等；（2）肝移植者；（3）有惡性腫瘤史或其他終末期疾病者；（4）孕產(chǎn)婦；（5）患有影響血補體C3水平的相關(guān)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、過敏性哮喘、非典型溶血性尿毒綜合征、遺傳性補體缺陷病等。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標 采用回顧性分析的方法，收集患者的一般人口學資料（年齡、性別、BMI 等）、臨床表現(xiàn)（乏力、納差、瘙癢等）、自身抗體指標（ANA、AMA、M2、Sp100、Gp210）、肝穿刺活檢1 周內(nèi)的血清學指標（PLT、ALT、AST、GGT、ALP、CHE、Alb、TBil、DBil、

IBil）、免疫功能指標（C3、C4、IgG、IgA、IgM）、肝纖維化指標（LSM）及無創(chuàng)肝纖維化評分［（AST/ALT比值指數(shù)（AAR）、AST/PLT 比值指數(shù)（APRI）和肝纖維化4 因子指數(shù)（FIB-4）］。

1.2.2 組織學評估 所有患者均在局部麻醉狀態(tài)下，經(jīng)超聲引導進行肝組織穿刺，標本長度為1.0～2.0 cm。用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，進行HE 染色、Masson 三色染色和網(wǎng)狀纖維染色等。肝組織切片由兩名對患者臨床特征毫不知情且經(jīng)驗豐富的病理學家獨立評估，采用Scheuer 評分系統(tǒng)［4］評估肝纖維化程度，其中≥S2 定義為顯著肝纖維化；≥S3定義為進展期肝纖維化；S4定義為肝硬化。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用xˉ±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法。不符合正態(tài)分布的計量資料用M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；多組間比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗，進一步兩兩比較采用Bonferroni法。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線）評估補體C3 對PBC 患者肝纖維化的診斷效能，ROC 曲線下面積（AUC）的比較采用Delong 法。采用Spearman 相關(guān)分析評估補體C3 與肝纖維化分期的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究共納入PBC患者108例，平均（53.6±10.4）歲?；颊咭耘跃佣?7 例（80.6%），自身抗體陽性102 例（94.4%）。肝纖維化分期S0 期5 例（4.6%），S1 期41 例（38.0%），S2 期23 例（21.3%），S3期25例（23.1%）、S4期14例（13.0%）?；颊叩钠渌Y料見表1。不同肝纖維化分期患者PLT、CHE、Alb、TBil、C3、IgA、LSM、AAR、APRI、FIB-4 比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）；進一步兩兩比較的結(jié)果顯示，C3、LSM 在S3 與S0/1 之間差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05），LSM 在S3 與S2 之間差異具有統(tǒng)計學 意 義（P＜0.05），PLT、CHE、Alb、C3、LSM、AAR、APRI、FIB-4 在S4 與S0/1 之間差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05），CHE、Alb、C3、IgA、LSM、AAR、FIB-4在S4 與S2 之間差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05），CHE、Alb、C3、AAR、FIB-4 在S4 與S3 之間差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）（表2）。

表2 PBC患者肝纖維化分期的一般特征Table 2 General characteristics of hepatic fibrosis stage in patients with PBC

2.2 免疫功能對PBC 不同肝纖維化分期的診斷效能 免疫功能指標中C3、C4、IgG、IgA 及IgM 診斷顯著肝纖維化的AUC 分別為0.731、0.529、0.583、0.520、0.562；免疫功能指標中C3、C4、IgG、IgA 及IgM 診斷進展期肝纖維化的AUC 分別為0.832、0.591、0.609、0.602、0.503；免疫功能指標中C3、C4、IgG、IgA 及IgM診斷肝硬化的AUC分別為0.968、0.687、0.604、0.739、0.638。綜上所述，補體C3 對PBC 不同肝纖維化分期的診斷效能最佳（圖1）。

圖1 免疫功能指標與不同肝纖維化分期的ROC曲線Figure 1 ROC curves of immune function indexes and different stages of liver fibrosis

2.3 ROC曲線診斷補體C3的性能分析 ROC曲線顯示顯著肝纖維化分期（≥S2）中C3 的最佳截斷值為1.445 g/L，診斷顯著肝纖維化的敏感度為87.1%，特異度為52.2%（AUC=0.731，95%CI：0.637～0.812）（圖1a）。因此，根據(jù)C3這一截斷值水平來比較PBC患者的一般特征。高補體C3組（C3＞1.445 g/L）PLT、GGT、ALP、Alb、TBil、C4明顯高于低補體C3組（C3≤1.445 g/L）（P值均＜0.05），高補體C3 組LSM、AAR、FIB-4 和纖維化分期明顯低于低補體C3 組（P值均＜0.05）。兩組間其他參數(shù)均無顯著差異（P值均＞0.05）。

ROC曲線顯示進展期肝纖維化分期（≥S3）中C3的最佳截斷值為1.235 g/L，診斷進展期肝纖維化的敏感度為82.1%，特異度為71.0%（AUC=0.832，95%CI：0.748～0.897）（圖1b）。因此，根據(jù)C3這一截斷值水平來比較PBC 患者的一般特征。高補體C3 組（C3＞1.235 g/L）PLT、GGT、CHE、Alb、C4 明顯高于低補體C3 組（C3≤1.235 g/L）（P值均＜0.05），高補體C3組IgG、LSM、AAR、FIB-4 和纖維化分期明顯低于低補體C3 組（P值均＜0.05）。兩組間其他參數(shù)均無顯著差異（P值均＞0.05）。

ROC 曲線顯示肝硬化分期（S4）中C3 的最佳截斷值為1.005 g/L，診斷肝硬化的敏感度為100%，特異度為91.5%（AUC=0.968，95%CI：0.915～0.992）（圖1c）。因此，根據(jù)C3這一截斷值水平來比較PBC患者的一般特征。高補體C3 組（C3＞1.005 g/L）PLT、CHE、Alb 和C4 明顯高于低補體C3 組（C3≤1.005 g/L）（P值均＜0.05），高補體C3 組IgA、LSM、AAR、APRI、FIB-4 和纖維化分期明顯低于低補體C3組（P值均＜0.05）。兩組間其他參數(shù)均無顯著差異（P值均＞0.05）（表3）。

表3 不同肝纖維化分期患者補體C3 水平的一般特征Table 3 General characteristics of complement C3 levels in patients with different stages of hepatic fibrosis

2.4 補體C3與肝纖維化分期、肝硬度及三種無創(chuàng)肝纖維化評分的相關(guān)性 補體C3與肝纖維化分期的相關(guān)系數(shù)為-0.565（P＜0.001），即肝纖維化分期越高，補體C3的水平越低（圖2a）。LSM、AAR、APRI 及FIB-4 與補體C3 的相關(guān)系數(shù)分別為-0.439（P＜0.001）、-0.323（P=0.001）、-0.206（P=0.033）和-0.291（P=0.002）（圖2b～e）。相比于3種無創(chuàng)肝纖維化評分，C3與LSM的相關(guān)性更高。

圖2 補體C3與肝纖維化分期、肝硬度及3種無創(chuàng)肝纖維化評分的相關(guān)性Figure 2 The correlation between C3 and liver fibrosis stage， LSM， AAR score， APRI score and FIB-4 score

2.5 補體C3 水平與不同肝纖維化分期的關(guān)系 單因素Logistic 回歸分析顯示PLT、CHE、C3、LSM、AAR和FIB-4 是與顯著肝纖維化相關(guān)的危險因素；PLT、CHE、Alb、TBil、IBil、C3、LSM、AAR 和FIB-4 是進展期肝纖維化相關(guān)的危險因素；PLT、CHE、Alb、IBil、C3、C4、IgA、LSM、AAR 和FIB-4是肝硬化相關(guān)的危險因素（表4）。為了避免冗余和最大限度的提高統(tǒng)計能力，以P＜0.1 為界限選取在單因素Logistic 回歸中有意義的指標代入多因素Logistic 回歸進一步計算。在分別調(diào)整了不同肝纖維化分期的纖維化相關(guān)混雜因素后，模型1、2、3、4中補體C3水平均為顯著肝纖維化、進展期肝纖維化和肝硬化的獨立預測因素，而LSM 是顯著肝纖維化和進展期肝纖維化的獨立預測因素（表5）。

表4 不同肝纖維化分期指標的單因素分析Table 4 Univariate analysis of different liver fibrosis staging indicators

表5 不同肝纖維化分期調(diào)節(jié)混雜因素后指標的多因素分析Table 5 Multi-factor analysis of indicators after adjustment of confounding factors for different liver fibrosis stages

2.6 C3、LSM 及C3 聯(lián)合LSM 對不同肝纖維化分期的診斷性能 C3、LSM及C3聯(lián)合LSM診斷顯著肝纖維化AUC 分別為0.731、0.764、0.811，最佳cut-off值分別為1.445、14.050、0.632，C3 聯(lián)合LSM 診斷顯著肝纖維化的AUC 與補體C3 的相比，差異具有統(tǒng)計學意義（Z=2.604，P=0.009）。C3、LSM及C3聯(lián)合LSM診斷進展期肝纖維化AUC 分別為0.832、0.911、0.941，C3 聯(lián)合LSM診斷進展期肝纖維化的AUC與補體C3的相比，差異具有統(tǒng)計學意義（Z=3.033，P=0.002）。C3、LSM 及C3 聯(lián)合LSM 診斷肝硬化AUC 分別為0.968、0.910、0.976，C3 聯(lián)合LSM 診斷肝硬化的AUC 與補體C3 相比，差異不具有統(tǒng)計學意義（Z=1.050，P=0.294），C3聯(lián)合LSM診斷肝硬化的AUC與LSM相比，差異具有統(tǒng)計學意義（Z=2.326，P=0.020）（表6）。

表6 C3、LSM及C3聯(lián)合LSM對不同肝纖維化分期的診斷性能Table 6 Diagnostic performance of C3， LSM and C3 combined with LSM for different liver fibrosis stages

3 討論

目前，PBC 的年發(fā)病率為0.84/10 萬～2.75/10 萬，患病率為1.91/10 萬～40.2/10 萬，且PBC 的全球患病率呈不斷上升趨勢［1，5］。PBC 患者早期無明顯癥狀，主要表現(xiàn)為血清ALP、GGT 和AMA 的升高，部分患者會出現(xiàn)瘙癢、疲勞、黃疸等癥狀［6］，與本研究調(diào)查結(jié)果一致。PBC 患者的臨床預后與肝纖維化分期程度密切相關(guān)，如果沒有得到早期診斷和有效的治療，容易發(fā)展成肝硬化，甚至肝衰竭［7］。因此，尋找能有效評估肝纖維化程度的方法對PBC 的治療及病情控制具有重要意義。目前，肝活檢是評估PBC 肝纖維化分期的金標準，但其為有創(chuàng)操作且花費高，臨床應(yīng)用受到限制。一些肝纖維化無創(chuàng)診斷模型，如AAR、APRI 和FIB-4 等，以及瞬時彈性成像技術(shù)對肝纖維化有較高的診斷價值，然而上述模型都需要進一步完善。有研究［8］發(fā)現(xiàn)肝硬化患者的Child評分與補體C3水平呈負相關(guān)。還有研究［9-10］證實血清補體C3 水平能評估慢性乙型肝炎相關(guān)分期的嚴重程度，低補體C3 水平的失代償性肝硬化患者容易發(fā)生慢加急性肝衰竭。這些研究表明補體C3 可能與肝纖維化分期相關(guān)，然而目前的研究主要關(guān)注于評估慢性乙型肝炎相關(guān)肝纖維化分期，關(guān)于PBC 患者肝纖維化程度評估的研究較少?；诖?，本研究探討了血清補體C3 對PBC 患者肝纖維化程度的診斷價值。

補體是存在于正常人和動物血清及組織液中的一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)。補體的激活有3種途徑：經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑［11］。生理情況下能參與機體的抗感染免疫及擴大體液免疫反應(yīng)，促進組織修復。當補體系統(tǒng)過度激活時，也可介導炎癥反應(yīng)，導致組織損傷，甚至器官衰竭。C3 是補體系統(tǒng)的中心分子，它的激活對于該系統(tǒng)執(zhí)行的所有功能至關(guān)重要［12-13］。血清中存在的大部分補體蛋白是由肝臟產(chǎn)生和分泌的，其中C3 由肝細胞產(chǎn)生［14］。PBC是一種以小葉內(nèi)膽管為靶點的自身免疫性肝臟疾病，其特點是超過90%的患者中存在自身抗體和高血清IgM［15］。然而，補體在PBC 中的作用只在有限數(shù)量的研究中被描述。根據(jù)本研究結(jié)果推測，補體C3 評估PBC 相關(guān)肝纖維化的可能機制有兩個方面，分別是補體的生成減少和消耗增多。補體生成減少：已有研究［16-17］表明PBC患者處于急性炎癥狀態(tài)時，肝細胞出現(xiàn)明顯損傷，補體蛋白的水平會比健康人群高。而持續(xù)的炎癥刺激導致膽管破壞、膽管形態(tài)異常和分泌功能障礙，出現(xiàn)膽汁淤積，肝細胞損傷進一步加重，容易發(fā)展成纖維化和肝硬化［18］。當肝纖維化發(fā)生時，肝細胞功能嚴重受損，補體蛋白產(chǎn)生減少［19］。補體的消耗增多：PBC 患者在發(fā)生肝損傷時會伴隨免疫應(yīng)答反應(yīng)，即生成抗原抗體復合物（IC），從而觸發(fā)補體系統(tǒng)的激活和補體成分的過度消耗［10］。但有研究［20］指出，PBC 患者膽管內(nèi)無補體C3的沉積，這表明補體C3可能沒有通過經(jīng)典途徑被激活而直接參與到PBC 患者膽管損傷的過程。這可能是因為PBC 患者膽管中IC 沉積，誘發(fā)更多的C3 與其結(jié)合，同時黏附于表達補體受體1 的紅細胞或血小板，然后運送至巨噬細胞被吞噬或清除，即免疫黏附作用導致血液循環(huán)中的補體C3水平下降。

本研究結(jié)果顯示，隨著肝纖維化程度的加重，補體C3 的水平呈下降趨勢。相關(guān)性分析也證實了這一現(xiàn)象，補體C3水平與肝纖維化分期呈負相關(guān)。這與以往的研究結(jié)果一致［21］。此外，補體C3 水平與LSM、AAR、APRI 及FIB-4 纖維化評分也呈負相關(guān)。ROC 曲線分析顯示，免疫功能指標中補體C3對PBC不同肝纖維化分期的診斷效能最佳。多因素Logistic 回歸分析顯示補體C3水平為顯著肝纖維化、進展期肝纖維化和肝硬化的獨立預測因素。因此，可以合理推斷補體C3水平可以在一定程度上評估PBC 患者的肝纖維化程度。此外，ROC 曲線分析顯示C3 聯(lián)合LSM 診斷PBC患者顯著肝纖維化、進展期肝纖維化的AUC與補體C3的相比，差異具有統(tǒng)計學意義；C3 聯(lián)合LSM 診斷PBC患者肝硬化的AUC與LSM的相比，差異具有統(tǒng)計學意義。這提示C3 聯(lián)合LSM 能進一步提高補體C3 或者LSM在診斷PBC患者肝纖維化分期程度時的效能。

綜上所述，補體C3 作為一種易獲取且不易受藥物因素影響的血清學指標，在評估PBC 患者肝纖維化程度方面具有重要的臨床價值，C3 聯(lián)合LSM 后診斷效能更加顯著。本研究局限性：（1）是一項單中心、小樣本、回顧性研究，患者的選擇可能出現(xiàn)偏差。未來應(yīng)開展多中心、大樣本、前瞻性研究進一步驗證補體C3水平及C3聯(lián)合LSM對PBC患者肝纖維化程度的診斷價值。（2）目前的研究結(jié)果不能準確的判斷補體C3水平和PBC 患者肝纖維化發(fā)生的因果關(guān)系。（3）PBC目前還是一種罕見病，臨床收集的樣本量較少，尤其是肝穿刺確診的PBC 患者樣本量更少，所以統(tǒng)計結(jié)果可能會出現(xiàn)偏倚。

倫理學聲明：本研究方案于2019年12月25日經(jīng)由天津市第二人民醫(yī)院倫理委員會審批，批號：［2019］58。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：周輝負責收集數(shù)據(jù)、資料分析及撰寫論文；牛斌負責收集數(shù)據(jù)和指導統(tǒng)計分析；宓余強負責指導文章撰寫；劉勇鋼負責病理評分；李萍負責課題設(shè)計和最后定稿。