林萍萍 李富博 王東娟 郭研 董怡

承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科（河北承德 067000）

食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌的主要亞型，順鉑（cisplatin，CDDP）是治療ESCC 的首選藥物［1-2］。然而，耐藥性限制了CDDP 的實際效果與臨床應用［3］。環(huán)狀RNA（circRNA）為一種參與CDDP 耐藥的非編碼基因［4］。環(huán)狀RNA 脂蛋白受體6（circular RNA lipoprotein receptor 6，circLRP6）是ESCC 中的一種新型致癌circRNA，其表達水平在ESCC中增加，可促進ESCC腫瘤發(fā)生［5］。然而，circLRP6 對ESCC 化療耐藥的影響和機制尚未完全闡明。

通過生物信息學數(shù)據(jù)庫對circLRP6的靶miRNA進行預測，發(fā)現(xiàn)circLRP6 序列與多種miRNA 存在互補的結(jié)合位點，通過對比既往的文獻報道，篩選其中與“CDDP 耐藥”、“食管癌”、“ESCC”相關(guān)的靶miRNA，最終miRNA-125a-5p（miR-125a-5p）被選定為circLRP 的靶基因。因為miR-125a-5p 已被證實參與多種腫瘤的CDDP 耐藥，包括宮頸癌［6］、口腔鱗狀細胞癌［7］和ESCC［8］。據(jù)報道，miR-125a-5p 在ESCC中呈低表達，過表達miR-125a-5p可增強ESCC細胞對CDDP 的敏感性［8］。此外，生物信息學預測顯示，miR-125a-5p 與髓樣細胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）的3'-UTR 區(qū)存在結(jié)合位點。MCL-1 高表達是癌細胞逃避化療試劑誘導的細胞死亡的關(guān)鍵因素［9-10］。在ESCC 中靶向下調(diào)MCL-1 可恢復其對CDDP 化療的敏感性［11］。本研究旨在闡明這三個分子在ESCC 的CDDP 耐藥中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期為ESCC 的耐藥機制研究和靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 收集2019 年1 月至2022 年1 月在本院接受切除手術(shù)的ESCC 患者，共獲得60 對ESCC 組織樣本（ESCC 組，其中Ⅰ、Ⅱ期36 例，Ⅲ期24 例；CDDP 耐藥27 例，CDDP 敏感患者33 例）及癌旁組織樣本（對照組），組織立即在液氮中冷凍，然后儲存在-80 ℃冰箱中用于mRNA 提取和分析。年齡范圍為50 ～ 72 歲，平均為（60.1 ± 7.5）歲，所有患者均接受CDDP 治療。CDDP 耐藥患者為基于CDDP 的化療期間腫瘤復發(fā)，CDDP 敏感患者為基于CDDP 的化療期間沒有腫瘤復發(fā)。納入標準：（1）經(jīng)病理檢查確診為ESCC 者；（2）患者均為在本院初診初治的行CDDP 規(guī)范化療的病例；（3）有完整的臨床資料，可進行隨訪（包括腫瘤復發(fā)時間和總生存期）。排除標準：（1）合并心腦卒中、免疫缺陷病或自身免疫疾病、血液系統(tǒng)疾病者；（2）術(shù)前接受過除CDDP 外的其他抗腫瘤治療；（3）合并食管外惡性腫瘤者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（審批號：201901003），并獲得所有患者的知情同意。

1.2 細胞培養(yǎng) 人正常食管上皮細胞株Het-1A 購自上海烜雅生物科技有限公司（XY-XB-1467），人ESCC 細胞株（KYSE-150、KYSE-30、TE-1 和EC109）購自武漢普諾賽生命科技有限公司（CL-0638、CL-0577、CL-0231、CL-0077）。細胞均用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 CDDP 抗性細胞系的建立 KYSE30 的CDDP抗性細胞（KYSE30/CDDP-R）是通過在6 個月內(nèi)逐漸增加濃度的CDDP（從0.2 ～ 10 μmol/L）建立的。在RPMI-1640 培養(yǎng)基中加10% FBS，將處于對數(shù)期的KYSE30 細胞以0.2 μmol/L 的初始濃度暴露于CDDP。48 h 后，用PBS 洗滌處理過的KYSE30 細胞3 次，并在不含CDDP 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在達到70% ～ 80%匯合時，ESCC 細胞以較高濃度暴露于CDDP（每代增加10% ～ 20%）。重復上述處理直至達到10 μmol/L 的濃度，得到對CDDP具有抗性的KYSE30 細胞。

1.4 主要試劑與儀器 靶向circLRP6 的小分子干擾RNA（circLRP6 siRNA，si-circLRP6）、miR-125a-5p mimic 和miR-125a-5p inhibitor 及其陰性對照（si-NC、miR-NC 和inhibitor-NC）購自廣州RiboBio公司；SYBR Green Premix Ex Taq 熒光定量試劑盒（RR820A）、PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A）購自日本TAKARA 公司；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（LM-130957）和miRNA 熒光定量PCR 試劑盒（LM-0132）購自上海聯(lián)邁生物工程公司等。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測組織/細胞中circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 mRNA表達 從組織/細胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后進行PCR 擴增，檢測circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 表達，GAPDH、U6 為內(nèi)參。為了驗證circLRP6 在KYSE30/CDDP-R 細胞中的穩(wěn)定性，總RNA（2 μg）在37 ℃下孵育30 min，用或不用3 U/μg RNase R處理KYSE30/CDDP-R細胞以驗證circRNA的環(huán)狀特征?；虻南鄬Ρ磉_量由2-ΔΔCt法計算。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物Tab.1 RT-qPCR primers

1.6 KYSE30 細胞和KYSE30/CDDP-R 細胞對CDDP 的敏感性檢測 將KYSE30 細胞和KYSE30/CDDP-R 細胞消化后重懸并接種到96 孔板（2 ×103個細胞/孔）。用不同劑量（0、1、2、5、10 和15 μmol/L）的CDDP 處理48 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液并再孵育2 h。在酶標儀上檢測各孔在450 nm 處的吸光度（A）值，計算細胞活力。通過相對存活曲線分析CDDP 的半數(shù)抑制濃度（IC50）。細胞活力（%） = （CDDP 處理組A值/對照組A值）× 100%。

1.7 Western blot 檢測細胞中MCL-1 蛋白表達 從細胞中提取總蛋白，將等量蛋白質(zhì)（50 μg/泳道）通過10% SDS-PAGE 分離并轉(zhuǎn)膜，封閉膜2 h，與一抗MCL-1（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）在4 ℃下孵育過夜。室溫下將二抗（1∶5 000）添加到膜中孵育2 h。顯影，Image J 1.8.0 版軟件用于灰度分析；GAPDH 為內(nèi)參。

1.8 流式細胞儀分析細胞凋亡 轉(zhuǎn)染后用10 μmol/L CDDP 處理各組細胞48 h，然后收集、洗滌和重懸各組細胞，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，避光孵育15 min 以染色細胞。用流式細胞儀分析凋亡細胞。

1.9 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)表示為均值±標準差，使用GraphPad Prism 8.0 進行分析。兩組間比較采用t檢驗，單向方差分析和SNK-q檢驗用于多組間比較（兩組以上）。circLRP6 和miR-125a-5p、miR-125a-5p 和MCL-1 以及miR-125a-5p 和circLRP6 之間的相關(guān)性是通過Pearson 相關(guān)性分析來確定的。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CircLRP6 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性驗證 CircLRP6 來源于LRP6 基因的外顯子2，其剪接成熟序列長度為394 bp（圖1A）；然后發(fā)現(xiàn)circLRP6 相對于線性LRP6 mRNA 可顯著抵抗RNase R 降解（圖1B），表明circLRP6 比LRP6 更穩(wěn)定。

圖1 circLRP6 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性驗證Fig.1 Structural stability verification of circLRP6

2.2 CircLRP6 在ESCC 組織和細胞中的表達 與對照組相比，ESCC 組癌組織中circLRP6、MCL-1 mRNA水平升高，miR-125a-5p水平降低（P＜ 0.001）（圖2）。根據(jù)RT-qPCR 確定的circLRP6 表達水平的平均值將ESCC 患者分為兩組，高于或低于平均值的circLRP6 表達分別被認為是高或低表達，發(fā)現(xiàn)circLRP6 表達與CDDP 敏感性、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜ 0.05，表2）。此外，CDDP 耐藥患者癌組織中circLRP6、MCL-1 mRNA 水平高于CDDP 敏感患者，而miR-125a-5p 水平低于CDDP 敏感患者（P＜ 0.001，圖3）。

圖2 ESCC 患者癌組織中circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 mRNA 表達比較Fig.2 Comparison of circLRP6，miR-125a-5p and MCL-1 mRNA expression in cancer tissues of ESCC patients

圖3 CDDP 耐藥/敏感患者癌組織中circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 mRNA 表達比較Fig.3 Comparison of circLRP6，miR-125a-5p and MCL-1 mRNA expression in cancer tissues of CDDP-resistant/sensitive patients

表2 CircLRP6 表達與ESCC 患者臨床特征的相關(guān)性Tab.2 Correlation between CircLRP6 expression and clinical characteristics of ESCC patients

與Het-1A 細胞相比，ESCC 細胞株中circLRP6和MCL-1 mRNA 水平升高，miR-125a-5p 水平降低（P＜ 0.001），KYSE-30 細胞中circLRP6 和MCL-1 mRNA 水平最高，miR-125a-5p 水平最低（P＜ 0.05，圖4）。故選擇KYSE-30 細胞為后續(xù)實驗對象。

圖4 不同人ESCC 細胞中circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 mRNA 表達水平比較（n = 6）Fig.4 Comparison of circLRP6，miR-125a-5p and MCL-1 mRNA expression levels in different human ESCC cells （n = 6）

2.3 KYSE30 細胞和KYSE30/CDDP-R 細胞對CDDP 的敏感性 與KYSE30 細胞相比，KYSE30/CDDP-R 細胞中CDDP 的IC50增加（表3）。此外，KYSE30/CDDP-R 細胞中circLRP6 表達水平［（3.06± 0.27）vs.（1.02 ± 0.14），P＜ 0.05］和MCL-1 mRNA水平［（3.59 ± 0.30）vs.（1.01 ± 0.12），P＜ 0.05］高于KYSE30 細胞，miR-125a-5p 水平低于KYSE30 細胞［（0.25 ± 0.04）vs.（1.00 ± 0.09），P＜ 0.05］。

表3 DDP 對HCT116 細胞和HCT116/DDP 細胞活力的影響Tab.3 Effects of DDP on the viability of HCT116 cells and HCT116/DDP cells ±s

表3 DDP 對HCT116 細胞和HCT116/DDP 細胞活力的影響Tab.3 Effects of DDP on the viability of HCT116 cells and HCT116/DDP cells ±s

注：與對照組（0）相比，*P ＜ 0.05

CDDP濃度（μmol/L）細胞活力（%）KYSE30細胞100.00 ± 0.00 81.35 ± 4.57*65.40 ± 4.10*42.63 ± 3.95*30.91 ± 3.42*21.74 ± 2.83*3.981 0 1 2 5 10 15 IC50（μmol/L）KYSE30/CDDP-R細胞100.00 ± 0.00 97.72 ± 9.81 91.58 ± 9.35 78.30 ± 8.22*65.45 ± 7.16*51.20 ± 5.94*20.300

2.4 沉默circLRP6 對KYSE30/CDDP-R 細胞中miR-125a-5p 和MCL-1 表達的影響 與Control組、si-NC 組比較，si-circLRP6 組circLRP6、MCL-1的mRNA 和蛋白水平降低，miR-125a-5p 水平升高（P＜ 0.05）；與si-circLRP6 組、si-circLRP6+anti-NC組比較，si-circLRP6+anti-miR-125a-5p 組MCL-1 的mRNA 和蛋白水平升高，miR-125a-5p 水平降低（P＜ 0.05）。見圖5。

圖5 各組KYSE30/CDDP-R 細胞中circLRP6、miR-125a-5p 和MCL-1 表達水平比較（n = 6）Fig.5 Comparison of expression levels of circLRP6，miR-125a-5p and MCL-1 in KYSE30/CDDP-R cells in each group （n = 6）

2.5 沉默circLRP6 對KYSE30/CDDP-R 細胞CDDP 敏感性的影響 與Control 組、si-NC 組比較，si-circLRP6 組KYSE30/CDDP-R 細胞中CDDP的IC50降低；與si-circLRP6 組、si-circLRP6+anti-NC組比較，si-circLRP6+anti-miR-125a-5p 組KYSE30/CDDP-R 細胞中CDDP 的IC50升高（P＜ 0.05）；見表4。

表4 沉默circLRP6 對KYSE30/CDDP-R 細胞CDDP 敏感性的影響Tab.4 Effects of silencing circLRP6 on CDDP sensitivity of KYSE30/CDDP-R cells ±s

表4 沉默circLRP6 對KYSE30/CDDP-R 細胞CDDP 敏感性的影響Tab.4 Effects of silencing circLRP6 on CDDP sensitivity of KYSE30/CDDP-R cells ±s

注：與對照組（0）相比，*P ＜ 0.05

CDDP濃度（μmol/L）細胞活力（%）si-circLRP6+anti-miR-125a-5p 100.00 ± 0.00 92.35 ± 9.18 81.64 ± 8.20*69.50 ± 6.93*54.71 ± 5.82*43.62 ± 5.01*12.150 si-NC 100.00 ± 0.00 96.20 ± 9.57 92.16 ± 9.14 80.25 ± 8.56*67.10 ± 7.08*51.33 ± 5.65*21.325 0 1 2 5 10 15 IC50（μmol/L）Control 100.00 ± 0.00 95.80 ± 9.64 88.75 ± 9.20 77.43 ± 8.15*64.92 ± 6.83*50.75 ± 5.42*20.114 si-circLRP6 100.00 ± 0.00 75.71 ± 8.05*61.43 ± 7.02*49.25 ± 6.01*41.96 ± 4.86*32.52 ± 3.74*4.982 si-circLRP6+anti-NC 100.00 ± 0.00 79.99 ± 8.02*64.36 ± 6.15*48.28 ± 5.64*37.53 ± 5.01*30.41 ± 3.69*4.854

2.6 沉默circLRP6 對CDDP 誘導的KYSE30/CDDP-R 細胞凋亡的影響 與Control 組、si-NC 組比較，si-circLRP6 組KYSE30/CDDP-R 細胞凋亡率升高（P＜ 0.05）；與si-circLRP6 組、si-circLRP6+anti-NC 組比較，si-circLRP6+anti-miR-125a-5p 組KYSE30/CDDP-R 細胞凋亡率降低（P＜ 0.05）；見圖6。

圖6 各組KYSE30/CDDP-R 細胞凋亡情況（流式細胞術(shù)）Fig.6 Apoptosis of KYSE30/CDDP-R cells in each group （flow cytometry）

3 討論

circRNA 在腫瘤耐藥性過程中發(fā)揮重要作用［13］。據(jù)報道，circLRP6 可促進骨肉瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移［14］；并可驅(qū)動ESCC 的腫瘤發(fā)生［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，circLRP6 在ESCC 患者中的高表達與CDDP敏感性、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且circLRP6在CDDP 耐藥ESCC 患者中的表達高于CDDP 敏感患者，表明circLRP6 可能與CDDP 耐藥相關(guān)?；谏鲜雠R床意義，筆者建立了抗CDDP 的ESCC 細胞系，以進一步研究circLRP6 可能的功能機制。結(jié)果顯示，敲低circLRP6 后，CDDP 抗性ESCC 細胞對CDDP 的敏感性增強，且增加了CDDP 誘導細胞凋亡。CircRNA 的功能部分取決于其亞細胞定位［15］。為了確定circLRP6 的功能機制，筆者首先檢測了它在ESCC 細胞中的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)它主要位于細胞質(zhì)中，這與之前的研究［5］一致。對于細胞質(zhì)circRNA，充當海綿miRNA 是circRNA 調(diào)節(jié)化療相關(guān)靶基因常見和重要的轉(zhuǎn)錄后機制［16］。在宮頸癌中，miR-125a-5p 可通過下調(diào)LIM 激酶1 使宮頸癌細胞對CDDP 敏感，從而增加CDDP 的抗癌功效［6］。在本研究中，ESCC 標本中miR-125a-5p 與circLRP6呈負相關(guān)，且與CDDP敏感患者相比，在CDDP耐藥患者中miR-125a-5p 表達水平降低；表明circLRP6與miR-125a-5p 之間可能存在結(jié)合。此外，RIP 分析顯示circLRP6 與miR-125a-5p 在ESCC 細胞中占據(jù)相同的Ago2 位點形成RNA 誘導的沉默復合物（RISC），表明它們的相互作用可能影響下游mRNA的表達。此外，抑制miR-125a-5p 減弱了circLRP6沉默對CDDP 抗性ESCC 細胞中CDDP 耐藥性和細胞凋亡的影響。提示，沉默circLRP6 可能通過靶向上調(diào)miR-125a-5p 提高ESCC 中CDDP 的敏感性。MCL-1是一種關(guān)鍵的抗凋亡蛋白，據(jù)報道，MCL-1通過充當miR-148a-3p的靶標來抑制ESCC的進展［17］。YU等［11］揭示了MCL-1在ESCC中增加，敲低其表達可增強ESCC 細胞對CDDP 誘導的細胞凋亡。在本研究中，MCL-1 在CDDP 抗性ESCC 組織和細胞中升高，且CDDP 耐藥患者中MCL-1 的表達水平高于CDDP 敏感患者。

綜上所述，本研究首次探討了circLRP6 在CDDP 抗性中的作用。這些結(jié)果揭示了circLRP6敲低通過miR-125a-5p/MCL-1 軸增強了CDDP 抗性ESCC 細胞對CDDP 的敏感性。本研究為ESCC 靶向治療提供了新的思路，對于全面了解腫瘤細胞耐藥機制具有重要意義。然而，本研究存在一定的局限性。例如，circLRP6 可能靶向多個miRNA，且miR-125a-5p 可能與多個基因的3'-UTR 結(jié)合；circLRP6對CDDP耐藥性的影響是否有其他miRNA/mRNA 參與，仍需進一步證實。

【Author contributions】LIN Pingping performed the experiments and wrote the article.LI Fubo performed the experiments.WANG Dongjuan and GUO Yan revised the article.DONG Yi designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.