楊夢然,楊成林,吳 悠,王思琪,孔祥祎,寧 燦,肖文廣,范 慧, 鄔 靜*,袁志航*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,長沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜禽保健湖南省工程研究中心,長沙 410128)

霉菌毒素是霉菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物,會對人和動物產(chǎn)生急性或慢性毒性。桔青霉素(citrinin, CTN)是由青霉屬、曲霉屬和紅曲霉屬等菌株產(chǎn)生的,廣泛存在于各類農(nóng)產(chǎn)品中[1],對肝、腎、胃腸道、免疫和生殖系統(tǒng)具有潛在的毒性作用[2-4]。腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要器官,桔青霉素污染的食物攝入機體時,胃腸道首先對其進行吸收,腸道健康嚴重受損[5]。研究表明,桔青霉素的攝入能興奮試驗動物小腸平滑肌,誘導(dǎo)出血性腸炎及腹瀉甚至導(dǎo)致動物死亡[6-7]。桔青霉素主要通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及細胞凋亡發(fā)揮其毒性作用[8]。有研究表明,桔青霉素可通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)介導(dǎo)的細胞凋亡對人腸道HCT116細胞產(chǎn)生毒性作用,引發(fā)腸道損傷[9]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種多功能細胞器,參與蛋白質(zhì)合成,脂質(zhì)代謝及維持Ca2+穩(wěn)態(tài)。有研究通過體外培養(yǎng)豬腸上皮細胞,并在體內(nèi)對斷奶仔豬的空腸組織進行檢測,發(fā)現(xiàn)腸道屏障功能障礙的發(fā)生與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)[10]。張同坤等[11]的研究證實,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在嘔吐毒素誘導(dǎo)的腸細胞屏障功能障礙中發(fā)揮著重要作用。然而,桔青霉素是否通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損害腸屏障功能還有待研究。因此,本研究通過飼喂小鼠不同濃度桔青霉素,探討其對腸屏障功能的影響,并給小鼠注射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑,探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在桔青霉素誘導(dǎo)腸屏障功能障礙中的作用,為尋找桔青霉素的毒性作用靶點提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗所用SPF級昆明小鼠(雄性)購自湖南省長沙市斯萊克景達實驗動物有限公司,體重(27.8±1.5)g,試驗期間小鼠自由采食和飲水。適應(yīng)性飼喂1周后將24只小鼠隨機分為4組(n=6):即空白組(5%乙醇)、低CTN組(1.25 mg·kg-1)、中CTN組(5 mg·kg-1)、高CTN組(20 mg·kg-1),分別給小鼠灌胃不同劑量桔青霉素,14 d后采集小鼠血清及空腸進行相關(guān)檢測。

將32只SPF級昆明雄鼠隨機分為4組,分別為對照組(5%乙醇)、桔青霉素中劑量(5 mg·kg-1)組、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA(240 mg·kg-1)組和桔青霉素+4-PBA組。對照組給小鼠灌胃5%乙醇;桔青霉素中劑量組給小鼠灌胃5 mg·kg-1桔青霉素;4-PBA組小鼠經(jīng)腹腔注射4-PBA預(yù)處理后,用5%乙醇對小鼠進行灌胃;4-PBA+桔青霉素組小鼠經(jīng)腹腔注射4-PBA預(yù)處理后,用5 mg·kg-1桔青霉素對小鼠進行灌胃;試驗持續(xù)14 d。

1.2 主要試劑

桔青霉素 (普瑞邦,中國);4-PBA(MedChemExpress,中國);MDA、SOD、CAT、T-AOC、BCA檢測試劑盒(南京建成,中國);TUNEL、DHE、DAPI、HE染液(賽維爾,中國);DAO、D-LA、ET的ELISA試劑盒,二抗(艾方,中國);TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料SYBR Green(艾科瑞,中國);增強化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)(翌圣,中國);Bax、Bcl-2、GRP78、CHOP、IRE1α、ATF6、β-actin一抗(Proteintech,中國)。

1.3 HE染色觀察空腸病變

新鮮空腸組織用4%多聚甲醛固定,經(jīng)脫水透明、包埋、切片后用蘇木素和伊紅染色,脫水封片后顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.4 TUNEL法檢測細胞凋亡

在HE切片的基礎(chǔ)上,用TUNEL試劑盒對切片進行染色,將TUNEL陽性細胞染成綠色,以此評估細胞凋亡率。

1.5 檢測空腸中ROS含量

新鮮空腸組織經(jīng)液氮速凍后進行包埋及切片處理,滴加ROS染液DHE于37 ℃避光孵育30 min,后用DAPI染液避光孵育10 min,經(jīng)抗熒光淬滅封片劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 ELISA檢測血清中DAO、D-LA、ET水平

小鼠經(jīng)眼球采血收集血清,按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中DAO、D-LA、ET水平。

1.7 檢測空腸氧化指標(biāo)

根據(jù)南京建成生物工程公司檢測試劑盒說明書,稱取0.1 g空腸組織,用預(yù)冷的生理鹽水按1∶9的比例稀釋,經(jīng)勻漿并離心后取上清進行CAT、T-SOD、T-AOC、MDA的檢測。

1.8 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測空腸緊密連接相關(guān)基因表達

0.1 g 空腸組織加至預(yù)冷的TRIzol 中以提取RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明,將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA,cDNA與上、下游引物及熒光染料SYBR green充分混合后于PCR儀進行擴增,以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法對緊密連接相關(guān)基因的相對表達量進行計算。試驗所涉及的相關(guān)引物信息如表1所示。

表1 相關(guān)引物信息Table 1 The relative primers information

1.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達

用RIPA裂解液按照RIPA∶PMSF=100∶1的比例提取空腸組織中的總蛋白,經(jīng)BCA試劑盒進行蛋白定量。每組等量的蛋白上樣后進行電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜,將膜用5%脫脂牛奶封閉后轉(zhuǎn)入TBST中洗3次,一抗4 ℃過夜,TBST洗滌3次后二抗室溫孵育1 h,TBST洗滌10 min×3次完成后,配置ECL顯影液進行顯影及圖像分析。

1.10 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

經(jīng)3次獨立重復(fù)試驗后,用GraphPad Prism 9對試驗數(shù)據(jù)進行作圖并用SPSS 23.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(X±SEM)”表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 桔青霉素對小鼠空腸組織病理損傷的影響

HE染色觀察桔青霉素對小鼠空腸組織的病理損傷,結(jié)果如圖1所示,空白組空腸黏膜完整,絨毛排列整齊,腸上皮細胞形態(tài)清晰,排列緊密,大小均勻,無明顯病理變化;桔青霉素低、中、高劑量組腸絨毛明顯萎縮、脫落,基底部腸上皮細胞排列紊亂,染色加深,腸上皮細胞擠壓明顯。

藍色箭頭:腸絨毛萎縮、脫落;橙色箭頭:基底部腸上皮細胞排列紊亂;綠色箭頭:基底部腸上皮細胞染色加深;紅色箭頭:腸絨毛間隙增大。黑色箭頭:腸上皮細胞擠壓明顯。比例尺=50 μm。下同 Blue arrows: Atrophy and shedding of intestinal villi; Orange arrows: Disorganization in basal portions of intestinal epithelial cells; Green arrows: Deeply stained in basal portions of intestinal epithelial cells; Red arrows: Increased gaps of intestinal villi; Black arrows: Obvious extrusion of intestinal epithelial cells. Scale bar=50 μm. The same below圖1 桔青霉素對小鼠空腸損傷的組織學(xué)觀察(20×)(掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖)Fig.1 Histological observation of citrinin induced jejunum injury in mice(20×)(Scan the OSID code on the homepage of the article to view the color map)

2.2 桔青霉素對小鼠空腸化學(xué)屏障的影響

進一步探討桔青霉素對小鼠空腸屏障功能的影響,結(jié)果如圖2所示,與空白組相比,經(jīng)低、中、高劑量桔青霉素處理后,小鼠血清中D-LA和ET的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01),中、高劑量桔青霉素顯著增加了小鼠血清DAO(P<0.05)。

2.3 桔青霉素對小鼠空腸組織氧化損傷的影響

用不同劑量桔青霉素對小鼠進行灌胃處理,取空腸組織檢測抗氧化酶活性,結(jié)果如圖3所示,與空白組相比,桔青霉素中劑量組CAT活性顯著降低(P<0.05),桔青霉素高劑量組總SOD活性顯著降低(P<0.05),且經(jīng)低、中、高劑量桔青霉素處理后,氧化產(chǎn)物ROS的生成極顯著增多(P<0.01)。

2.4 4-PBA對桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

與對照組相比,*. P<0.05表示差異顯著;**. P<0.01表示差異極顯著。下同 Compared with the control group.*. P<0.05 means the difference is significant; **. P<0.01 means the difference is extremely significant. The same below圖2 桔青霉素對小鼠血清DAO(A)、D-LA(B)、ET(C)的影響Fig.2 Effects of citrinin on the content of DAO(A), D-LA(B), ET(C) in mice serum

A. 空腸中CAT的活性;B. 空腸中SOD的活性;C. ROS的定量分析;D. 空腸中ROS的熒光圖。比例尺=50 μmA. The activity of CAT in mice jejunum; B. The activity of SOD in mice jejunum; C. Quantitative analysis of ROS; D. The fluorescence images of ROS in mice jejunum. Bar=50 μm圖3 桔青霉素對小鼠空腸氧化損傷的影響Fig.3 Effects of citrinin on oxidative damage in mice jejunum

小鼠經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA預(yù)處理后,采用Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果如圖4所示,與空白組相比,經(jīng)5 mg·kg-1桔青霉素處理后,小鼠空腸組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白肌醇激酶(inosital-requiring enzyme-1,IRE1)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose regulating protein78,GRP78/Bip)和轉(zhuǎn)錄因子C/EBP(C/EBP-homologous protein, CHOP)表達顯著增強(P<0.01),4-PBA單獨處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達減弱(P<0.05)。

2.5 4-PBA對桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸細胞凋亡的影響

A.相關(guān)蛋白的蛋白免疫印跡圖;B.IRE1蛋白表達的灰度值分析;C.ATF6 蛋白表達的灰度值分析;D.GRP78 蛋白表達的灰度值分析;E.CHOP 蛋白表達的灰度值分析。與對照組相比,*、**表示差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01);與桔青霉素組相比,#、##表示差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。下同A. Western blot of related proteins; B. Gray value analysis of IRE1 protein; C. Gray value analysis of ATF6 protein; D. Gray value analysis of GRP78 protein; E. Gray value analysis of CHOP protein. Compared with the control group, *,** mean the difference is significant(P<0.05) or extremely significant (P<0.01); Compared with the citrinin group, #,## mean the difference is significant(P<0.05) or extremely significant (P<0.01). The same as below圖4 4-PBA對桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響Fig.4 Effects of 4-PBA on expression of ERS-related protein induced by citrinin in mice jejunum

給小鼠腹腔注射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA,TUNEL法檢測細胞凋亡率。結(jié)果如圖5A～B所示,與空白組相比,經(jīng)5 mg·kg-1g桔青霉素處理后,小鼠空腸組織凋亡細胞極顯著增多(P<0.01),4-PBA單獨處理組凋亡細胞無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組凋亡細胞極顯著減少(P<0.01)。此外,對細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2進行檢測,結(jié)果如圖5C～D所示,與空白組相比,經(jīng)5 mg·kg-1桔青霉素處理后,Bax/Bcl-2顯著升高(P<0.05),4-PBA單獨處理組Bax/Bcl-2無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組Bax/Bcl-2顯著降低(P<0.05)。

2.6 4-PBA對桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸氧化應(yīng)激的影響

小鼠經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA預(yù)處理后,檢測其空腸組織中抗氧化酶CAT、T-SOD、T-AOC的活性,氧化產(chǎn)物MDA含量及ROS的釋放。結(jié)果如圖6所示,與空白組相比,經(jīng)5 mg·kg-1桔青霉素處理后,小鼠空腸組織CAT、T-AOC活性顯著降低(P<0.05或P<0.01),總SOD活性有下降的趨勢,MDA含量及ROS的釋放極顯著增多(P<0.01),4-PBA單獨處理組抗氧化酶、MDA含量及ROS釋放無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組CAT、T-SOD活性有升高的趨勢,T-AOC活性極顯著升高(P<0.01),MDA含量及ROS的釋放極顯著減少(P<0.01)。

2.7 4-PBA對桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸組織病理損傷的影響

預(yù)先腹腔注射4-PBA至小鼠體內(nèi),觀察小鼠空腸組織的病理損傷。HE結(jié)果如圖7所示,與空白組相比,經(jīng)5 mg·kg-1桔青霉素處理后,腸黏膜完整性受到破壞,大量腸絨毛斷裂、脫落,基底部腸上皮細胞染色加深,排列疏松、紊亂,4-PBA單獨處理組腸黏膜較為完整,腸絨毛排列緊密,偶見腸絨毛斷裂,基底部腸上皮細胞未見染色加深。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組腸絨毛排列較CTN組稍緊密,少見腸絨毛脫落。

A. TUNEL檢測細胞凋亡率;B. 細胞凋亡率的定量分析;C. Bax、Bcl-2的蛋白免疫印跡圖;D. Bax/Bcl-2 的比值。比例尺=50 μmA. Apoptosis rate detected by TUNEL; B. Quantitative analysis of apoptosis rate; C. Western blot of Bax and Bcl-2; D. The ratio of Bax/Bcl-2. Bar=50 μm圖5 4-PBA對桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸細胞凋亡的影響Fig.5 Effects of 4-PBA on cell apoptosis induced by citrinin in mice jejunum

2.8 4-PBA對桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸物理屏障的影響

經(jīng)腹腔注射4-PBA后,檢測小鼠空腸中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表達,結(jié)果如圖8所示,與空白組相比,經(jīng)5 mg·kg-1桔青霉素處理后,小鼠空腸組織ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表達顯著減少(P<0.01或P<0.05),4-PBA單獨處理組ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表達無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表達得到恢復(fù)(P<0.01)。

2.9 4-PBA對桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸化學(xué)屏障的影響

小鼠經(jīng)4-PBA預(yù)處理后,檢測其血清中DAO、D-LA、ET的含量。結(jié)果如圖9所示,與空白組相比,經(jīng)5 mg·kg-1桔青霉素處理后,小鼠血清中DAO、D-LA、ET的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01),4-PBA單獨處理組DAO、D-LA、ET的含量無明顯變化。與單獨桔青霉素組相比,4-PBA+CTN組ET的含量顯著降低(P<0.05),DAO、D-LA的含量有降低的趨勢。

2.10 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路與腸道損傷的相關(guān)性分析

圖7 4-PBA對桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸組織損傷的影響(20×)Fig.7 Effects of 4-PBA on histological damage induced by citrinin in mice jejunum(20×)

圖8 4-PBA對桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸物理屏障的影響Fig.8 Effects of 4-PBA on physical barriers induced by citrinin in mice jejunum

圖9 4-PBA對桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸化學(xué)屏障的影響Fig.9 Effects of 4-PBA on chemical barriers induced by citrinin in mice jejunum

圖10 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與腸道損傷的相關(guān)性分析Fig.10 Correlation analysis in endoplasmic reticulum stress and intestinal injury

前面的研究已經(jīng)證實,桔青霉素可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路,誘導(dǎo)腸道發(fā)生氧化應(yīng)激,損害腸道屏障功能。為進一步證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路在桔青霉素誘導(dǎo)腸道屏障功能障礙及氧化應(yīng)激中的作用,對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和腸道屏障功能相關(guān)指標(biāo)、相關(guān)抗氧化酶及氧化產(chǎn)物進行Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果如圖10所示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路中CHOP與ROS及DAO呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與T-AOC和Occludin呈顯著負相關(guān)(P<0.05),與ZO-1呈極顯著負相關(guān)(P<0.01);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路中GRP78與ET、ROS呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與CAT呈極顯著負相關(guān)(P<0.01),與T-AOC呈顯著負相關(guān)(P<0.05);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路中ATF6與ROS和DAO呈顯著正相關(guān)(P<0.05);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路中IRE1與ZO-1及T-AOC呈顯著負相關(guān)(P<0.05),與ET呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與MDA呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。以上結(jié)果說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路與腸道氧化應(yīng)激、腸道屏障功能障礙有顯著相關(guān)性,進一步證實桔青霉素通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡,降低抗氧化酶活性,促進ROS及MDA的積累,從而使小鼠腸道屏障功能發(fā)生障礙。

3 討 論

桔青霉素分布范圍廣,毒性大,其廣泛存在于各類蔬菜、飼料及谷物中,對人和動物造成極大威脅。胃腸道是保護機體免受霉菌毒素及其他環(huán)境污染物損害的重要屏障,且有害物質(zhì)在進入機體前首先要經(jīng)胃腸道,因此,腸道中的霉菌毒素含量往往高于其他組織,表現(xiàn)為腸道發(fā)生氧化應(yīng)激,其屏障功能受損及結(jié)構(gòu)完整性被破壞[12-13]。本研究中,給小鼠灌胃不同劑量桔青霉素后,空腸絨毛萎縮斷裂,腸上皮細胞受損。高億清等[12]的研究顯示,給小鼠飼喂霉變玉米,其空腸絨毛脫落,上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)受損,這本試驗結(jié)果一致。

研究證實,霉菌毒素可破壞腸上皮的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性從而誘導(dǎo)腸道的屏障功能受損[14]。當(dāng)腸道化學(xué)屏障功能受損時,腸道通透性增加,DAO、D-LA、ET釋放入血,血液中DAO、D-LA、ET含量升高,檢測血清中DAO、D-LA、ET的含量可用于反映腸屏障功能。與此同時,緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1被認為與腸道通透性密切相關(guān),廣泛用于評價腸道物理屏障[15-16]。婁文芳等[17]通過在蛋雞飼糧中添加DON和T-2毒素,發(fā)現(xiàn)DON和T-2毒素能使蛋雞血清中ET、DAO含量增多,腸道屏障被破壞。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn),黃曲霉毒素B1處理的小鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達顯著降低。這些研究為本研究中桔青霉素顯著提高小鼠血清中DAO、D-LA、ET含量,降低ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA表達,引起腸道屏障功能發(fā)生障礙的結(jié)果提供了佐證。

據(jù)報道,在霉菌毒素致腸道損傷的過程中,氧化應(yīng)激可引起腸上皮細胞損傷和屏障功能障礙[19]。有研究表明,DON能夠誘導(dǎo)仔豬腸道發(fā)生氧化應(yīng)激,損害小腸屏障功能,最終對仔豬健康造成嚴重威脅[20]。類似地,本研究發(fā)現(xiàn)桔青霉素通過降低小鼠空腸組織抗氧化酶總SOD和CAT活性,增加氧化產(chǎn)物ROS、MDA的生成促進氧化應(yīng)激,從而使空腸屏障功能發(fā)生障礙。

目前,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)已被證實是參與維持腸道健康的重要細胞器[21]。當(dāng)機體受到毒素、氧化應(yīng)激等因素刺激時,蛋白質(zhì)加工受阻,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被打破,從而誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,同時,持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將最終激活細胞凋亡[22-23]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡主要受肌醇需要酶 1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)、雙鏈 RNA 依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER-resident kinase,PERK)和活化轉(zhuǎn)錄因子 6α(activating transcription factor-6,ATF6α)這3個蛋白調(diào)控,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激時,IRE1α、PERK、ATF6α與GRP78解離而被激活,共同促進其下游凋亡因子C/EBP 同源蛋白(C/EBP homology protein,CHOP)的表達,CHOP表達的上調(diào)進一步調(diào)控相關(guān)凋亡蛋白Bax及Bcl-2的表達,并同時激活Caspase-12,誘發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細胞凋亡[24-26]。研究表明,桔青霉素可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,促進細胞凋亡從而損傷人腸道上皮細胞[9]。為進一步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在桔青霉素誘導(dǎo)小鼠空腸損傷中的作用,本研究添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA預(yù)處理小鼠,結(jié)果顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白IRE1α、GRP78、CHOP、ATF6、細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2的表達受到抑制,細胞凋亡率減少,說明桔青霉素通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路促進空腸凋亡,從而誘導(dǎo)空腸損傷。此外,有研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA可以提高糖尿病大鼠的抗氧化酶活性,降低脂質(zhì)過氧化水平[27]。這也與本試驗結(jié)果相符:與桔青霉素組相比,用4-PBA預(yù)處理小鼠后可減輕空腸組織的氧化應(yīng)激水平,對桔青霉素誘導(dǎo)的空腸損傷產(chǎn)生保護作用。Cui等[28]通過研究發(fā)現(xiàn),IPEC-J2細胞經(jīng)熱應(yīng)激處理后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路被激活,腸道上皮細胞屏障功能受損,提示腸道屏障功能受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路調(diào)控。本研究通過Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路與氧化應(yīng)激、腸道屏障功能相關(guān)指標(biāo)存在顯著相關(guān)性,4-PBA預(yù)處理可抑制桔青霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的激活,緩解氧化應(yīng)激和細胞凋亡,保護腸道屏障功能免受桔青霉素的損害。綜上所述,這些結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路在桔青霉素誘導(dǎo)的腸道損傷中起重要調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

本研究證實,桔青霉素對小鼠空腸有損傷作用,隨著桔青霉素劑量的升高,小鼠空腸絨毛斷裂,腸上皮細胞損傷明顯,血清中DAO、D-LA、ET的含量升高,致其腸道屏障受損,空腸抗氧化酶SOD、CAT活性降低,ROS生成增多,說明桔青霉素可誘導(dǎo)小鼠空腸屏障功能障礙且誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生。該損傷受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路調(diào)控,添加4-PBA預(yù)處理后,小鼠空腸細胞凋亡率減少,相關(guān)抗氧化酶活性及緊密連接蛋白的表達增強,血清中DAO、D-LA、ET的含量減少,進一步證實桔青霉素能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞凋亡,促進空腸結(jié)構(gòu)損傷及腸道屏障功能障礙。