鄒莉芳,盧昌均,魏曉玲,楊 茜,頓玲露,王少洲

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,廣西 南寧 530004;2.柳州市中醫(yī)醫(yī)院 柳州市壯醫(yī)醫(yī)院,廣西 柳州 545001)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是一種常見的癡呆類型,由各種腦血管疾病導(dǎo)致腦損傷而致獲得性智力損害,其臨床表現(xiàn)以記憶能力的減退及認(rèn)知功能的下降為主。通竅活血湯源自清代醫(yī)家王清任編著《醫(yī)林改錯》,是活血化瘀類的代表方劑,也是治療頭竅部疾病的經(jīng)典名方,書中述“治頭面,四肢,周身血管血瘀之證”,說明該方有活血化瘀通絡(luò)、開竅醒神的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明通竅活血湯可提高血腦屏障通透性、擴張腦血流量,促進血液循環(huán)、改善血流動力、減輕腦水腫,并通過增強腦細(xì)胞缺氧的耐受性、促進血管生成[1-2]來改善腦損害癥狀。

本實驗通過建立VD模型大鼠,干預(yù)4周,通過卒中指數(shù)、神經(jīng)病學(xué)癥狀評分進行評分,使用Morris水迷宮檢測觀察大鼠行為學(xué)改變,RT-qPCR法檢測大鼠海馬組織miR-9、miR-124含量,HE染色觀察大鼠海馬病理學(xué)結(jié)構(gòu)情況。探討通竅活血湯治療VD的作用機制及影響,為通竅活血湯治療血管性癡呆提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用SPF級SD健康大鼠,購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可號:SCXK (湘) 2019-0013,體重約(200±20)g,予自由進食、進水喂養(yǎng),動物房條件控制在溫度(23±2)℃、濕度(60±3)%,12 h光照/12 h黑暗適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,環(huán)境安靜、清潔。每日均探視觀察,保證動物房的溫度、濕度、光線,大鼠墊料保持干燥、食物及飲用水無菌且充足,本研究實驗動物遵循ARRIVE指南和巴塞爾宣言有關(guān)規(guī)定[3]。

1.2 藥物與試劑 通竅活血湯根據(jù)《醫(yī)林改錯》原方組成為:麝香(人工麝香)0.15 g(絹包、后下),桃仁、紅花、生姜各9 g,赤芍、川芎各3 g,老蔥3根,大棗7枚,黃酒250 ml。中藥飲片由國藥控股廣西中藥飲片有限公司提供,均委托柳州市中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑室加工而成。按人與動物藥物劑量換算公式得出大鼠所需藥物濃度為6 g/kg,并進行定容,每只大鼠每天灌胃容量為含生藥2 g/ml的中藥溶液[4],于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

所需試劑如下:miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green):天根生化科技(北京)有限公司;蘇木素-伊紅染料、4%多聚甲醛:索萊寶生物科技有限公司。

1.3 實驗儀器 全自動雪花制冰機:張家港伊威特電器有限公司;包埋機YB-6LF、石蠟切片機LEICA2235、組織攤烤片機YT-7FB:孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司。

1.4 實驗方法、分組及給藥 假手術(shù)組大鼠僅分離出雙側(cè)頸總動脈(CCA),剩余各組均采用缺血再灌注配合永久性結(jié)扎雙側(cè)CCA法[5]建立VD大鼠模型。術(shù)前禁食12 h,禁水4 h,用1.5%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后,將其仰臥固定于操作臺,充分暴露頸部并用碘伏消毒,頸部以下部位保暖,沿前正中線切開頸部皮下組織,鈍性分離充分暴露雙側(cè)CCA,隨即使用無創(chuàng)動脈夾夾閉CCA 10 min,再松開無創(chuàng)動脈夾灌注10 min,以上步驟重復(fù)3次,經(jīng)過3次缺血再灌注后使用4號手術(shù)縫線永久結(jié)扎雙側(cè)CCA,0.9%氯化鈉溶液清理傷口并縫合,術(shù)后連續(xù)3 d予慶大霉素注射液噴灑傷口預(yù)防感染。建模過程中應(yīng)密切觀測大鼠生命體征,注意保暖,肛溫維持在(37±0.5)℃,模型建立過程保持動作輕柔,避免損傷神經(jīng)、血管等。造模后7 d內(nèi)傷口愈合即使用Morris水迷宮實驗確認(rèn)模型是否成功,評估標(biāo)準(zhǔn)為:統(tǒng)計假手術(shù)組及模型組大鼠的逃避潛伏期,并以假手術(shù)組的作為參考值,計算出模型組的逃避潛伏期與參考值之差及占該鼠逃避潛伏期的比例>20%即為癡呆。造模失敗者剔除,最終共剔除15只大鼠,每組剩余12只。

傷口愈合后,所有大鼠均適應(yīng)性下水游泳2 min,排除不會游泳的大鼠,本實驗12只假手術(shù)組大鼠均會游泳。造模成功大鼠的行為學(xué)表現(xiàn):①VD大鼠在定位航行實驗的表現(xiàn)為繞水迷宮池壁游泳、空間探索能力差、潛伏期長。若以上述計算VD大鼠逃避潛伏期時間來確定是否造模成功,那么本實驗的造模成功率約為70%。②外形表現(xiàn):造模成功的大鼠可見毛發(fā)臟亂,缺少光澤,爪甲、口唇、耳朵顏色黯淡,眼瞼下垂,行動緩慢,對新鮮事物探索度下降,觸之躲避反應(yīng)減弱,喜蜷聚,進食及飲水減少;個別大鼠可見狂躁狀,與同籠中大鼠斗毆,甚至咬食同籠大鼠。將VD大鼠隨機分為三組,即模型組、中藥組、安慰劑組,每組12只。

中藥組大鼠服用通竅活血湯1 ml/100(g·d)灌胃,安慰劑組予中藥組等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃,假手術(shù)組及模型組不予干預(yù),共持續(xù)4周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 卒中指數(shù)、神經(jīng)病學(xué)癥狀評分:造模第1天及干預(yù)第28天次日,進行卒中指數(shù)評分。評分標(biāo)準(zhǔn)及分值如下:毛發(fā)臟亂或顫抖或發(fā)聲、運動遲鈍或減少、耳觸覺減退、上瞼下垂各1分;頭翹起、眼球固定狀睜開、后肢外展成“八”字、轉(zhuǎn)圈、驚厥爆發(fā)樣運動各3分;極度衰竭為6分。神經(jīng)病學(xué)癥狀評分,標(biāo)準(zhǔn)及分值如下。運動:自發(fā)性探究為0分,刺激時走動為1分,正常步態(tài)為0分;步態(tài):共濟失調(diào)為1分,爬行為2分,無步態(tài)為3分;進食:能為0分,不能為1分;飲水:能為0分,不能為1分;疼痛刺激反應(yīng):疼痛刺激時可移動為0分,僅頭或軀干活動為1分,肢體回縮或無反應(yīng)為2分。其中卒中指數(shù)為0～3分為癥狀組,3～9分為可能有損害,10分以上為有損傷;神經(jīng)病學(xué)癥狀為0分正常,1～3分輕度損傷,4～6分中度損傷,7～10分嚴(yán)重?fù)p傷。

1.5.2 行為學(xué)檢測:干預(yù)結(jié)束后在Morris水迷宮進行檢測,水迷宮直徑160 cm、高50 cm,共分為4個象限,每個象限均做不同的標(biāo)記為便大鼠識別記憶,水迷宮固定象限內(nèi)放置一個直徑12 cm,高30 cm的黑色平臺,水迷宮四周為黑色帷幕且分別有不同標(biāo)記便于大鼠識記,保持光線暗且穩(wěn)定,便于攝像頭捕捉記錄,水溫維持在(25±1)℃,了解各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮實驗內(nèi)容分為定向航行實驗和空間探索實驗兩個部分。

1.5.2.1 定向航行實驗:實驗共進行5 d,第1天水迷宮內(nèi)不設(shè)置平臺,以熟悉水迷宮環(huán)境為主,讓大鼠自由游泳120 s。第2天起正式實驗,每只鼠每天進行8次,持續(xù)至第5天,每天均在固定時段,以減少不同時段大鼠狀態(tài)差別導(dǎo)致結(jié)果有差別。訓(xùn)練時,將大鼠分別從不同象限邊緣的中點將大鼠面向池壁放入水迷宮中,若大鼠在120 s內(nèi)找到平臺,允許其在平面上休息10 s,若大鼠未在120 s內(nèi)找到平臺,則引導(dǎo)大鼠找到平臺,讓其在平臺上休息10 s,再次進行下一象限入水實驗,每個象限依次進行。使用自由錄像記錄系統(tǒng)記錄大鼠逃避潛伏時間、游泳路線及速度等。

1.5.2.2 空間探索實驗:定位航行實驗結(jié)束次日,測量大鼠保持對平臺空間位置的記憶能力。實驗第6天,撤除水迷宮逃生平臺,并任意選個象限中點作為落水點將大鼠放入水迷宮中,所有大鼠都應(yīng)從同一落水點入水,記錄并比較各組大鼠在120 s內(nèi)穿越原目標(biāo)區(qū)域平臺的次數(shù)。

1.5.3 RT-qPCR法檢測大鼠海馬miR-9、miR-124含量:每組隨機取部分大鼠麻醉后斷頸處死,在冰浴中快速剝離海馬,將海馬組織放入標(biāo)記好的EP管后至-80 ℃冰箱凍存留作備用。按照RT-qPCR說明書進行海馬組織的RNA提取并測定濃度,對提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,最后使用PCR儀器進行測定,并用2-ΔΔCt法計算出各目的基因的表達含量。

1.5.4 HE染色觀察海馬組織形態(tài):每組隨機取部分大鼠深度麻醉,快速謹(jǐn)慎剖開胸腔充分暴露心臟,止血鉗夾持心尖并固定,注射針頭從心尖刺入,進入主動脈后剪開右心耳,快速注入0.9%氯化鈉溶液,置換出血液,可見大鼠肝臟變白、流出的血液轉(zhuǎn)為無色液體時即轉(zhuǎn)為4%多聚甲醛持續(xù)灌注,可見大鼠四肢及尾部抽動,待大鼠全身僵硬后停止灌注。灌注完成后快速斷頸取腦,將大腦置于4%多聚甲醛內(nèi)過夜,次日脫水、包埋并切片,切片厚度2.5 μm,切片后進行烤片、脫蠟、染色、脫水、中性樹脂封膜,顯微鏡下觀察海馬組織形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。本實驗計量資料均呈正態(tài)分布,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析;P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠卒中指數(shù)、神經(jīng)病學(xué)癥狀評分比較 見表1。造模第1天,與安慰劑組比較,假手術(shù)組大鼠卒中指數(shù)及神經(jīng)病學(xué)癥狀評分均降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),模型組及中藥組大鼠的卒中指數(shù)及神經(jīng)病學(xué)癥狀評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);干預(yù)第28天,各組大鼠評分均下降,與安慰劑組相比,假手術(shù)組及中藥組大鼠的卒中指數(shù)及神經(jīng)病學(xué)癥狀評分均明顯下降(P<0.05),模型組大鼠的卒中指數(shù)及神經(jīng)病學(xué)癥狀評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠卒中指數(shù)評分和神經(jīng)病學(xué)癥狀評分比較(分)

2.2 各組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)比較 見表2。與安慰劑組相比,假手術(shù)組及中藥組逃避潛伏期耗時縮短,穿越平臺次數(shù)增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),模型組逃避潛伏期耗時及穿越平臺次數(shù)相當(dāng),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)比較

2.3 各組大鼠海馬組織miR-9、miR-124表達水平比較 見表3。與安慰劑組比較,假手術(shù)組及中藥組大鼠海馬組織miR-9、miR-124表達水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),模型組大鼠海馬組織miR-9、miR-124表達水平稍降低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠海馬組織miR-9、miR-124表達水平比較

2.4 各組大鼠HE染色結(jié)果 假手術(shù)組大鼠海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整,無明顯丟失現(xiàn)象,細(xì)胞排列整齊、分布密集有序,形態(tài)良好,細(xì)胞核染色均勻;模型組及安慰劑組大鼠海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)殘缺,神經(jīng)元丟失現(xiàn)象明顯,細(xì)胞排列凌亂,數(shù)量減少,分布疏散雜亂,形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞外觀腫脹,與周圍組織間隙增大,細(xì)胞核染色不均勻,細(xì)胞核形態(tài)固縮;中藥組大鼠海馬組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對完整,神經(jīng)元有少量丟失,細(xì)胞排列相對有序,分布較安慰劑組大鼠的密集,形態(tài)欠規(guī)則,細(xì)胞水腫減輕,與周圍組織間隙縮小,細(xì)胞核染色程度減低,細(xì)胞核固縮形態(tài)相對減少(圖1)。

··A:假手術(shù)組;B:模型組;C:中藥組;D:安慰劑組

3 討 論

VD是目前世界上公認(rèn)的唯一可防治的癡呆類型,及早治療甚至有可逆性可能。VD在中醫(yī)中雖無對應(yīng)病名,亦未與其他呆病相互區(qū)分,但據(jù)其臨床癥狀,屬于中醫(yī)“癡呆”“健忘”“呆病”“癡呆”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為癡呆病位在腦,與五臟關(guān)系密切。古代醫(yī)家認(rèn)為癡呆可能是由于腎虛、肝郁、痰濁、血虛或瘀血所致,治療上往往從補腎補精、健脾益氣、化痰開竅、活血化瘀、安肝養(yǎng)陽、安神養(yǎng)心等方面入手,中藥多選用補虛藥、活血化瘀藥、開竅藥等。鄢海良等[6]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示,通竅活血湯中各藥有效成分可通過血腦屏障,提高腦代謝率、增加腦血流量、改善神經(jīng)功能缺損癥狀等,通過抑制自由基氧化反應(yīng)、保護血腦屏障、調(diào)節(jié)腦血流、加強血管再生能力、促進神經(jīng)元再生,遏抑或促使神經(jīng)傳遞介質(zhì)的釋放等作用機制治療VD。

通竅活血湯出自清代名醫(yī)王清任所著《醫(yī)林改錯》,其為頭竅部瘀血要方,方由麝香、桃仁、紅花、赤芍、川芎、大棗、鮮姜、老蔥、黃酒等組成,方中桃仁、紅花為對藥,兩藥互相配伍善于活血散瘀通經(jīng);川芎素有“血中氣藥”之稱,專于活血行氣;赤芍可清熱涼血散瘀;麝香更擅開竅醒神,加之活血通絡(luò),配合姜、棗、老蔥、黃酒更能通絡(luò)開竅,通達氣運血行之道路,使得全方共奏活血化瘀、開竅通絡(luò)之效。王清任立該方以“治頭面四肢、周身血管血瘀之癥”,現(xiàn)代臨床仍有延續(xù)使用該方治療血管性癡呆之頭竅部血瘀證,其取得的臨床療效獲得肯定。孫曉麗等[7]發(fā)現(xiàn),通竅活血湯改善VD大鼠癥狀是通過改善維生素B6及脂肪酸代謝、促進類固醇激素生物合成等代謝通路實現(xiàn)的。劉江華等[8]表明通竅活血湯改善VD癥狀可能是通過調(diào)節(jié)血管新生因子,即抑制血管因子ET-1、促進生成VEGF發(fā)揮作用。張立娟等[9]證明通竅活血湯可通過降低Glu的神經(jīng)興奮毒性來改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能。本研究選取miR-9、miR-124作為研究內(nèi)容,探討二者與VD的關(guān)系,闡明通竅活血湯治療VD的可能作用機制。但是,由于中草藥及復(fù)方含有的化學(xué)成分多樣復(fù)雜,難以捕捉到究竟是哪種化學(xué)成分對VD的發(fā)病機制起治療作用,還需進一步研究探索。

海馬體位于內(nèi)側(cè)顳葉部,海馬區(qū)是與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)的最關(guān)鍵的大腦區(qū)域之一,當(dāng)大腦發(fā)生缺血性損傷時,以海馬CA1區(qū)最為敏感的區(qū)域非常容易受到損傷,海馬區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量及其結(jié)構(gòu)的完整性和突觸傳遞的有效性均可直接影響認(rèn)知功能,海馬的功能和形態(tài)紊亂是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的重要因素[10]。林聰?shù)萚11]使用活血化痰膠囊治療VD大鼠可促進其海馬區(qū)Bcl-2的表達以緩解氧化應(yīng)激反應(yīng),促進大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)。本實驗發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組大鼠的海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)無明顯破壞,大鼠學(xué)習(xí)記憶能力無明顯下降,而模型組大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)破壞明顯,其學(xué)習(xí)記憶能力均有不同程度下降,使用通竅活血湯治療后的大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)相對恢復(fù),其學(xué)習(xí)記憶能力得到改善,說明通竅活血湯可影響海馬組織神經(jīng)元形態(tài),促進神經(jīng)元細(xì)胞修復(fù),進而改善VD大鼠的認(rèn)知能力障礙。通竅活血湯促進海馬神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)是通過何種機制實現(xiàn)的,目前尚未闡明,近年來不斷有新的研究表明miR-9、miR-124在大腦發(fā)育特別是認(rèn)知功能方面起重要作用,我們猜測通竅活血湯可能是通過調(diào)控miR-9、miR-124的表達促進海馬區(qū)病理形態(tài)恢復(fù)而起到改善認(rèn)知障礙的作用。但通竅活血湯究竟是通過何種途徑調(diào)節(jié)miR-9、miR-124的表達水平尚鮮有研究,同時這也是本研究的不足之處,在后續(xù)的研究中可進一步探討。

微小核糖核酸(miRNA)是一種小的非編碼RNA,結(jié)合在mRNA的特定位點,轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達[12],在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中發(fā)揮重要調(diào)控作用。有研究顯示,VD患者大腦中的mRNA會出現(xiàn)異常調(diào)控的情況[13]。miR-9和miR-124均是miRNAs家族中的成員之一,二者在大腦中表達含量豐富,特別是在發(fā)育過程中尤為突出[14-16]。與健康成人相比[17-18],AD患者大腦中顳葉新皮層、海馬區(qū)等與記憶功能相關(guān)的區(qū)域miR-9表達水平顯著升高,結(jié)合本實驗的結(jié)果,VD 模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)障礙可能與過度表達的miR-9相關(guān),VD大鼠海馬組織中miR-9的表達含量明顯升高。由于miR-9可促進血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達,故對血管生成具有促進作用[19]。此外,miR-9的表達受到抑制時,慢性腦灌注不足模型大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力可得到一定程度的改善,并能夠通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元、增強突觸可塑性、減少神經(jīng)元丟失等途徑而發(fā)揮腦保護作用[14,20]。經(jīng)通竅活血湯治療后大鼠海馬組織的miR-9、miR-124表達水平下降,綜上,推測通竅活血湯治療VD的途徑可能是通過其改善局部腦灌注及代謝、調(diào)節(jié)突觸可塑性、調(diào)節(jié)神經(jīng)元等途徑,促進miR-9及miR-124在病理狀態(tài)下改善內(nèi)環(huán)境,起到改善認(rèn)知障礙的作用。

綜上所述,通竅活血湯可有效改善VD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙程度,VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能與海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞程度具有一定相關(guān)性,miR-9、miR-124的異常表達可能是VD的發(fā)病機制之一,通竅活血湯治療VD可能是通過抑制miR-9、miR-124的過度表達發(fā)揮治療作用。