張蕾，何建成，李小茜，沈琳，曹雪濱，王代明

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203

2. 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院（河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院），河南 洛陽(yáng) 471003

3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 201203

4. 中國(guó)人民解放軍252醫(yī)院，河北 保定 071000

5. 上海市公惠醫(yī)院，上海 201203

心力衰竭（HF）常見(jiàn)于多種心血管疾病終末期，發(fā)病率逐年攀升。盡管近年來(lái)新技術(shù)、新治療方法不斷出現(xiàn)，HF 的治療有了極大改善，但其死亡率仍居高不下[1]。中醫(yī)中藥防治本病的機(jī)制與方法得到廣泛關(guān)注，證候研究尤顯重要。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HF 的中醫(yī)病因病機(jī)以虛實(shí)夾雜為特點(diǎn)，氣虛血瘀證為其臨床最為常見(jiàn)的證候之一[2]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子（GATA4）是調(diào)控心肌基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在心臟中高表達(dá)，是多種刺激和信號(hào)通路的下游效應(yīng)因子，參與心肌肥厚、HF 的進(jìn)程[3-4]。本研究在病證結(jié)合原則的指導(dǎo)下，選取HF 氣虛血瘀證為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定血清樣本中GATA4 含量，綜合運(yùn)用多種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，初步擬定本病氣虛血瘀證的診斷界值，旨在全面促進(jìn)本病的證候標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化進(jìn)程，為臨床辨證論治提供參考與依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2021 概要》[1]中HF 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；心功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按美國(guó)紐約心臟協(xié)會(huì)（NYHA）心功能分級(jí)[5]。

1.2 辨證標(biāo)準(zhǔn)參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[6]對(duì)心力衰竭氣虛血瘀證的辨證標(biāo)準(zhǔn)，符合下列主癥加次癥各2 項(xiàng)及以上。主癥：氣短/喘息、乏力、心悸。次癥：倦怠懶言，活動(dòng)易勞累；自汗；語(yǔ)聲低微；面色/口唇紫暗。舌脈：舌質(zhì)暗（或有瘀斑、瘀點(diǎn)或舌下脈絡(luò)迂曲青紫），苔薄白，脈沉、細(xì)、澀或虛無(wú)力。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)符合HF 診斷標(biāo)準(zhǔn)，且以冠心病為原發(fā)病的HF；年齡18～85 歲；臨床資料齊全；簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)合并急性心肌梗死、心源性休克、嚴(yán)重心律失常伴有血流動(dòng)力學(xué)改變者；并發(fā)感染者；合并嚴(yán)重的肝功能不全；合并血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤者；妊娠或哺乳期婦女；精神病、傳染病患者。

1.5 一般資料觀察對(duì)象為2019 年12 月—2021 年6 月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院心內(nèi)科住院患者。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)及HF 中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，選入HF 氣虛血瘀證患者30 例，選取30 例上海中醫(yī)藥大學(xué)教職工體檢人員作為健康對(duì)照組。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018LCSY447）。

2 研究方法

2.1 臨床資料收集與數(shù)據(jù)錄入記錄入組患者年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、NYHA 心功能分級(jí)、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）等臨床資料。采用雙人雙機(jī)獨(dú)立數(shù)據(jù)錄入整理的方式，再統(tǒng)一進(jìn)行數(shù)據(jù)核對(duì)及邏輯檢查，找出錯(cuò)誤并及時(shí)更正，如遇到意見(jiàn)不能統(tǒng)一的情況，通過(guò)聯(lián)系數(shù)據(jù)錄入者、調(diào)取原始病例等方式予以核查。

經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的臨床醫(yī)師根據(jù)前期制定的納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)住院HF 患者進(jìn)行篩選入組，由2 位或以上副主任醫(yī)師對(duì)入組的HF 患者進(jìn)行中醫(yī)辨證分型復(fù)核，規(guī)范HF 患者臨床資料信息，協(xié)調(diào)處理資料信息及樣本采集過(guò)程中出現(xiàn)的特殊情況。

2.2 血清樣本采集和指標(biāo)檢測(cè)方法入組患者于清晨空腹采靜脈血3 mL 置于EDTA 抗凝管中，4 ℃靜置2 h 后，3 000 r/min 離心10 min，吸取上清至離心管，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清樣本中GATA4 含量。GATA4 試劑盒廠家及貨號(hào)：上海美軒生物科技有限公司，貨號(hào)：MEXN- H0832，測(cè)量范圍為250～8 000 pg/mL。具體實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料需進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（構(gòu)成比）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)，2 組均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，則采用Mann-WhitneyUtest 檢測(cè)。3 組及以上均數(shù)比較采用單因素方差分析ANOVA 檢驗(yàn)，若P＜0.05 則采用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，則采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。應(yīng)用Pearman、Spearman 相關(guān)分析方法分析鈣調(diào)磷酸酶（CaN）與B 型鈉尿肽（BNP）、NYHA 心功能分級(jí)、LVEF 的相關(guān)性。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用Pearman 相關(guān)分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料或等級(jí)資料采用Spearman 相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用受試者工作特征曲線（ROC）確定證候的診斷閾值。以敏感度為縱軸，1-特異性為橫軸，繪制HF氣滯血瘀證的ROC 曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC）來(lái)判斷診斷價(jià)值。結(jié)合ROC 曲線下面積，依據(jù)Youden指數(shù)最大，即（敏感度+特異性-1）達(dá)到最大時(shí)，所對(duì)應(yīng)的值為該證候的診斷界值。

4 研究結(jié)果

4.1 一般資料比較見(jiàn)表1。HF 氣滯血瘀證患者中25 例有冠心病，20 例有高血壓病，7 例有糖尿病，還有3 例高血脂癥。健康對(duì)照組和HF 氣虛血瘀證組在年齡、性別、舒張壓上，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但HF 氣虛血瘀證組收縮壓、心率高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 一般資料比較

4.2 GATA4 在HF 氣虛血瘀證組患者血清中的表達(dá)見(jiàn)表2、表3。與健康對(duì)照組比較，HF 氣虛血瘀證組患者血清中GATA4 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨NYHA 心功能分級(jí)的增加，HF 氣虛血瘀證組患者血清中GATA4 含量逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 2 組GATA4 蛋白含量比較（）pg/mL

表2 2 組GATA4 蛋白含量比較（）pg/mL

注：①與健康對(duì)照組比較，P＜0.05

?

表3 NYHA 心功能分級(jí)GATA4 蛋白含量比較（） pg/mL

表3 NYHA 心功能分級(jí)GATA4 蛋白含量比較（） pg/mL

注：①與Ⅱ級(jí)比較，P＜0.05；②與Ⅲ級(jí)比較，P＜0.05

?

4.3 GATA4 與NYHA 心功能分級(jí)、BNP、LVEF關(guān)系HF 中GATA4 與NYHA 心功能分級(jí)呈正相關(guān)性（r=0.914，P＜0.001），與BNP 含量呈正相關(guān)性（r=0.697，P＜0.001），與LVEF 水平呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.592，P=0.001）。

4.4 GATA4 對(duì)HF 氣虛血瘀證的診斷界值見(jiàn)圖1。本研究繪制ROC 曲線初步擬探討GATA4 對(duì)HF 虛血瘀證的診斷界值，AUC 為0.92，95%CI[0.83，1.00]（P＜0.001），臨界值為0.90，界值為3 777.49 pg/mL，敏感度為90%，特異性為100%。

圖1 GATA4 診斷HF 氣虛血瘀證的ROC 曲線

5 討論

HF 屬中醫(yī)心悸、水腫、喘證、胸痹心痛等疾病范疇。中醫(yī)藥在HF 的臨床治療上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，在緩解癥狀、改善心功能、減輕西藥副作用以及提高生活質(zhì)量等方面均發(fā)揮重要作用。辨證論治是取得臨床療效的關(guān)鍵，證候研究是中醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)與難點(diǎn)，亦是研究取得突破性進(jìn)展的關(guān)鍵所在。證候的診斷標(biāo)準(zhǔn)是甄別證候的基本準(zhǔn)則，更是辨證治療的基礎(chǔ)與保障。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，本病病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，本虛以氣虛為主，標(biāo)實(shí)常見(jiàn)血瘀[2，7]。氣虛進(jìn)一步發(fā)展為氣陰兩虛、陽(yáng)氣虧虛、陽(yáng)氣虛脫；血瘀證兼水濕停滯、痰飲內(nèi)阻，虛實(shí)交錯(cuò)多變，演變?yōu)槎喾N證候。氣虛血瘀是HF 發(fā)生發(fā)展始動(dòng)因素，并貫穿于本病始終，是臨床常見(jiàn)、多發(fā)證型之一。

GATA4 是GATA 家族一員，是廣泛存在于脊椎動(dòng)物中的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子。GATA4 在心臟高表達(dá)，參與心臟發(fā)育和生長(zhǎng)的整個(gè)過(guò)程，在胚胎期心臟發(fā)育、心肌纖維化、心肌肥厚和心肌重構(gòu)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，是調(diào)節(jié)心臟的特異性基因[3]。GATA4是鈣調(diào)磷酸神經(jīng)激酶-活化的T 細(xì)胞核因子3（CaNNFAT3）、有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、異丙腎上腺素激活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）等多種心臟信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游效應(yīng)因子，在HF 發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。以CaN-NFAT3 通路為例，受神經(jīng)激素如血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素Ⅰ刺激，心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高，CaN 活化，在CaN 調(diào)節(jié)下，活化T細(xì)胞核因子（NFAT）發(fā)生脫磷酸，并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，但由于NFAT 在細(xì)胞核內(nèi)與DNA 結(jié)合力較弱，需在細(xì)胞核內(nèi)的其他轉(zhuǎn)錄因子GATA4 協(xié)助下形成共激活因子復(fù)合體，提高與DNA 親和力活化過(guò)程，從而發(fā)揮其生理效應(yīng)[8-9]。

本研究結(jié)果顯示，HF 氣虛血瘀證患者血清中GATA4 的含量明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨NYHA 心功能級(jí)別的增加，GATA4 水平呈上升趨勢(shì)；相關(guān)性分析結(jié)果提示GATA4 與心功能分級(jí)、BNP 關(guān)聯(lián)密切，且呈正相關(guān)，提示GATA4 可反映HF 病情輕重程度，為本病中醫(yī)證候輕重程度的判斷提供一定參考。這與國(guó)內(nèi)一些學(xué)者研究結(jié)果一致，胡厚祥[10]收集39 例因瓣膜性心臟病進(jìn)行二尖瓣置換術(shù)HF 患者和38 例健康對(duì)照者，采用免疫沉淀法測(cè)心肌組織GATA4 蛋白含量，結(jié)果顯示HF 患者心肌組織GATA4 蛋白含量明顯高于健康對(duì)照者，且隨心功能惡化，GATA4 蛋白表達(dá)逐漸增加，同樣的研究結(jié)論也見(jiàn)于楊永健等[11]的報(bào)道。研究報(bào)道126 例缺血性心肌病患者血清中GATA4、心肌肥厚標(biāo)志物血清肌球蛋白重鏈（MHC）蛋白水平均明顯高于健康對(duì)照組，左心室質(zhì)量及左心室質(zhì)量指數(shù)亦明顯增高，左室射血分?jǐn)?shù)下降，提示左心功能下降，推測(cè)GATA4 作為轉(zhuǎn)錄因子可能參與了心肌缺血所致的心肌重構(gòu)[12]。亦有研究證實(shí)中醫(yī)中藥可通過(guò)MAPK/ERK/ GATA4 通路，抑制心室肥厚，改善心肌重構(gòu)，緩解HF 癥狀[13-14]。

明確診斷閾值是證候診斷標(biāo)準(zhǔn)化、量化研究的重要內(nèi)容之一，ROC 曲線作為經(jīng)典的醫(yī)學(xué)診斷試驗(yàn)性能的評(píng)價(jià)方法應(yīng)用廣泛[15]。結(jié)合AUC 來(lái)判斷其診斷價(jià)值，AUC 值在0.5～0.7 范圍時(shí)診斷價(jià)值偏低，在0.7～0.9 范圍時(shí)診斷價(jià)值中等，大于0.9 時(shí)具有較高的診斷價(jià)值[16]。本研究繪制ROC 曲線初步擬定HF氣虛血瘀證血清GATA4 的診斷界值為3 777.49 pg/mL，此時(shí)AUC 為0.92，敏感度為90%，特異性為100%?；诖?，筆者認(rèn)為血清GATA4 對(duì)HF 氣虛血瘀證的診斷價(jià)值較高，此時(shí)診斷試驗(yàn)的敏感度和特異性較高，且誤診率和漏診率較低，可為本病證提供客觀化、量化的參考和依據(jù)。

本研究樣本量較少，尚需大樣本臨床研究證實(shí)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。除氣虛血瘀證，在其他不同證候中，GATA4 表達(dá)及變化也值得進(jìn)一步探索，才能更加全面地揭示HF 常見(jiàn)中醫(yī)證候的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)，推進(jìn)本病中醫(yī)證候標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化研究。