葉曉燕 陳華燕 黃麒諭 何曉帆 許朝生 梁澤鑫

血液透析A 濃縮物主要含有氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、冰醋酸或醋酸鈉（或其他替代物）；B 濃縮物主要含有碳酸氫鈉，部分還含有氯化鈉。臨床透析時(shí)通過(guò)含醋酸鹽和碳酸氫鹽的透析液來(lái)達(dá)到堿的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)［1］，碳酸氫根離子作為衡量人體酸堿平衡的重要指標(biāo)，其濃度的檢測(cè)有重要意義。目前碳酸氫根的常見(jiàn)檢測(cè)方法主要有離子色譜法和滴定法［2］。研究表明，抑制型離子色譜法檢測(cè)碳酸氫根時(shí)，峰型不佳，精密度差，離子色譜法不適合測(cè)定碳酸氫根［3］。

現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY 0598-2015《血液透析液及相關(guān)治療濃縮物》［4］中規(guī)定，檢測(cè)碳酸氫根濃度的檢驗(yàn)液為A 液、B 液和透析用水按照比例進(jìn)行混合后的透析液，采用鹽酸滴定法或電位滴定法測(cè)定。以醋酸配方為例，血液透析濃縮物配制成透析液時(shí)，A 液中含有的冰醋酸和B 液中的碳酸氫鹽以1∶1 的當(dāng)量發(fā)生反應(yīng)生成醋酸鈉，在實(shí)際的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，采用鹽酸直接滴定法測(cè)定透析液中碳酸氫根的含量時(shí)，由于醋酸鈉的干擾［5］，無(wú)法對(duì)透析液中的碳酸氫根含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，難以對(duì)血液透析濃縮物的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，該方法需要進(jìn)一步優(yōu)化完善［5］。

本文通過(guò)建立返滴定法，依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典（四部）》（2020 年版）通用技術(shù)要求9101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則［6］，考察返滴定法檢測(cè)透析液中碳酸氫根含量的專(zhuān)屬性、精密度、穩(wěn)定性以及回收率，同時(shí)與鹽酸滴定法進(jìn)行回收率試驗(yàn)對(duì)比，以證明返滴定法不受干擾，且穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性滿足檢測(cè)透析液中碳酸氫根的要求，為透析液中碳酸氫根含量的檢測(cè)提供更加準(zhǔn)確、可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

鹽酸滴定法回收率試驗(yàn)試劑包括：①實(shí)驗(yàn)用水，所有實(shí)驗(yàn)用水均為純化水；②鹽酸滴定液；③甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，按藥典指示劑項(xiàng)下配制。

返滴定法試驗(yàn)（包括專(zhuān)屬性、精密度、穩(wěn)定性、回收率試驗(yàn)）試劑包括：①實(shí)驗(yàn)用水，所有實(shí)驗(yàn)用水均為純化水；②鹽酸滴定液；③氫氧化鈉滴定液；④酚酞指示劑，按藥典指示劑項(xiàng)下配制。

1.2 透析液的配制

精密量取血液透析濃縮液或由干粉配制成的濃縮液，按使用說(shuō)明的比例用實(shí)驗(yàn)用水稀釋成透析液。由于透析液配制后，溫度的變化或劇烈的攪拌都易導(dǎo)致其中碳酸氫根的分解、pH 變化，時(shí)間長(zhǎng)了還會(huì)產(chǎn)生碳酸鈣和碳酸鎂沉淀，因此碳酸氫根檢測(cè)的樣品需即配即用。

1.3 試驗(yàn)方法和反應(yīng)機(jī)理

1.3.1 鹽酸滴定法的試驗(yàn)方法

按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的碳酸氫根檢測(cè)方法，精密量取檢驗(yàn)液100 mL，加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示液10 滴，用鹽酸滴定液（0.5 mol/L）滴定至溶液由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色，煮沸2 min，冷卻至室溫，繼續(xù)滴定至溶液由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榘底仙?，消耗鹽酸體積為VHCl，同時(shí)作空白測(cè)試。鹽酸滴定法計(jì)算公式如下：

1.3.2 返滴定法的試驗(yàn)方法

以透析液為檢驗(yàn)液，精密量取檢驗(yàn)液100 mL，精密加入0.5 mol/L 鹽酸滴定液10 mL，加熱煮沸1 分鐘，冷卻至室溫，加入酚酞指示劑1 滴，用0.2 mol/L 氫氧化鈉滴定液滴定至溶液由無(wú)色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，消耗滴定液VNaOHmL。同時(shí)做空白測(cè)試（不加鹽酸），取與檢驗(yàn)液相同體積的透析用水100 mL，同法煮沸冷卻至室溫，加入酚酞指示劑1 滴，用氫氧化鈉滴定液滴定至溶液由無(wú)色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，消耗滴定液V0mL。計(jì)算公式如下：

1.3.3 返滴定法的反應(yīng)機(jī)理

①血液透析濃縮物配制成透析液時(shí)，A 液中的冰醋酸和B 液中的碳酸氫鹽以1∶1 的當(dāng)量發(fā)生以下的化學(xué)反應(yīng)生成醋酸鈉：

②滴定時(shí)，取100 mL 透析液，加入過(guò)量的鹽酸滴定液10 mL，將碳酸氫鹽全部中和掉，再將醋酸鹽置換成醋酸：

③公式（2）中碳酸氫鈉消耗鹽酸的體積為V2，公式（3）中醋酸鈉消耗鹽酸的體積為V3，此時(shí)溶液中還有（10 mL-V2-V3）×CHCl的鹽酸。煮沸溶液除去溶液中的CO2，冷卻，加入酚酞指示劑后用氫氧化鈉滴定液滴定。氫氧化鈉首先與溶液中剩余的鹽酸反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程如下：

④繼續(xù)滴定使NaOH 與公式（3）中生成的HAc 反應(yīng)生成NaAc，直到酚酞變?yōu)榉奂t色（HAc反應(yīng)完全），反應(yīng)過(guò)程如下：

此部分消耗NaOH 的物質(zhì)的量（mol）與公式（3）中消耗HCl 的物質(zhì)的量相等（結(jié)合公式（3）、公式（5）：CNaOHV5=CHClV3），因此：

公式（5）中NaOH 消耗掉的體積

NaOH 的總消耗量（V4+V5）為：

則化學(xué)反應(yīng)（2）中碳酸氫鈉消耗掉的鹽酸體積V2為：

⑤根據(jù)化學(xué)反應(yīng)（2）中，V2×CHCl=×Vsample，同時(shí)做空白測(cè)試（不加鹽酸），則碳酸氫根濃度為：

2 結(jié)果

2.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

配制32 mmol/L 的碳酸氫鈉溶液及碳酸氫鈉標(biāo)示值為32 mmol/L 的透析液，用返滴定法分別檢測(cè)碳酸氫鈉溶液和透析液中的碳酸氫根含量，比較檢測(cè)結(jié)果的差異。見(jiàn)表1。檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)：采用返滴定法檢測(cè)時(shí)，理論值為32 mmol/L 的碳酸氫鈉溶液和透析液的碳酸氫根檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差為0.31%。

2.2 精密度試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)采用返滴定法分別測(cè)定多種典型配方透析液中的碳酸氫根含量，平行測(cè)定6 次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值，結(jié)果顯示，不同配方不同配制比例透析液的碳酸氫根檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性RSD（%）值分別為0.10、0.17、0.11、0.10、0.14。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。中間精密度試驗(yàn)選取配方1 透析液，不同檢驗(yàn)員在不同時(shí)間和不同試驗(yàn)條件下，用不同滴定管進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)，結(jié)果顯示中間精密度RSD（%）值為0.06。中間精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Repeatability test results

表3 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of intermediate precision test

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取配方1 透析液，連續(xù)3 天使用同一套透析濃縮物配制透析液，并采用返滴定法進(jìn)行檢測(cè)，穩(wěn)定性結(jié)果RSD（%）=0.05。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Stability test results

2.4 回收率試驗(yàn)

選取配方1（原料為雙醋酸鈉，醋酸根標(biāo)示量：6.0 mmol/L）和配方5（原料為枸櫞酸鈉，枸櫞酸根標(biāo)示量：1.0 mmol/L）透析液樣品，分別配制成3 個(gè)不同濃度的透析液，所含碳酸氫根濃度為其標(biāo)示量（32.0 mmol/L）的80%、100%、120%的透析液，分別用返滴定法和鹽酸滴定法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其回收率。

采用返滴定法檢測(cè)，80%、100%、120%醋酸配方透析液平均回收率（%）分別為101.19、100.70、100.86；采用鹽酸滴定法檢測(cè)，80%、100%、120%醋酸配方透析液回收率（%）分別為106.10、105.47、103.84。醋酸配方透析液回收率結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果（醋酸配方）Table 5 Recovery test results（Acetic acid formula）

采用返滴定法檢測(cè)，80%、100%、120%枸櫞酸配方透析液回收率（%）分別為100.20、100.06、99.93；采用鹽酸滴定法檢測(cè)，80%、100%、120%枸櫞酸配方透析液平均回收率（%）分別為102.25、101.77、101.62。枸櫞酸配方透析液回收率結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 回收率試驗(yàn)結(jié)果（枸櫞酸配方）Table 6 Recovery test results（Citric acid formula）

3 討論

從專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，采用返滴定法檢測(cè)，透析液中的其他離子對(duì)待測(cè)碳酸氫根無(wú)干擾。從精密度試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，重復(fù)性RSD 為0.10%～0.17%，日間精密度RSD 為0.06%，穩(wěn)定性RSD 為0.05%，表明返滴定法重現(xiàn)性好。

從兩種檢測(cè)方法的回收率對(duì)比試驗(yàn)可見(jiàn)：①現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY 0598-2015 中規(guī)定的鹽酸滴定法檢測(cè)枸櫞酸配方透析液（枸櫞酸根標(biāo)示量：1.0 mmol/L）的回收率效果較好，而鹽酸滴定法檢測(cè)醋酸配方透析液（醋酸根標(biāo)示量：6.0 mmol/L）中碳酸氫根含量的回收率效果較差，80%和100%的回收率超過(guò)了5%的允差范圍，準(zhǔn)確度低；②采用返滴定法測(cè)定醋酸配方和枸櫞酸配方透析液，碳酸氫根含量檢測(cè)的回收率均接近100%，準(zhǔn)確度高，符合《中國(guó)藥典（四部）》（2020年版）通用技術(shù)要求9101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求；③造成結(jié)果偏差的原因可能與透析液中弱酸含量的高低有關(guān)。采用鹽酸滴定法時(shí)，由于部分鹽酸滴定液與透析液中的醋酸鈉反應(yīng)，透析液中醋酸根含量越高，采用鹽酸滴定法檢測(cè)透析液中碳酸氫根含量的準(zhǔn)確度越低。而返滴定法則不受該因素的影響，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出透析液中碳酸氫根消耗滴定液的量，得出的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

通過(guò)對(duì)返滴定法進(jìn)行了專(zhuān)屬性、穩(wěn)定性、精密度和回收率試驗(yàn)方法驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有專(zhuān)屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、精密度和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確、穩(wěn)定地檢測(cè)出透析液中碳酸氫根的含量，適用于含醋酸鈉、冰醋酸或枸櫞酸的血液透析液中碳酸氫根含量的檢測(cè)。