蘭永利,周知然,韋 芳,霍新慧

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊830001;2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊830001)

隨著人們生活方式的變化,酒精的長(zhǎng)期飲用逐漸成為刺激胃腸組織器官正常生理結(jié)構(gòu)的主要因素之一,其中胃黏膜的損傷就是酒精刺激直接引起的組織損傷[1]。胃黏膜損傷主要為黏膜組織的充血、水腫、糜爛、潰瘍,病變較重時(shí)侵及黏膜,發(fā)生上消化道出血[2]。有研究顯示,炎癥反應(yīng)在胃黏膜組織病變中擔(dān)任著關(guān)鍵的角色[3],炎癥反應(yīng)是機(jī)體應(yīng)對(duì)有害刺激而促進(jìn)修復(fù)的自我防御措施,然而當(dāng)炎性因子分泌過多時(shí),會(huì)使原本的穩(wěn)態(tài)環(huán)境被打破,導(dǎo)致疾病的進(jìn)一步惡化發(fā)展。

針灸作為中醫(yī)學(xué)的重要組成部分,在經(jīng)絡(luò)辨證的指導(dǎo)下,在疾病防治方面具有實(shí)用價(jià)值[4-5]。特別是灸法,以其特有的綠色療法和簡(jiǎn)便性的特點(diǎn),在臨床認(rèn)可度比較高。本課題組前期研究表明[6],針灸預(yù)處理能夠加強(qiáng)胃黏膜微循環(huán)屏障,上調(diào)與屏障相關(guān)的保護(hù)因子,下調(diào)損傷因子,達(dá)到對(duì)胃黏膜組織的保護(hù)作用。

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號(hào)通路主要是與炎性因子,如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-β(IL-β)等的釋放有關(guān),在炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用[7]。此研究是基于對(duì)大鼠胃黏膜中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平的觀察,進(jìn)一步探究針灸對(duì)胃黏膜“治未病”的作用機(jī)制,為應(yīng)用于臨床預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí),雌雄各半SD大鼠52只,體重(180±20)g,新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購得,動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(新)2018-0003,由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心喂養(yǎng)。大鼠自由攝食、攝水,飼養(yǎng)室溫度:20～25 ℃,相對(duì)濕度:50%～54%,自然晝夜交替。在實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)全程動(dòng)物處理遵照本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)要求進(jìn)行。

1.2 藥物與試劑 無水乙醇(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司),阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字J20130078),大鼠TNF-α ELISA試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司,批號(hào):YX-E21174);大鼠IL-1β ELISA試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司,批號(hào):YX-E20958)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 實(shí)驗(yàn)用一次性針灸針(華佗牌,規(guī)格0.25 mm×13 mm),艾灸條(南陽漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司,規(guī)格4 mm×120 mm),固定支架(蘄春上工記艾灸器具開發(fā)有限公司),酶標(biāo)分析儀(型號(hào):Infinite F50,上海優(yōu)選生物科技有限公司),高速冷凍離心機(jī)(德國(guó),型號(hào):Eppendorf 5415C),分光光度計(jì)(日本,型號(hào):SHIMAZDU UV-2540),蛋白印跡儀(臺(tái)灣威泰克有限公司,型號(hào): Yrdimes SW07D0567),臺(tái)式恒溫振蕩器(中國(guó)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,型號(hào):THZ-312),凝膠成像分析系統(tǒng)(臺(tái)灣威泰克有限公司,型號(hào):KETAM多用凝膠成像系統(tǒng))。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組與干預(yù)方式:采用數(shù)字編號(hào)法對(duì)大鼠進(jìn)行標(biāo)號(hào),而后按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為正常組、模型組、預(yù)灸組、針預(yù)組,每組13只。在適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d之后,每日上午10:00開始進(jìn)行針灸預(yù)處理的干預(yù)操作。

腧穴的取穴依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》常用動(dòng)物穴位定位法進(jìn)行確定[8]。中脘穴位于臍上約 20 mm;足三里穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨小頭下約3 mm處。

正常組:艾灸支架固定,20 min/次,不做處理,1次/d,連續(xù)7 d;模型組:艾灸支架固定,20 min/次,不做處理,1次/d,連續(xù)7 d;預(yù)灸組:艾灸支架固定,溫和灸懸灸中脘、足三里(雙),20 min/次,1次/d,持續(xù)7 d;針預(yù)組:艾灸支架固定,一次性針灸毫針針刺中脘、足三里(雙),平補(bǔ)平瀉,20 min/次,1次/d,持續(xù)7 d;每次處理結(jié)束之后,解除大鼠支架固定,回飼養(yǎng)室進(jìn)行正常喂養(yǎng),連續(xù)預(yù)處理7 d。

1.4.2 造模:在預(yù)處理7 d結(jié)束之后,第8天禁食不禁水,第9天開始對(duì)模型組、預(yù)灸組、針預(yù)組進(jìn)行胃黏膜損傷模型的制備。應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室常用灌胃手法,采用無水乙醇與阿司匹林混懸液法建立模型,阿司匹林腸溶片與0.9%氯化鈉溶液(2000 mg∶100 ml)配制成阿司匹林混懸液,先用無水乙醇0.6 ml/100 g進(jìn)行灌胃,1 h后再予以阿司匹林混懸液200 mg/kg進(jìn)行灌胃造模,造模4 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血清及胃黏膜組織采集:第1天造模結(jié)束后,當(dāng)天22:00禁食禁水,第13天上午10:00開始取材。采用10%水合氯醛麻醉,起效后,腹主動(dòng)脈取血,使用離心機(jī)離心后取上層血清,解剖將全胃取出,沿胃大彎剪開,用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈,充分暴露胃黏膜組織,拍照觀察胃黏膜損傷情況,評(píng)定胃黏膜損傷指數(shù)(UI),后分成兩部分,一部分在4%多聚甲醛中固定,用于指標(biāo)檢測(cè),另一部分儲(chǔ)存于-80 ℃液氮中。

1.5.2 一般情況及體重:對(duì)大鼠攝水?dāng)z食、毛發(fā)、大便、活動(dòng)度,精神、體重等一般情況進(jìn)行觀察[9],體重每4 d測(cè)量1次。

1.5.3 評(píng)定胃黏膜損傷指數(shù)(UI):采用GUTH[10]法進(jìn)行計(jì)算。將胃黏膜組織應(yīng)用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈,然后平鋪于濾紙上,在10倍放大鏡下,用肉眼觀察,卡尺測(cè)量評(píng)估損傷程度:1分為損傷(包括糜爛點(diǎn))<1 mm;損傷介于1～2 mm為2分;損傷介于2～3 mm為3分;損傷介于3～4 mm為4分;損傷>4 mm為5分;損傷寬度>2 mm的時(shí)候計(jì)分加倍。UI評(píng)分為胃黏膜各處損傷計(jì)分后值的累加。

1.5.4 ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β濃度:腹主動(dòng)脈取血,3000 r/min離心20 min,收集上清液,并在-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存待測(cè)。嚴(yán)格遵照ELISA試劑盒方法說明進(jìn)行操作,計(jì)算TNF-α、IL-1β的濃度。

1.5.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃黏膜組織TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá):嚴(yán)格按照試劑盒方法進(jìn)行操作,將常規(guī)石蠟包埋和組織切片經(jīng)抗原修復(fù)后,用正常羊血清液封閉20 min,將配制好的TLR4工作液(1∶50稀釋)以及MyD88、NF-κB一抗工作液(1∶100稀釋)滴加在組織上,4 ℃過夜,PBS洗滌后滴加生物素化第二抗體、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP),DAB顯色、復(fù)染、封片后,400倍的顯微照相,并進(jìn)行圖像分析。

1.5.6 Western blot檢測(cè)胃黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達(dá):取100 mg胃黏膜固體組織,在培養(yǎng)皿中剪碎成3 mm×3 mm左右的小塊,使用0.5～1 ml冷RIPA裂解液進(jìn)行勻漿,充分裂解后,離心20 min(4 ℃、10000 r/min)取上清液,蛋白濃度采用BCA法測(cè)定。進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入對(duì)應(yīng)的TLR4、MyD88和NF-κB(1∶1000)一抗,4 ℃孵育過夜,用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗(1∶8000),室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1～2 h。洗膜10 min 3次后,ECL發(fā)光法顯色。使用Gel-Pro Analyzer 4軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,使用Graph Pad Prism 8軟件制作圖。數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析,方差齊用LSD法分析,方差不齊用 Dunnett’sT3法;P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模前及針灸預(yù)處理期間,四組大鼠攝水?dāng)z食及二便情況正常,毛發(fā)有光澤、靈活好動(dòng),精神良好,體重上升。造模期間,模型組大鼠攝水?dāng)z食量較前明顯減少,大便夾有血絲,毛發(fā)暗淡,精神萎靡,體重下降;預(yù)灸組和針預(yù)組大鼠較模型組情況都較輕,與針預(yù)組相比,預(yù)灸組大鼠體重有所上升。見表1。

表1 各組大鼠造模前、預(yù)處理、造模后體重比較(g)

2.2 各組大鼠UI評(píng)分比較 見表2(圖1)。正常組胃黏膜組織表面光滑,與正常組相比,模型組胃黏膜組織表面出現(xiàn)明顯出血灶,UI指數(shù)上升(P<0.05),提示模型制備成功;與模型組相比,預(yù)灸組和針預(yù)組胃黏膜組織表面只有少量出血灶,UI指數(shù)下降(P<0.05),提示針灸預(yù)處理對(duì)預(yù)防胃黏膜損傷有效;與針預(yù)組相比,預(yù)灸組胃黏膜組織表面出血灶點(diǎn)更少,UI指數(shù)下降(P<0.05),提示艾灸效果強(qiáng)于針刺。

圖1 胃黏膜組織在肉眼下的形態(tài)表現(xiàn)

表2 各組大鼠UI評(píng)分比較(分)

2.3 各組大鼠胃黏膜TNF-α、IL-1β濃度比較 見表3。與正常組相比,模型組大鼠TNF-α、IL-1β濃度上升(P<0.05);與模型組相比,預(yù)灸組和針預(yù)組大鼠TNF-α、IL-1β濃度均明顯下降(P<0.05),與針預(yù)組相比,預(yù)灸組大鼠TNF-α、IL-1β濃度均明顯下降(P<0.05)。

表3 各組大鼠胃黏膜TNF-α、IL-1β濃度比較(pg/ml)

2.4 各組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果比較 見表4(圖2～4)。與正常組比較,模型組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,預(yù)灸組和針預(yù)組TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)均顯著降低(P<0.05);與針預(yù)組比較,預(yù)灸組TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)均降低(P<0.05)。

圖2 灸預(yù)處理對(duì)胃黏膜損傷大鼠胃黏膜TLR4蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×200)

表4 各組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果比較

2.5 各組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果比較 見表5(圖5)。與正常組比較,模型組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組比較,預(yù)灸組和針預(yù)組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與針預(yù)組比較,預(yù)灸組大鼠TLR4、 MyD88蛋白表達(dá)降低(P<0.05),NF-κB p65蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖5 各組大鼠胃黏膜組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白免疫印跡圖

表5 各組大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果比較

3 討 論

胃黏膜組織作為胃的第一道保護(hù)屏障,確保胃黏膜的完整性可以增強(qiáng)胃黏膜組織的自我修復(fù)和防御能力,而一旦胃黏膜受到損傷,就會(huì)導(dǎo)致胃黏膜病變相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展[11],因此對(duì)胃黏膜損傷的預(yù)防成為人們所關(guān)注的熱點(diǎn)?！镀⑽刚摗分兄赋銎⑽杆ザ俨∩?《內(nèi)經(jīng)》中指出正氣存內(nèi)、邪不可干,說明機(jī)體正氣不足,會(huì)引起邪氣入侵,導(dǎo)致疾病[12]。根據(jù)患者胃黏膜損傷后的臨床表現(xiàn),其在中醫(yī)學(xué)中屬于“胃脘痛”[13],病因主要為外邪侵襲、脾胃虛弱、生活不規(guī)律等[14]。根據(jù)中醫(yī)理論,脾胃之病重在養(yǎng)護(hù),脾胃為“后天之本、氣血生化之源”,脾氣衰則氣血生化乏源,無法將水谷轉(zhuǎn)化為人體所需的精微物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)全身,導(dǎo)致人體陰陽失衡,容易受到病邪侵襲[15]。針灸通過“未病先防”理論調(diào)整機(jī)體生理功能,激發(fā)自我修復(fù)的能力,維持人體陰陽平衡,預(yù)防疾病發(fā)生發(fā)展[16]。孫思邈首次在《備急千金要方》中提出了灸法“治未病”理論,其中記載了灸法對(duì)于疾病的防治和保健都具有重要的作用,奠定了灸法“治未病”的理論基礎(chǔ)[17]。艾葉作為灸法的常用中藥,其味辛、苦,性溫,其功用為溫通散寒。脾胃喜溫,艾灸可通過溫?zé)岽碳す套o(hù)脾胃之氣,來達(dá)到調(diào)整人體氣血陰陽的目的。對(duì)于胃黏膜損傷的治療,有研究表明[18],艾灸胃經(jīng)穴可增加胃黏膜血流量,減輕胃黏膜損傷病理狀態(tài)。

應(yīng)用六腑的下合穴與本經(jīng)募穴配合,治療六腑病證的配穴方法稱為“合募配穴”[19]?！昂现蝺?nèi)腑”,下合穴常常治療六腑相關(guān)病癥,募穴偏于治療腑病和陽經(jīng)病癥,合募配穴通過調(diào)暢氣機(jī)來達(dá)到治療腑病的目的[20]。足陽明胃經(jīng)的下合穴為足三里,臨床作為防病保健,扶正祛邪的要穴,中脘為胃之募穴,二者合用可調(diào)理脾胃、扶助正氣。有實(shí)驗(yàn)證明[21],針刺、艾灸足三里和中脘穴可改善機(jī)體微循環(huán),調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能,增強(qiáng)胃黏膜的自我修復(fù)和防御能力,達(dá)到理想的治療效果。

本實(shí)驗(yàn)基于無水乙醇和阿司匹林混懸液制備胃黏膜損傷模型。無水乙醇可直接對(duì)胃黏膜造成損傷,并可降低胃黏膜自我修復(fù)因子的保護(hù)作用,是一種高刺激性損傷胃黏膜的攻擊因子[22]。阿司匹林混懸液會(huì)使環(huán)氧合酶的活性降低,從而使胃黏膜黏液、血流量降低,防御力下降[23],導(dǎo)致胃黏膜損傷。采用兩種藥物進(jìn)行大鼠胃黏膜損傷模型的制備,可加大對(duì)胃黏膜組織的刺激,縮短模型制備時(shí)間,增加成功率。HE染色觀察大鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化,可見大鼠胃黏膜組織出現(xiàn)出血灶,并且有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),提示模型制備成功。

TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要途徑之一,在免疫及炎癥機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[24]。TLRs是一類機(jī)體內(nèi)天然的免疫受體,MyD88作為TLR4的下行信號(hào)因子[25],在炎性因子(TNF-α、IL-6)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時(shí),TLR4介導(dǎo)MyD88下行表達(dá),進(jìn)而磷酸化NF-κB因子,激活炎性因子的釋放,參與炎癥反應(yīng)[26]。在本實(shí)驗(yàn)研究中,與正常組相比,模型組大鼠胃黏膜組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)均顯著升高;與模型組比較,預(yù)灸組和針預(yù)組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低;與針預(yù)組比較,預(yù)灸組大鼠TLR4、 MyD88蛋白表達(dá)降低,NF-κB p65蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明,針灸預(yù)處理可通過影響TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平,減少炎性因子的釋放,抑制通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而預(yù)防胃黏膜的損傷程度。

綜上所述,針灸預(yù)處理可以降低TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平,減少炎性因子的釋放,增強(qiáng)胃黏膜的自我修復(fù)和防御能力,從而對(duì)胃黏膜起到保護(hù)作用。與針預(yù)組比較,預(yù)灸組大鼠TLR4、 MyD88蛋白表達(dá)降低,NF-κB p65蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示針刺和艾灸兩者對(duì)胃黏膜保護(hù)的效應(yīng)相同,可能調(diào)控的機(jī)制存在著不同,需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討,為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。