趙婷 曾博雅 馬佩杰 盧俊瑋 舒文將 強羽菲 鞠依珊△

(1.寶雞市中心醫(yī)院,陜西 寶雞 721008;2.寶雞市食品藥品檢驗檢測中心,陜西 寶雞 721013)

醫(yī)院制劑主要是針對本院臨床上需求量小、不適合進行工廠批量化生產(chǎn)的品種,控制其質(zhì)量是確保臨床用藥安全的前提[1]?？梢詫λ幤焚|(zhì)量產(chǎn)生影響的因素有很多,作為重要影響因素之一的微生物,對其進行控制是保證藥品質(zhì)量的重要手段[2]?？刂凭鷻z查法及微生物計數(shù)檢查法是檢查非規(guī)定滅菌制劑與其原輔料受微生物污染程度的重要方法[3]。口服中藥制劑作為目前常用的醫(yī)院內(nèi)醫(yī)療制劑,具有用量大、制作簡單及使用便捷等特點,且因其療效確切深受患者與醫(yī)生好評,由于中藥制劑的特殊性,致使其無法像西藥具有嚴格標準的制作流程,因此對醫(yī)院內(nèi)中藥制劑的微生物限度進行檢查常常不合格[4]。由于中藥制劑中含有多種成分,其中任何成分均可對微生物限度檢查結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響,因此藥品微生物限度檢查所使用的方法應(yīng)該與其他分析方法一樣被證明是適宜的,才可以確保檢查方法的準確完整[5-6]。微生物方法學(xué)試驗即向藥物制劑中加入一定量的試驗菌,驗證檢驗方法是否實用和有效[7]。上感合劑為我院院內(nèi)特色的口服中藥制劑,因其療效確切、臨床使用廣泛,為對其質(zhì)量進行控制,確保檢測方法的可靠性,使其微生物限度達到要求[8]。本研究根據(jù)2015年版《中國藥典》四部通則規(guī)定,對我院院內(nèi)制劑上感合劑進行微生物限度檢查的方法學(xué)驗證試驗,建立了該制劑微生物限度的檢查方法。

1 材料與方法

1.1主要儀器 BHC-1300ⅡA2型生物安全柜(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);SPX-150型生化培養(yǎng)箱(慧科電子有限公司);KB-240型生化培養(yǎng)箱(德國BINDER公司);YXQ-LS-100SⅡ型立式壓力滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);BSA2202S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);VITEK2全自動微生物鑒定藥敏系統(tǒng)法國梅里埃有限公司);Olympus顯微鏡(日本奧林巴斯公司)[9]。

1.2材料

1.2.1供試品 上感合劑(批號:190527,規(guī)格:200 ml/瓶),由我院制劑室提供。

1.2.2菌種 大腸埃希菌[CMCC(F)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501][10-15]、 黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001][1,6]。以上試驗用菌株均為第3代,且來自于中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心。

1.2.3培養(yǎng)基及稀釋液 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號:1703082)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號:180420)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號:180711)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號:1703232)[1,8-9,14]、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號:180301)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號:180207)、PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號:1806222)。以上培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn),適用性檢查符合要求。

1.3方法

1.3.1菌液的制備 分別將大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄菌接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,置于33℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)20 h[5-6,10-11,14,16-19],用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌量為103～104cfu/mL的混懸液。將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,置于23℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)3 d[10,14,16],用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌量為103～104cfu/mL的混懸液。將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中,置于23℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)5 d,加入5 mL含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液,洗脫孢子,收集孢子懸液,制成含霉菌孢子數(shù)為103～104cfu的黑曲霉孢子混懸液。

1.3.2培養(yǎng)基稀釋法制備供試液 取兩瓶上感合劑,混合均勻,作為供試品原液。量取10 mL供試品原液,加100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,振搖,使其分散均勻,制成1:10的供試液。

1.3.3需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法學(xué)驗證試驗 (1)試驗組:量取制備好的1:10供試液分裝于5個無菌試管中,每管分別為9.9 mL,再分別加入制備好的含菌量為103～104cfu/mL的枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉菌懸液0.1 mL,含菌量不大于100 cfu,混勻[10,12,16]。(2)供試品對照組:量取制備好的1:10供試液9.9 mL,加入0.1 mL PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液,混勻。(3)菌液對照組:量取PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液分裝于5個無菌試管中,每管分別為9.9 mL,操作同試驗組。(4)陰性對照組:用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液及供試品,操作同試驗組。(5)平皿傾注法對供試品微生物回收:量取1 mL制備好的試驗組供試液,置于直徑90 mm的無菌平皿中,注入20 mL溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,待凝固,胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基倒置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒置23℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,分別進行計數(shù)。供試品5種試驗菌的回收率均需進行3次重復(fù)試驗,計算平均菌落數(shù)[9-10]。同法對菌液對照組、供試品對照組及陰性對照組的菌落數(shù)進行測定。

1.3.4控制菌大腸埃希菌的檢查方法學(xué)驗證試驗 (1)試驗組:量取1:10供試液10 mL接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL中,同時接入大腸埃希菌含菌量不大于100 cfu,混勻,置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h[10]。(2)供試品對照組:量取10 mL 1:10供試液,以稀釋液PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液,操作同試驗組。(3)陰性對照組:以稀釋液PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液與供試液,操作同試驗組[8]。(4)選擇和分離培養(yǎng):分別量取1 mL上述三組培養(yǎng)物接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基,置于43℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,將麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平皿上,置于33℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h,觀察[10,14,16-17]。

2 結(jié) 果

2.1需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法學(xué)驗證試驗結(jié)果 結(jié)果判定:回收率(%)=(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液對照組平均菌落數(shù)×100%[20-21],若回收率在0.5～2.0范圍內(nèi)[22],上感合劑的需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)的方法學(xué)驗證試驗合格[11,14,16,19]。結(jié)果顯示:本批次上感合劑,采用培養(yǎng)基稀釋法進行測定銅綠假單胞菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌的回收率均在0.5～2.0范圍內(nèi)[22],提示上感合劑的需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查方法學(xué)驗證合格[8-10,12,15-16]。見表1、表2。

2.2控制菌大腸埃希菌的檢查方法學(xué)驗證試驗結(jié)果 結(jié)果判定:若菌液組能檢出大腸埃希菌,供試品對照組與陰性對照組均未檢出,可判定上感合劑的控制菌大腸埃希菌的檢查方法驗證試驗合格[15]。結(jié)果顯示:供試品對照組與陰性對照組均未檢出試驗菌,而試驗組檢出試驗菌,檢出的試驗菌經(jīng)鑒定為大腸埃希菌,提示上感合劑的控制菌檢查方法驗證合格。見表3、表4。

表3 控制菌(大腸埃希菌)檢查方法學(xué)驗證試驗結(jié)果Ⅰ

表4 控制菌(大腸埃希菌)檢查方法學(xué)驗證試驗結(jié)果Ⅱ

3 討 論

微生物限度檢驗需確認供試品在該檢驗條件、檢驗量下無抑菌活性或者抑菌活性已經(jīng)被充分消除,才可以保證檢驗結(jié)果能真實的反映制劑受微生物污染的情況[23]。但由于中藥制劑通常成方藥味較多,藥不同抑菌活性強度不同,檢驗具有較強抑菌活性的制劑時,試驗過程中首先選擇方便有效的培養(yǎng)基稀釋法,醫(yī)院制劑上感合劑中含有連翹、金銀花等中藥,且金銀花含有的綠原酸成分具有極強的抗菌及抗病毒功能[24-26],連翹作為廣譜抗菌藥,可抑制多種細菌[27],但表1、2試驗結(jié)果顯示,含有連翹、金銀花的上感合劑對藥典規(guī)定驗證用的5種試驗菌株(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉)抑菌作用較小,且回收率均在0.5～2范圍內(nèi)[22],這可能是由于具有復(fù)雜成分的復(fù)方中藥制劑,在煎煮過程中,其中的某些藥物化學(xué)成分,受到空氣中的氧、熱、水的影響,不同組分之間產(chǎn)生了化學(xué)變化及相互作用,其生物活性與物理性質(zhì)發(fā)生改變[28],并且由于中藥復(fù)方的配伍不僅只是藥物數(shù)量上的簡單相加,而是通過藥物之間的相互配伍發(fā)生了質(zhì)的改變[29]。這些均導(dǎo)致含有抑菌作用連翹、金銀花的上感合劑僅使用簡單的培養(yǎng)基稀釋法就能有效的將供試品的抑菌作用消除。因此,培養(yǎng)基稀釋法對供試品進行處理可滿足該制劑對需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)進行計數(shù)的需要。

按照微生物限度檢查方法驗證試驗,可將驗證菌株分別于樣品環(huán)節(jié)、供試液制備環(huán)節(jié)及最后環(huán)節(jié)進行加入,進行回收率測定[30]。綜合考慮實驗方案的可行性,以及樣品與操作過程的影響因素,最合理的加菌方式為供試液制備階段加菌[30]。本試驗優(yōu)先選擇文獻報道[30]的在供試液制備環(huán)節(jié)加菌,通過表1、2試驗結(jié)果可知,5種試驗菌株的回收率均在0.5～2范圍內(nèi)[22],滿足藥典對驗證試驗的微生物回收率規(guī)定,因此采用供試液制備環(huán)節(jié)加入試驗菌是合理且可行的。通過表1、2試驗結(jié)果可知,采用平皿傾注法對藥典中規(guī)定驗證用的5種試驗菌株回收率均在0.5～2范圍內(nèi)[22],滿足藥典對驗證試驗的微生物回收率規(guī)定,因此,采用平皿傾注法對微生物進行回收方法準確有效且操作簡便。通過表3、4試驗結(jié)果可知,采用平皿法對控制菌進行檢查,試驗組中菌生長良好,陰性對照組未檢出。藥典對控制菌檢查方法驗證需要設(shè)立供試品對照組并沒有進行明確規(guī)定,本試驗通過設(shè)立供試品對照組為了證明供試品是否被污染,保證結(jié)果的可靠性,如表3結(jié)果顯示:供試品對照組未檢出控制菌,既證實了供試品未被污染,也證明了此方法的可靠性及可行性,符合藥典的規(guī)定。供試液從制備到加入培養(yǎng)基的時間若超過1 h,即有可能導(dǎo)致微生物的大量繁殖或者死亡,從而影響微生物計數(shù)的結(jié)果。同時,若制備供試液需水浴加熱及培養(yǎng)基需保溫,溫度均不應(yīng)超過45℃,且對供試液進行水浴加熱的時間也不應(yīng)超過30 min,避免長時間加熱對結(jié)果產(chǎn)生影響。

綜上所述,上感合劑微生物限度檢查方法驗證試驗符合2015年版《中國藥典》四部通則要求,建立的方法準確可行,可用于上感合劑的微生物限度檢查,同時,可以為醫(yī)院口服中藥制劑的微生物限度檢查方法建立提供參考[8-9,11]。