鐘寒輝,王 彬,陳曉林,余功富,林仙軍*

(1.綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司,杭州 310051;2.浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,杭州 311101;3.臺州市路橋區(qū)橫街動(dòng)物衛(wèi)生所,浙江臺州 318020)

中獸藥茵梔解毒顆粒由5味藥材(茵陳、梔子、黃芩、虎杖和鉤藤)通過一定的生產(chǎn)工藝制得[1-2]。具有清熱解毒、疏肝解痙功效[3],獸醫(yī)臨床上用于雛鴨病毒性肝炎的治療[4-5]?！东F藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2017年版)中藥卷》收載了該標(biāo)準(zhǔn)[1],標(biāo)準(zhǔn)采用4個(gè)薄層色譜系統(tǒng),分別鑒別梔子苷、黃芩苷、茵陳對照藥材和虎杖對照藥材,操作繁瑣并且需要用到三氯甲烷、丙酮等多種管制試劑和一般有機(jī)試劑,試劑使用量也較大,對操作人員不友好。在含量測定方面,標(biāo)準(zhǔn)僅測定來自處方中茵陳的有效成分綠原酸的含量,評價(jià)藥物質(zhì)量方面不夠全面。

高效液相色譜法作為一種較成熟的分離技術(shù)[6],具有分離速度快、效率高、靈敏度高[7-8]、定性定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢[9-10],在獸藥檢驗(yàn)和質(zhì)量監(jiān)控中發(fā)揮越來越大的作用[11-12]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對中獸藥茵梔解毒顆粒中梔子苷、黃芩苷和綠原酸同時(shí)檢測的方法進(jìn)行了研究,建立方法的基礎(chǔ)上開展了實(shí)際樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司,型號1260,配G4212A檢測器);色譜柱(Agilent Eclipse XDB-C18,250 mm×4.6 mm,5 μm);電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司,型號AG-285);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司KQ-500E型)。

1.2 主要試劑 黃芩苷對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn),批號為Z0271705,含量為96.8%);梔子苷對照品(中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn),批號為110749-201115,含量為99.7%);綠原酸對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn),批號為Z0261702,含量為98.3%)。茵梔解毒顆粒(浙江企業(yè)生產(chǎn),批號為20210822、20210823和20210824等3批次)。

1.3 對照品貯備溶液 取黃芩苷9.80 mg、綠原酸12.60 mg和梔子苷15.60 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇適量,震搖使溶解并定容。

1.4 供試品溶液 稱取茵梔解毒顆粒約1 g,精密稱定,置25 mL量瓶中,加入50%甲醇溶液約15 mL,超聲約20 min,用50%甲醇溶液定容。

1.5 色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相:0.05%磷酸溶液(A)和乙腈(B),梯度洗脫程序見表1;進(jìn)樣量10 μL,柱溫30 ℃,流速為1.0 mL/min,用二極管陣列檢測器進(jìn)行掃描,掃描范圍為210 nm～400 nm,記錄230 nm波長處的色譜圖。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 線性范圍 取對照品貯備溶液用50%甲醇溶液分別稀釋2倍、5倍、10倍、20倍和50倍,作為線性實(shí)驗(yàn)溶液,取10 μL進(jìn)樣,記錄色譜圖和峰面積,以峰面積對濃度作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照建立的方法測定同一份樣品6次(批號為20210822),計(jì)算批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,作為精密度試驗(yàn);取精密度試驗(yàn)的樣品溶液于間隔2 h、2 h、2 h、6 h和12 h測定其含量,每次測定3次,取平均值,計(jì)算批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,作為溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)。

1.6.3 方法專屬性 取茵梔解毒顆粒樣品3份,每份各1 g,置于25 mL量瓶中,分別加1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液和5%過氧化氫溶液,各1 mL,搖勻,放置1 h[6],進(jìn)行酸、堿和氧化破壞,加入50%甲醇溶液15 mL,超聲20 min,50%甲醇溶液定容,依法測定。

1.6.4 加樣回收率試驗(yàn) 根據(jù)前期試驗(yàn)分析,3種藥物的含量均約為1 mg/g。因此,加樣回收率的添加濃度定為1 mg/g。在準(zhǔn)確測定本底的情況下(測定6次,取平均值),開展加樣回收率試驗(yàn)。取3種對照品加甲醇配制成每毫升各約含1 mg的溶液。另取樣品6份,各1 g,精密稱定,置25 mL量瓶中,分別加入相應(yīng)對照品溶液各1.00 mL,按照建立的方法檢測,結(jié)果減去相應(yīng)本底,計(jì)算平均回收率和批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6.5 實(shí)際樣品的測定 取3批次供試品,每批次各3個(gè)平行,取每份樣品各1 g,按照1.4項(xiàng)配制供試品溶液,依法檢測,計(jì)算平均含量。

1.7 提取溶劑的選擇 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)考慮到提取目標(biāo)藥物的性質(zhì),選擇水、甲醇和50%甲醇超聲20 min以及水、甲醇和50%甲醇水浴回流20 min等方式提取藥物中有效成分,另外參考文獻(xiàn)[5]采用熱水加甲醇提取20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 在1.5色譜條件下,對照品溶液和實(shí)際樣品圖譜中綠原酸、梔子苷和黃芩苷峰型對稱,對稱因子均在0.95至1.05之間,3種藥物和其邊上的峰,兩者之間的分離度均大于1.5,理論板數(shù)以3種藥物計(jì)均大于3000,系統(tǒng)適用性試驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)符合要求,典型色譜圖和光譜圖見圖1-圖8。

注:出峰順序?yàn)榫G原酸、梔子苷和黃芩苷Note: The order of peaks is chlorogenic acid, gardenia glucoside and baicalin圖1 綠原酸、梔子苷和黃芩苷對照品溶液色譜圖Fig 1 Chromatogram of chlorogenic acid, gardenia glucoside and baicalin control solution

圖2 綠原酸對照品溶液光譜圖Fig 2 Spectrum of chlorogenic acid control solution

圖3 梔子苷對照品溶液光譜圖Fig 3 Spectrum of Gardenia jasminoides control solution

注:出峰順序?yàn)榫G原酸、梔子苷和黃芩苷Note:The order of peaks is chlorogenic acid, gardenia glucoside and baicalin圖4 黃芩苷對照品溶液光譜圖Fig 4 Spectrum of baicalin control solution

圖5 茵梔解毒顆粒色譜圖Fig 5 Chromatogram of Gardenia jasminoides

圖6 茵梔解毒顆粒中梔子苷光譜圖Fig 6 Spectrum of gardenia glycosides in gardenia antidote granules

圖7 茵梔解毒顆粒中黃芩苷光譜圖Fig 7 Spectrum of baicalin in Yinjian Jiexing granules

圖8 茵梔解毒顆粒中綠原酸光譜圖Fig 8 Spectrum of chlorogenic acid in Gardenia jasminoides pellets

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)1.2、1.3和1.6.1數(shù)據(jù)以及方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性溶液,依法測定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖9。結(jié)果梔子苷在3.110～155.5 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好,線性方程為Y=3.7946X-1.4586,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9;黃芩苷在1.897～94.86 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好,線性方程為Y=17.222X+5.4359,相關(guān)系數(shù)r=0.999 9;綠原酸在2.478～123.9 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好,線性方程為Y=6.255X+1.3125,相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。

圖9 3種藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 9 Standard curve for three drugs

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果 按1.6.2方法測定,結(jié)果梔子苷、黃芩苷、綠原酸精密度分別為0.9%、0.7%和0.9%,表明方法精密度良好,結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 2 Precision test results (n=6)

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 取精密度試驗(yàn)的樣品溶液于間隔2 h、2 h、2 h、6 h和12 h測定其含量,計(jì)算批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,作為溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)。梔子苷、黃芩苷和綠原酸溶液峰面積的RSD分別為1.2%、1.1%和1.4%,表明溶液穩(wěn)定性良好,結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab 3 Stability test results (n=3)

2.5 專屬性結(jié)果 按1.6.3方法測定,結(jié)果顯示,在鹽酸溶液和過氧化氫溶液中這3種藥物均能保持穩(wěn)定,峰面積減少小于3%;氫氧化鈉溶液中,黃芩苷和梔子苷均減少50%以上,綠原酸幾乎降解100%。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法開展加樣回收率試驗(yàn),3種藥物的平均加樣回收率均在95%以上,6份樣品批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在4%以內(nèi),表明方法可靠性較好,結(jié)果見表4。

表4 平均加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 4 Results of mean spiked recovery tests (n=6)

2.7 實(shí)際樣品測定結(jié)果 依法測定,結(jié)果3批次樣品梔子苷的含量范圍為1.57 mg/g～1.60 mg/g之間;黃芩苷的含量范圍為1.11 mg/g～1.16 mg/g之間;綠原酸的含量范圍為0.81 mg/g～0.82 mg/g之間?！东F藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2017年版)中藥卷》規(guī)定,茵梔解毒顆粒中綠原酸的含量限量為每1 g不得少于0.35 mg,表明該企業(yè)生產(chǎn)的3批次樣品綠原酸的含量均符合標(biāo)準(zhǔn)。因梔子苷和黃芩苷沒有相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn),待收集足夠數(shù)據(jù)以后作為制定標(biāo)準(zhǔn)限量的參考,結(jié)果見表5。

表5 實(shí)際樣品含量測定結(jié)果(n=3)Tab 5 Results of actual sample content determination (n=3)

2.8 提取溶劑選擇的結(jié)果 根據(jù)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法,對7種提取溶劑進(jìn)行了考察,結(jié)果綠原酸在甲醇中的提取效率較低,黃芩苷在水超聲和水回流中的提取效率較低,梔子苷在甲醇超聲和水回流的情況下結(jié)果含量較低,見圖10, 圖中序號1～7分別對應(yīng)7種提取溶劑及相應(yīng)的提取方式。綜合分析,本試驗(yàn)選擇50%甲醇超聲20 min,作為樣品的提取方式。

2.9 定量限 根據(jù)1.6.1方法配制稀釋50倍的溶液,為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)濃度,依法測定,計(jì)算3種藥物的信噪比。結(jié)果該濃度下3種藥物的信噪比均大于10,滿足含量檢測分析要求的最小濃度,把此濃度對應(yīng)樣品中藥物的含量,作為相應(yīng)藥物的定量限。此時(shí),梔子苷的濃度為3.110 μg/mL,黃芩苷的濃度為1.897 μg/mL,綠原酸的濃度為2.478 μg/mL;根據(jù)1.4供試品溶液的配制方法,折算到實(shí)際樣品中,3種藥物的定量限,分別為梔子苷0.08 mg/g、黃芩苷0.05 mg/g和綠原酸0.06 mg/g。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測波長的選擇 本試驗(yàn)在查閱相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,基本了解藥物的性質(zhì),3種藥物的紫外吸收明顯,能夠采用液相色譜法對其進(jìn)行檢測。因此,我們選擇在210 nm～400 nm范圍內(nèi)對3種藥物進(jìn)行掃描,以確定3種藥物的最佳檢測波長。圖2～圖4結(jié)果顯示,梔子苷的最大吸收波長在240 nm附近,黃芩苷的最大吸收波長在215 nm～277 nm范圍內(nèi),綠原酸的最大吸收在210 nm～240 nm范圍內(nèi)。綜合考慮3種藥物的含量和吸收值,選擇3種藥物均有較大吸收值的波長,使3種藥物能用同一波長同時(shí)檢測。因此本試驗(yàn)選擇230 nm作為檢測波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)考察了磷酸溶液(0.01%、0.05%、0.2%和0.4%)作為流動(dòng)相的情況,不同濃度磷酸溶液,對3種藥物的保留時(shí)間和峰型的影響不大,而0.4%和0.2%磷酸溶液濃度較高,pH值小于2.0,對C18色譜柱有不利影響。選擇pH值為2.3左右的0.05%磷酸溶液和乙腈配比作為流動(dòng)相。實(shí)際樣品檢測中,因樣品中含有其他藥物或者雜質(zhì),易影響藥物和其他組分的分離度,調(diào)節(jié)梯度洗脫程序,3種藥物峰型對稱、分離度滿足要求。

3.3 結(jié)論 試驗(yàn)建立了高效液相色譜法測定畜禽用中獸藥茵梔解毒顆粒中梔子苷、黃芩苷和綠原酸的方法,采用50%甲醇作為提取溶劑,超聲波清洗器超聲20 min作為提取方式,230 nm作為檢測波長,3種藥物加樣回收率均達(dá)到95%以上,試驗(yàn)操作簡便、快捷,定性定量準(zhǔn)確,能滿足中獸藥茵梔解毒顆粒的梔子苷、黃芩苷和綠原酸等3種有效成分的同時(shí)檢測。