俞 靜,李宜航,尹翠云,鄧招游,唐德英,張麗霞

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所 云南省南藥可持續(xù)利用研究重點實驗室,景洪 666100

砂仁始載于唐代《藥性論》,是中國“四大南藥之一”,其主要為姜科豆蔻屬草本植物陽春砂A.villosum的干燥成熟果實,具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明砂仁的特征性成分主要為揮發(fā)油和黃酮類成分,具有抗消化性潰瘍、抗胃潰瘍、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理活性[2,3]。陽春砂廣泛分布在我國廣東、云南、廣西和福建等地,其中云南已成為我國陽春砂的最大產(chǎn)區(qū)[4]。

內(nèi)生真菌是定殖于健康植物不同組織部位的微生物類群,其種群類型和多樣性受宿主植物種類、部位、生態(tài)環(huán)境、種植位置等不同因素的共同影響。橡膠林下和自然條件兩種生境下艾納香葉片內(nèi)生真菌組成和優(yōu)勢菌屬均存在顯著差異[5];甘肅、內(nèi)蒙和寧夏3個產(chǎn)區(qū)的甘草內(nèi)生真菌分離率、種屬多樣性等都具有較大差異性[6]。內(nèi)生真菌和宿主植物存在復(fù)雜的共生關(guān)系,與植物的生長發(fā)育以及次生代謝產(chǎn)物的積累也有密切聯(lián)系。藥用植物地黃中內(nèi)生真菌GG22可明顯促進地黃梓醇及毛蕊花糖苷等物質(zhì)的積累[7];丹參中內(nèi)生真菌U104能提高丹參酮的積累[8];人參內(nèi)生真菌Chaetomiumsp.與宿主植物人參在最佳的共培養(yǎng)誘導(dǎo)條件下能顯著提高人參不定根中人參皂苷的含量[9]。內(nèi)生真菌在長期的進化過程中形成了豐富的代謝系統(tǒng),會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎和活性多樣的代謝產(chǎn)物,也會產(chǎn)生與宿主植物相似或相同的物質(zhì)。北桑寄生的內(nèi)生真菌Nemaniasp.可產(chǎn)生與宿主植物相同類型的黃酮類成分[10];從黃連內(nèi)生真菌Albifimbriaviridis次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了對乳腺癌細(xì)胞具有顯著抑制作用的大環(huán)內(nèi)酯類化合物[11]。綜上研究表明,對宿主植物與其內(nèi)生真菌間的聯(lián)系進行探討具有重要意義,同時從藥用植物中分離和篩選具有活性的菌株也可作為獲取天然活性物質(zhì)的潛在來源。

陽春砂的外觀性狀和品質(zhì)始終是藥材市場首要考慮因素,課題組前期調(diào)研發(fā)現(xiàn),云南西雙版納和馬關(guān)產(chǎn)的陽春砂樣品存在一定差異性,為初步探究二者差異性的原因及陽春砂宿主植物與其內(nèi)生真菌間的作用機制。本研究分別以西雙版納和馬關(guān)自然林下的陽春砂作為研究材料,對其根、莖、葉部位內(nèi)生真菌進行分離鑒定,分析和比較了兩地陽春砂內(nèi)生真菌的多樣性,為進一步探討影響陽春砂品質(zhì)的因素,同時為充分利用和開發(fā)砂仁內(nèi)生真菌資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

兩年生陽春砂于2021年12月分別采自云南西雙版納勐臘縣勐臘鎮(zhèn)和云南文山馬關(guān)縣八寨鎮(zhèn),兩地采集的新鮮無病害陽春砂植株均為自然林下種植,經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所張麗霞研究員鑒定為陽春砂AmomumvillosumLour.。陽春砂植株標(biāo)本(YJ-SR08和YJ-SR09)均保存在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所南藥重點研究實驗室。

1.2 供試菌株

細(xì)菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC6538)、大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC25922)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,ATCC6633)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes,ATCC13048)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi,CMCC(B)50071)均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 試劑

甲醇(批號:20221005,分析純)、乙酸乙酯(批號:20211028,分析純)、次氯酸鈉(批號:P2079439,分析純)、硫酸亞鐵(批號:20210807,分析純)、水楊酸(批號:P1372875,99%)、30%過氧化氫均購自昆明仁科商貿(mào)有限公司;硫酸鏈霉素(批號:P1926944,720 IU/mg)、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(批號:Z6B8N-SO,97%)、抗壞血酸(批號:P1552401,99%)、鐵氰化鉀(批號:P1586039,99%)、三氯乙酸(批號:P2067948,99%)、三氯化鐵(批號:P1599135,99%)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、瓊脂粉、酵母提取物、真菌基因組DNA快速抽提試劑盒均購自上海泰坦科技股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 內(nèi)生真菌的分離純化

新鮮陽春砂植株洗凈,于超凈工作臺中用50%的次氯酸鈉溶液浸泡1 min,取出洗凈,再用75%的乙醇溶液浸泡2 min,取出洗凈,消毒過程中暴露的末端舍去,余下的用于接種。培養(yǎng)皿恒溫培養(yǎng)3～15 d,每天觀察待組織邊緣長出菌落時,轉(zhuǎn)接于新培養(yǎng)皿中,重復(fù)4～5次,純化至得到形態(tài)顏色完全一致的單菌落。最后一次清洗樣品的無菌水作為樣品觀察其無任何菌落生長,以保證分離得到的菌株為內(nèi)生真菌且無染菌。已純化的菌株于PDA斜面上保存。

1.4.2 內(nèi)生真菌的鑒定

菌絲用液氮研磨至粉末狀,提取DNA,用ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增。由昆明碩擎生物科技有限公司對擴增結(jié)果進行測序,測序片段用BLAST處理,運用MEGA 7.0中的鄰接法(neighbor-joining methods,NJ)、基于Kimura 2-parameter距離構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹,并以自展法(bootstrap)進行檢測,自展次數(shù)設(shè)為1 000次。

1.4.3 統(tǒng)計分析方法

1.4.3.1 內(nèi)生真菌的分離頻率(isolation frequency,IF):用來衡量陽春砂中不同種或?qū)僬婢膬?yōu)勢度,計算公式為:IF =N1/N×100%,N1為同一種或?qū)僬婢闹陻?shù),N為真菌總株數(shù)。IF>10%為優(yōu)勢種(屬);1%≤IF≤10%為常見種(屬);IF<1%為稀有種(屬)[12]。

1.4.3.3 辛普森多樣性指數(shù)(Simpson,D):用于研究內(nèi)生真菌種類多樣性(用于比較同一個群落生物多樣的高低),計算公式為:D= 1-∑P2i,數(shù)值范圍為0～1,D越大,相應(yīng)群落內(nèi)生真菌多樣性越高。

1.4.3.4 種類均勻度(species evenness,E):表示內(nèi)生真菌種類的均勻程度,計算公式為:E=H′/lnS,S表示種類的豐富度。

1.4.3.5 相似性系數(shù)(Jaccard,CJ):用于比較不同產(chǎn)地兩種植物間內(nèi)生真菌種類組成的相似程度,計算公式為:CJ=j/(a+b-j),j為2個產(chǎn)地陽春砂共有內(nèi)生真菌種數(shù)或?qū)贁?shù),a為西雙版納產(chǎn)陽春砂內(nèi)生真菌種數(shù)或?qū)贁?shù),b為馬關(guān)產(chǎn)陽春砂內(nèi)生真菌種數(shù)或?qū)贁?shù)。

1.4.4 抑菌活性測定

1.4.4.1 供試品的制備

菌株接種于大米培養(yǎng)基中室溫靜置培養(yǎng)30 d,乙酸乙酯超聲萃取后減壓蒸干即得浸膏。用甲醇將浸膏分別配成5.0 mg/mL的待測溶液,陽性對照鏈霉素也配成相同濃度溶液備用。供試菌株活化后接種于LB液體培養(yǎng)基,37 ℃震蕩培養(yǎng)16～17 h,將培養(yǎng)液稀釋至菌落個數(shù)為1×105～1×106CFU/mL,即得供試菌液。

1.4.4.2 濾紙片法抑菌試驗

取200 μL稀釋菌液加到LB固體培養(yǎng)基上,用涂抹棒均勻涂抹。分別各取20 μL待測溶液和鏈霉素溶液滴加到直徑6 mm的圓形濾紙片上,待溶劑揮干,用鑷子置于含菌培養(yǎng)皿上,同時滴加相同體積甲醇的濾紙片作為陰性對照。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小,所有操作均重復(fù)三次[13]。

1.4.5 抗氧化活性評價

1.4.5.1 DPPH自由基清除能力測定

浸膏用無水乙醇配成0.5 mg/mL的溶液備用。取1 mL試樣溶液和3 mL 0.1 mmol/mL的DPPH溶液置于10 mL離心管中靜置30 min,5 000 r/min離心5 min,在517 nm下測定吸光度為A1。將DPPH溶液換成無水乙醇重復(fù)操作測定吸光度A2,將試樣溶液換成超純水重復(fù)操作測定吸光度A0。將清除率對受試物濃度對數(shù)進行非線性回歸擬合抑制曲線計算IC50值。陽性對照為Vc,同一試樣重復(fù)3次[14]。按下式計算清除率。

清除率= [1-(A1-A2)/A0] × 100%

1.4.5.2 羥基自由基清除能力測定

浸膏用無水乙醇配成0.5 mg/mL的溶液備用。取1 mL試樣溶液于10 mL離心管中,依次加入1 mL 9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液,搖勻后靜置6 min,再加入1 mL過氧化氫溶液。搖勻后2 500 r/min離心20 min,在510 nm下測定吸光度為A1。用超純水替代過氧化氫測定吸光度為A2,用無水乙醇代替樣品溶液測定吸光度為A0。將清除率對受試物濃度對數(shù)進行非線性回歸擬合抑制曲線計算IC50值。以Vc作為陽性對照,同一試樣重復(fù)3次[14]。清除率計算公式與DPPH自由基清除相同。

1.4.5.3 總還原力測定

浸膏用無水乙醇配成0.5 mg/mL的溶液備用。取2.5 mL試樣溶液于15 mL離心管中,依次加入2.5 mL 0.2 mol/mL pH = 6.6的磷酸鹽緩沖溶液和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液。混勻后置于50 ℃水浴保溫20 min后取出,迅速冷卻。再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液,混勻后2 000 r/min離心10 min。取上層清液2.5 mL,依次加入2.5 mL超純水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液,搖勻后靜置10 min。在700 nm處測定吸光度(A),以Vc作為陽性對照,同一試樣重復(fù)三次。將Vc用無水乙醇配成濃度梯度為0.005、0.01、0.02、0.04、0.05、0.1 mg/mL的待測溶液,按同法測定吸光度(A),以Vc的濃度值為橫坐標(biāo),測得的吸光度值(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽春砂內(nèi)生真菌鑒定及菌落組成

2.1.1 西雙版納陽春砂內(nèi)生真菌鑒定

從西雙版納陽春砂根、莖和葉中共分離純化出39株內(nèi)生真菌,其中根部18株、莖部12株、葉部9株,歸屬為13目23科(含4個未知科)27屬(含3個未知屬)。根據(jù)菌株的分子生物學(xué)進行結(jié)果鑒定(見表1),內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育進化分析見圖1(菌株BSR 19、36-37因ITS系列相似度低于97%,不能準(zhǔn)確地比對到目前已知的種類)。

圖1 基于ITS序列的西雙版納陽春砂內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育進化分析Fig.1 Phyogenetic analysis of rDNA-ITS sequences of endophytic fungi separated from Xishuangbanna A.villosum

表1 西雙版納陽春砂內(nèi)生真菌分離鑒定及相對分離頻率

2.1.2 馬關(guān)陽春砂內(nèi)生真菌鑒定

從馬關(guān)陽春砂根、莖和葉中共分離純化出38株內(nèi)生真菌,其中根部18株、莖部9株、葉部11株,歸屬為15目24科(含3個未知科)30屬(含2個未知屬)。根據(jù)菌株的分子生物學(xué)進行結(jié)果鑒定(見表2),內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育進化分析見圖2(菌株MSR 9、MSR 14、MSR 23因ITS系列相似度低于97%,不能準(zhǔn)確地比對到目前已知的種類)。

圖2 基于ITS序列的馬關(guān)陽春砂內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育進化分析Fig.2 Phyogenetic analysis of rDNA-ITS sequences of endophytic fungi separated from Maguan A.villosum

表2 馬關(guān)陽春砂內(nèi)生真菌分離鑒定及相對分離頻率

2.1.3 云南陽春砂內(nèi)生真菌菌群組成

綜合整理表1和表2可知,從采自云南西雙版納和馬關(guān)兩個地區(qū)產(chǎn)陽春砂的根、莖和葉中共分離獲得77株內(nèi)生真菌。從分離頻率來看,西雙版納與馬關(guān)陽春砂內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌群存在一定差異,西雙版納陽春砂中分離頻率最高的菌群為Penicillium和Colletotrichum,占總菌株數(shù)的10.26%,其次是占總菌株數(shù)5.13%的Xylaria、Daldinia、Diaporthe等;而馬關(guān)陽春砂中分離頻率最高的是Penicillium,占總菌株數(shù)的7.89%,其次是占總菌株數(shù)5.26%的Phanerochaete、Pyrenochaetopsis、Neopestalotiopsis和Cladosporium,說明西雙版納和馬關(guān)陽春砂內(nèi)生真菌菌群組成存在一定差異性。

總體上來看,77株內(nèi)生真菌分布在子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和毛霉菌門(Mucoromycota)。其中子囊菌門為優(yōu)勢門類,分離率為88.31%(68/77)。其中子囊菌綱為優(yōu)勢綱,共43株,分離率為55.84%,包括炭角菌目、肉座菌目、小叢殼目、間座殼菌目等;座囊菌綱共16株,分離率為20.78%,包括球腔菌目、格孢腔菌目、葡萄座腔菌目等;散囊菌綱共8株,分離率為10.39%,包括散囊菌目和刺盾炱目。錘舌菌綱1株,分離率最低,為1.30%,只檢出柔膜菌目。擔(dān)子菌門的分離率為10.39%(8/77),8株均為傘菌綱,包括銹革孔菌目、多孔菌目、紅菇目和傘菌目;毛霉菌門的分離率最低,1.30%(1/77),僅有毛霉菌綱。從種屬水平上看,所有菌群均為常見種屬。

2.2 陽春砂內(nèi)生真菌多樣性

通過對陽春砂樣品根、莖和葉三個不同組織中分離得到內(nèi)生真菌的多樣性進行分析,結(jié)果見表3。分離鑒定的77個種群,其中根36個,莖21個,葉20個。陽春砂根部、莖部和葉部的H′分別為3.029 9、2.682 0和2.595 4,陽春砂根部、莖部和葉部的D分別為0.942 9、0.949 0和0.876 5。綜上表明,根、莖和葉三個部位的內(nèi)生真菌多樣性存在一定差異,且種類豐富度也各不相同,其中根部內(nèi)生真菌種類較多,葉部較少。三個組織內(nèi)生真菌總H′和D分別為3.485 1和0.965 6。

表3 陽春砂不同組織部位內(nèi)生真菌多樣性

由表4可知,馬關(guān)陽春砂內(nèi)生真菌的H′為3.271 8,D為0.963 2均高于西雙版納陽春砂內(nèi)生真菌,其H′為3.111 5,D為0.953 1,表明馬關(guān)產(chǎn)區(qū)陽春砂內(nèi)生真菌類群多樣性較西雙版納產(chǎn)區(qū)豐富。從兩個產(chǎn)區(qū)真菌均勻度來看,馬關(guān)的E為0.899 4,也高于西雙版納。此外,馬關(guān)和西雙版納陽春砂內(nèi)生真菌的CJ為0.222 2,屬于極不相似程度,說明兩地陽春砂內(nèi)生真菌存在顯著差異性。

表4 不同樣品采集地陽春砂內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)

2.3 陽春砂內(nèi)生真菌發(fā)酵物抗菌活性

據(jù)表5可知,綜合分析共有29株陽春砂內(nèi)生真菌發(fā)酵物表現(xiàn)出抑菌作用,其中對三株細(xì)菌同時具有抑制作用的內(nèi)生真菌2株,菌株BSR 18抑制活性較強;對兩株細(xì)菌同時具有抑制作用的11株,菌株BSR 32抑制活性較強;對一株細(xì)菌表現(xiàn)抑制作用的16株。對大腸桿菌抑制作用最強的菌株為BSR 34,對枯草芽孢桿菌抑制作用最強的菌株為BSR 32和MSR 15,對傷寒沙門氏菌抑制作用最強的菌株為BSR 10和BSR 32。而所有菌株發(fā)酵物對金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣腸桿菌的抑制活性均不強。

表5 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性

2.4 內(nèi)生真菌發(fā)酵物的抗氧化能力

2.4.1 DPPH自由基清除能力

由表6可知,除分自馬關(guān)陽春砂中MSR 5和MSR 22外,其他77株內(nèi)生真菌發(fā)酵物均對DPPH自由基表現(xiàn)出一定程度的清除活性,其中BSR 10和BSR 18較強,清除率分別為84.87%和81.34%,IC50值分別為71.17和84.12 μg/mL,分屬于Biscogniauxia和Diaporthe屬,菌株BSR 10來源于根部,BSR 18來源于莖部。

表6 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性

2.4.2 羥基自由基清除能力

由表6可知,77株內(nèi)生真菌發(fā)酵物對羥基自由基均表現(xiàn)出一定程度的清除活性,其中清除率超過80%的菌株有7株,分別為BSR 2、BSR 11、MSR 11、MSR 16、MSR 19、MSR 21、MSR 28,清除率依次為84.95%、90.68%、87.56%、86.69%、83.05%、87.03%、88.98%,IC50值分別為88.66、57.23、82.60、81.72、81.46、69.55、66.71 μg/mL。包括Fusarium、Xylariaceae、Colletotrichum、Cladosporium、Periconia、Barnettozyma屬,除菌株MSR 28來源于莖部,其余6株來源于根部。

2.4.3 總還原力

由表6可知,77株內(nèi)生真菌發(fā)酵物均表現(xiàn)出一定程度的總還原力,其中維生素C當(dāng)量超過16 μg/mL的菌株有9株,分別為BSR 10、BSR 18、BSR 22、BSR 32、MSR 1、MSR 13、MSR 23、MSR 27、MSR 31,維生素C當(dāng)量依次為16.50、16.82、22.96、20.42、16.36、16.86、17.04、19.89、16.35 μg/mL,包括Biscogniauxia、Diaporthe、Colletotrichum、Penicillium、Neopestalotiopsis、Trichoderma、Pyrenochaetopsis、Phyllosticta屬。菌株BSR 18和MSR 23來源于莖部,BSR 22、MSR 27和MSR 31來源于葉部,其余4株來源于根部。

3 討論與結(jié)論

關(guān)于砂仁內(nèi)生真菌方面的研究已有部分報道,Xiao等[15]分析比較了廣東陽春市陽春砂和云南瀘水市陽春砂莖和葉內(nèi)生真菌的差異性,結(jié)果表明二者內(nèi)生真菌種類較多,且組成具差異性,各自有不同的優(yōu)勢菌株,但缺少對根部內(nèi)生真菌相關(guān)的研究;Cao等[16]將內(nèi)生真菌的解磷功能作為切入點,以云南紅河產(chǎn)區(qū)的陽春砂為研究對象,在根部發(fā)現(xiàn)有8株內(nèi)生真菌具有解磷能力;Zhang等[17]僅對陽春砂內(nèi)生真菌多樣性進行了初步分析。本實驗對云南西雙版納和馬關(guān)兩個地區(qū)陽春砂根、莖和葉部位內(nèi)生真菌進行了分離鑒定,共77株,歸屬為18目35科(含7個未知科)44屬(含5個未知屬),根部菌株種類豐富,莖和葉部位菌株種類較根部少。對二者間多樣性進行比較發(fā)現(xiàn),西雙版納與馬關(guān)陽春砂內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌群和總體菌落組成均存在差異性。另外,馬關(guān)產(chǎn)區(qū)陽春砂內(nèi)生真菌類群多樣性較西雙版納產(chǎn)區(qū)豐富,上述研究可為深入探討宿主植物陽春砂的差異提供一定的參考依據(jù)。

砂仁可作為開發(fā)具抑菌和抗氧化作用物質(zhì)的來源之一,Cao等[18]分析了陽春砂葉和桿乙醇提取物對常見細(xì)菌的抑制作用,結(jié)果表明砂仁葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌抑制效果最好,砂仁桿乙醇提取物對枯草芽孢桿菌的抑制效果最好;Cao等[19]還發(fā)現(xiàn)砂仁生品的石油醚萃取物對大腸桿菌的抑菌效果最顯著;砂仁水提物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌也具有抑制作用[20];Tang等[21]發(fā)現(xiàn)部分砂仁粗提物表現(xiàn)出較強的體外抗氧化活性。另外,Zhang等[22]從砂仁內(nèi)生真菌LetendraeahelminthicolaA696的次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一個新的倍半萜類化合物。基于上述研究,本研究通過DPPH自由基清除、羥基自由基清除和總還原力實驗分析了從云南西雙版納和馬關(guān)陽春砂中獲得的77株內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提物的抗氧化活性,并通過濾紙片法評價了粗提物的抗細(xì)菌活性,結(jié)果顯示部分菌株兼具抗菌和抗氧化活性,其中BSR 10、BSR 18和BSR 32可作為進一步挖掘具天然生物活性先導(dǎo)化合物的新途徑,也可實現(xiàn)對陽春砂資源的充分可持續(xù)利用與開發(fā)。