王崇 王麗嫻 秦娜 秦云靜 袁茵 趙建宏

連續(xù)計(jì)數(shù)法血小板功能檢測(cè)(sequential platelet counting method,SPCM)是國(guó)內(nèi)于2012年研發(fā)的一種基于庫(kù)爾特原理的新型血小板聚集功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)[2],其檢測(cè)原理為:通過(guò)連續(xù)動(dòng)態(tài)測(cè)量全血標(biāo)本在添加誘聚劑(Agonist)前后血小板數(shù)量及體積變化,綜合分析血小板最大聚集率(maximum aggregation rate,MAR)、平均聚集率(average aggregation rate,AAR)、最大聚集時(shí)間(maximum aggregation time,MAT)、血小板聚集曲線(platelet aggregation curve,PAC)、血小板抑制率(PLT inhibition rate,INH)、血小板平均抑制率(PLT average inhibition rate,A-INH)、紅細(xì)胞最大聚集率(RBC maximum aggregation rate,R-MAR)等參數(shù),對(duì)血小板在不同誘聚劑誘導(dǎo)下的聚集功能進(jìn)行較為全面的評(píng)價(jià)[2,3],進(jìn)而指導(dǎo)臨床選擇患者較為敏感的抗血小板藥物。本文擬對(duì)連續(xù)計(jì)數(shù)法血小板功能檢測(cè)與其他方法進(jìn)行比較,分析各自優(yōu)缺點(diǎn),并對(duì)SPCM的影響因素及質(zhì)量改進(jìn)提出建議。

1 方法學(xué)比較

1.1 SPCM與LTA LTA做為一種傳統(tǒng)的血小板聚集功能實(shí)驗(yàn),最初由Salzman于1960年提出[4],其原理為通過(guò)離心將標(biāo)本分為富血小板血漿(Platelet rich plasma,PRP)和貧血小板血漿(Platelet poor plasma,PPP),用PPP將PRP的血小板計(jì)數(shù)調(diào)整至250×109個(gè)/L,在其中加入不同種類的誘聚劑,如花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、膠原(Collagen,Col)、腎上腺素(Epinephrine,EPI)等,誘導(dǎo)血小板聚集,引發(fā)血漿濁度變化,通過(guò)檢測(cè)血漿透光率的動(dòng)態(tài)變化,計(jì)算血小板聚集率。其優(yōu)點(diǎn)是:市場(chǎng)應(yīng)用廣泛,臨床認(rèn)可度高,試劑價(jià)格相對(duì)較低;檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好,血漿濁度變化的檢測(cè)為不間斷連續(xù)線性測(cè)定,能準(zhǔn)確捕捉到透光率最大、濁度最低、血小板最大聚集的時(shí)間點(diǎn)。但亦有明顯的缺點(diǎn),因其檢測(cè)血漿濁度變化,一些影響血漿透光度的因素,均會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響;標(biāo)本檢測(cè)前需要離心,會(huì)誘導(dǎo)血小板活化,且分離血漿,去除紅、白細(xì)胞后,非全血環(huán)境,不能準(zhǔn)確、全面反應(yīng)血小板在體內(nèi)活化、粘附、聚集功能;因?qū)嶒?yàn)前需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行提取貧、富血小板血漿等手工操作,檢測(cè)人員操作的熟練程度對(duì)結(jié)果會(huì)有影響,不利于實(shí)驗(yàn)操作全過(guò)程自動(dòng)化;不同實(shí)驗(yàn)室間、不同實(shí)驗(yàn)操作人員對(duì)同一份標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果也會(huì)有差異。

SPCM與LTA相比較,具有以下優(yōu)勢(shì):標(biāo)本不需要離心,沒有實(shí)驗(yàn)前手工操作步驟,減少了手工操作誤差的干擾,容易實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)全過(guò)程自動(dòng)化、批量化,提高檢測(cè)效率;不分離血漿,不去除紅、白細(xì)胞,最大程度還原血小板體內(nèi)的全血環(huán)境,真實(shí)反映血小板的活化狀態(tài);SPCM通過(guò)對(duì)加入誘聚集前、后不同時(shí)間點(diǎn)的血小板計(jì)數(shù)來(lái)計(jì)算PLT最大聚集率,輕度的溶血、黃疸、脂血、乳糜血對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。不足之處是SPCM為固定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè),即在加誘聚劑前進(jìn)行1～2次血小板計(jì)數(shù)檢測(cè),以此次血小板測(cè)定結(jié)果或2次測(cè)定結(jié)果的平均值為基數(shù);加誘聚劑后300 s、380 s、460 s再進(jìn)行3次血小板計(jì)數(shù),以其中血小板數(shù)量最少、聚集程度最大時(shí)間點(diǎn)的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算最大聚集率。不同于LTA的不間斷的連續(xù)濁度測(cè)定,其所謂的“連續(xù)”其實(shí)是抓取5個(gè)時(shí)間“點(diǎn)”對(duì)血小板進(jìn)行測(cè)定,不能精確捕捉到血小板“最大聚集”發(fā)生的時(shí)間點(diǎn),從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理上來(lái)講,重復(fù)性不如LTA穩(wěn)定。尤其對(duì)于服用抗血小板藥物過(guò)量導(dǎo)致的最大聚集時(shí)間延遲的患者,因血小板尚未達(dá)到最大聚集程度便在460 s結(jié)束測(cè)定,會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。

吳小利等[2]對(duì)以連續(xù)測(cè)定法為原理的江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PL-11血小板聚集儀的日間、批內(nèi)、批間的不精密度、準(zhǔn)確性、攜帶污染率及線性性能進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果顯示:SPCM法與LTA法有一定相關(guān)性(r=0.62,P<0.01);各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均符合美國(guó)《臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正法案-88》(Clinical Laboratory Improvement Amendment 88,CLIA’88)的要求,結(jié)論為連續(xù)測(cè)定法血小板功能檢測(cè)是一種較理想的、適用于血栓病早期預(yù)警和診斷實(shí)驗(yàn)方法,值得推廣應(yīng)用,與張有濤等[5,6]的研究結(jié)果一致。

1.2 SPCM與IPA IPA又稱全血電阻抗法,最早于1980年提出[7],標(biāo)本不需要離心,全血測(cè)定,其原理為在全血樣本中加入誘聚劑,使血小板活化,粘附聚集于電極,使電阻抗增加、電流減小,通過(guò)記錄電流的變化曲線來(lái)評(píng)價(jià)血小板聚集功能[7,8]。與SPCM一樣,二者均直接使用抗凝全血,標(biāo)本不需要離心,避免手工操作干擾,能最大程度反應(yīng)血小板在全血環(huán)境下的功能狀態(tài)[9],不同于SPCM的“固定時(shí)間點(diǎn)”檢測(cè),IPA可連續(xù)監(jiān)測(cè)因血小板聚集導(dǎo)致的電流減少、電阻抗增加,能準(zhǔn)確捕捉血小板最大聚集率發(fā)生的時(shí)間點(diǎn),重復(fù)性優(yōu)于SPCM;但I(xiàn)PA每次實(shí)驗(yàn)都需要清洗電極,日常維護(hù)要求高,且易受血小板數(shù)量及紅細(xì)胞壓積(hematocrit,HCT)影響,血小板及紅細(xì)胞數(shù)量偏低的患者,IPA電流變化不明顯,實(shí)驗(yàn)靈敏度偏低。IPA對(duì)微小凝集不敏感,對(duì)輕度血小板功能障礙敏感度較低,故IPA多用于實(shí)驗(yàn)研究,臨床應(yīng)用較少[9]。

SPCM日常維護(hù)簡(jiǎn)單,實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求不高,對(duì)實(shí)驗(yàn)前PLT的微小凝集可通過(guò)質(zhì)控參數(shù)“原始血小板平均體積MPV-0”進(jìn)行預(yù)警,當(dāng)MPV-0≥11 fl時(shí)提示有PLT凝集或小紅細(xì)胞干擾。HCT對(duì)SPCM的影響可通過(guò)矯正公式進(jìn)行調(diào)整,當(dāng)HCT≤20%或HCT≥55%時(shí),按矯正公式:抗凝劑(ml)=(100-HCT)×血液(ml)×0.00185對(duì)抗凝劑進(jìn)行調(diào)節(jié)[10]。PLT數(shù)量明顯減少時(shí),如PLT<50×109/L,會(huì)導(dǎo)致SPCM檢測(cè)的重復(fù)性變差。

1.3 SPCM與TEG TEG是血栓彈力儀描繪出的凝血?jiǎng)討B(tài)過(guò)程曲線,能動(dòng)態(tài)分析血小板、凝血因子、纖維蛋白原等血液成分之間相互作用、血凝塊形成和纖維蛋白溶解全過(guò)程的曲線圖[11]。最早由德國(guó)人Harret于1948年提出[11],其原理為:體外模擬靜脈血流,全血或血漿復(fù)鈣后,激活凝血系統(tǒng),反應(yīng)杯中的金屬針感應(yīng)血栓形成及溶解過(guò)程中的應(yīng)切力,由計(jì)算機(jī)繪制血栓形成速度、強(qiáng)度及溶解曲線[12],以此反映凝血及纖溶過(guò)程的全貌。一般分普通杯檢測(cè)、肝素酶杯檢測(cè)和血小板功能杯檢測(cè)3種檢測(cè)方式。主要參數(shù)包括:反應(yīng)時(shí)間(R)、凝固時(shí)間(K)、兩側(cè)曲線最寬距離(MA)、血塊穩(wěn)定性(LY30)、預(yù)測(cè)纖溶指數(shù)(EPL);MA反應(yīng)血小板功能,MA≥70 mm表示血小板功能較強(qiáng),發(fā)生血栓的風(fēng)險(xiǎn)較高;MA≤50 mm表示血小板功能較弱,出血的風(fēng)險(xiǎn)較大[12]。但MA除反映血小板功能外,還受纖維蛋白原的影響,反應(yīng)血小板功能特異性方面不如SPCM。對(duì)于低纖維蛋白原血癥患者,不能真實(shí)反映血小板功能及活化狀態(tài),可能干擾臨床對(duì)抗血小板藥物的使用評(píng)價(jià)。另外,MA與LTA法檢測(cè)血小板聚集率的相關(guān)性方面仍存爭(zhēng)議[12]。

TEG的優(yōu)點(diǎn)是可床旁全血檢測(cè),操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,除了可以通過(guò)監(jiān)測(cè)MA寬度,評(píng)價(jià)血小板功能及抗血小板藥物的治療效果外,還可全面檢測(cè)患者凝血及纖溶系統(tǒng)是否異常,綜合評(píng)估出血和血栓風(fēng)險(xiǎn)[12]。但正因?yàn)門EG反映的是凝血、纖溶的全過(guò)程,包括纖維蛋白的形成速度、溶解狀態(tài)、血栓的堅(jiān)固性及彈力度等。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程除血小板外,還有凝血酶、凝血因子、纖維蛋白原、纖溶酶等參與血栓的形成與溶解過(guò)程,影響因素較多[13],且凝血酶形成后是血小板的強(qiáng)激活劑,因此,普通杯MA值不能反映抗血小板藥的用藥效果,只能通過(guò)血小板杯MA差值對(duì)抗血小板藥效進(jìn)行評(píng)估。黃武明[14]比較血栓彈力圖法與比濁法在冠心病患者血小板功能檢測(cè)中的應(yīng)用效果發(fā)現(xiàn),二者相關(guān)性較差,檢測(cè)一致性也較弱,僅對(duì)高血脂患者兩種方法有較好的相關(guān)性。

SPCM是在全血樣本中加入誘聚劑后,通過(guò)比較加入誘聚劑前后血小板數(shù)量的變化來(lái)計(jì)算血小板最大聚集率,不受凝血因子、纖維蛋白原、凝血酶及纖溶酶等因素影響,在評(píng)價(jià)血小板功能的特異性方面優(yōu)于TEG;但血小板膜上有多種活化通路受體,SPCM僅適合對(duì)AA、ADP、Col、EPI等特定誘聚劑類藥物的治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià),不能代表PLT整體功能水平,尤其是長(zhǎng)期服用抗血小板藥物的患者,因此,在綜合評(píng)估患者出血和血栓風(fēng)險(xiǎn)方面TEG優(yōu)于SPCM。

1.4 SPCM與VASP VASP為血小板內(nèi)蛋白,在基礎(chǔ)狀態(tài)下處于非磷酸化狀態(tài),當(dāng)P2Y12受體被ADP激活后,VASP被蛋白激酶磷酸化,在對(duì)血小板膜通透化處理后,加入抗VASP磷酸化熒光抗體,采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)VASP進(jìn)行定量分析[15]。優(yōu)點(diǎn)是P2Y12信號(hào)通路特異性強(qiáng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與LTA相關(guān)性較好,但不能檢測(cè)其他血小板活化通路;SPCM除可檢測(cè)ADP誘導(dǎo)的P2Y12信號(hào)通路外,還可對(duì)AA、Col、EPI活化的其他通路進(jìn)行檢測(cè);VASP流式法操作較為復(fù)雜,費(fèi)用較高,多用于實(shí)驗(yàn)研究,臨床應(yīng)用較少。

1.5 SPCM與VerifyNow VerifyNow快速血小板功能檢測(cè)儀于2006年由美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn),用于血小板功能檢測(cè),由美國(guó)Accumetrics公司生產(chǎn),其原理為:反應(yīng)杯中含有血小板激活劑(AA、ADP、凝血酶受體激活肽)及纖維蛋白原包被的微粒,加入全血后,血小板被激活劑活化,其表面的糖蛋白IIb/IIIa受體與微粒表面的纖維蛋白原結(jié)合,血小板吸附于微粒表面,使反應(yīng)杯透光率增加,根據(jù)濁度的下降來(lái)評(píng)價(jià)血小板功能。其優(yōu)點(diǎn)為全血檢測(cè),標(biāo)本用量少,操作簡(jiǎn)單,可床旁測(cè)定,可評(píng)價(jià)AA、ADP、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑的治療效果[16],歐美國(guó)家應(yīng)用較多。但其以凝血酶作為聚集基線,干擾了血小板其他的聚集通路,不能代表血小板的最大聚集能力。SPCM也是全血檢測(cè),根據(jù)加入誘聚劑前后血小板計(jì)數(shù)的減少為依據(jù),來(lái)進(jìn)行血小板最大聚集率的計(jì)算,不激活凝血系統(tǒng),不受凝血酶的影響,操作也較簡(jiǎn)單,更有利于臨床應(yīng)用。

1.6 SPCM與PFA-200 PFA-200是德國(guó)SIEMENS公司生產(chǎn)的一款血小板功能分析儀,其檢測(cè)原理為:根據(jù)血液動(dòng)力學(xué)原理,在體外模擬體內(nèi)血管損傷后血小板的粘附與聚集過(guò)程,利用小孔閉合時(shí)間來(lái)反應(yīng)血小板的功能狀態(tài)[17]。具體過(guò)程為:將全血標(biāo)本吸入富含膠原纖維、腎上腺素或ADP等血小板誘聚劑的孔隙中,在剪切力的作用下,測(cè)定血栓封閉孔隙的時(shí)間,以反應(yīng)血小板的最大聚集率,多用于檢測(cè)先天性或獲得性血小板聚集、粘附功能障礙性疾病,也可用于抗血小板藥物療效監(jiān)測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)為標(biāo)本用量少、檢測(cè)時(shí)間短、可床旁檢測(cè),可檢測(cè)血小板的粘附功能[18];但標(biāo)準(zhǔn)化差,對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的過(guò)度依賴影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

SPCM相對(duì)PAF-200更易全流程標(biāo)準(zhǔn)化,標(biāo)本采集后,直接全血上機(jī)檢測(cè),無(wú)中間手工操作環(huán)節(jié),不受血流動(dòng)力學(xué)影響,但僅能對(duì)血小板的聚集功能進(jìn)行評(píng)價(jià),無(wú)法監(jiān)測(cè)PLT的粘附功能。

1.7 SPCM與流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)利用熒光標(biāo)記抗體可檢測(cè)單個(gè)血小板上的不同標(biāo)記物,對(duì)全血標(biāo)本中懸浮血小板快速進(jìn)行表型分析[19],相較于其他血小板功能檢測(cè)方法有如下優(yōu)點(diǎn):全血檢測(cè)、標(biāo)本用量少、可檢測(cè)PLT表面不同受體表達(dá)及對(duì)PLT反應(yīng)性進(jìn)行測(cè)試,尤其對(duì)于血小板減少癥患者,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,明顯優(yōu)于其他血小板功能檢測(cè)方法;但溶血產(chǎn)生的RBC碎片會(huì)干擾PLT的識(shí)別,影響檢測(cè)結(jié)果[20]。SPCM同樣是全血檢測(cè),可對(duì)不同誘聚劑下血小板功能進(jìn)行檢測(cè),但不能對(duì)PLT表面受體進(jìn)行分析,對(duì)PLT數(shù)量較少的標(biāo)本,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性差。

2 SPCM檢測(cè)影響因素分析

2.1 校準(zhǔn)品與溯源 連續(xù)計(jì)數(shù)法血小板功能分析儀生產(chǎn)廠家較少,沒有統(tǒng)一規(guī)范的校準(zhǔn)品生產(chǎn)及使用標(biāo)準(zhǔn),多為各公司專用校準(zhǔn)品,一般分低(≤100×109/L)、中[(130～240)×109/L]、高(≥330×109/L)3種不同濃度水平,無(wú)明確溯源鏈,部分生產(chǎn)廠家用美國(guó)伯樂(lè)公司的全血質(zhì)控品進(jìn)行替代;除新裝機(jī)時(shí)要求必須進(jìn)行校準(zhǔn)外,在使用過(guò)程中并未規(guī)定校準(zhǔn)周期,只有當(dāng)質(zhì)控結(jié)果發(fā)生明顯偏離時(shí),才進(jìn)行校準(zhǔn),校準(zhǔn)的目的也是對(duì)儀器的檢測(cè)系統(tǒng)、電子系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)正,保證系統(tǒng)精度,而對(duì)靶值的偏差要求不高,一般在±10%左右即可接受,這可能與檢驗(yàn)結(jié)果為“血小板聚集率”,報(bào)告以比值形式體現(xiàn)有關(guān),對(duì)檢測(cè)的準(zhǔn)確度要求不高,而對(duì)檢測(cè)的穩(wěn)定性要求較高。但對(duì)于血小板減少癥患者,血小板絕對(duì)數(shù)測(cè)量不準(zhǔn)會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

檢驗(yàn)科血常規(guī)分析儀血小板校準(zhǔn)品多溯源到國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(international council for standardization in heamatology,ICSH),溯源鏈明確,結(jié)果可靠,重復(fù)性好。在日常工作中經(jīng)常遇到連續(xù)計(jì)數(shù)法血小板功能分析儀與血常規(guī)分析儀對(duì)同一患者的血小板測(cè)定結(jié)果不同,給臨床帶來(lái)困擾。當(dāng)二者結(jié)果不一致時(shí),建議以血常規(guī)分析儀結(jié)果為準(zhǔn),原因如下:血常規(guī)分析儀血小板校準(zhǔn)品有明確的溯源鏈,每天進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控,按要求參加室間質(zhì)評(píng),檢測(cè)結(jié)果有保證;連續(xù)計(jì)數(shù)法血小板功能分析儀關(guān)注的是血小板功能,檢測(cè)結(jié)果是以最大聚集率來(lái)表達(dá),對(duì)血小板計(jì)數(shù)的絕對(duì)值要求并不高。故在日常工作中遇到血小板功能分析儀與血常規(guī)分析儀對(duì)同一患者的血小板測(cè)定結(jié)果不同時(shí),應(yīng)以血常規(guī)分析儀結(jié)果為準(zhǔn)。血小板校準(zhǔn)品的溯源性是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ),建議生產(chǎn)廠家參考血常規(guī)分析儀,使用有溯源性的校準(zhǔn)品對(duì)血小板功能分析儀進(jìn)行校準(zhǔn),減少與血常規(guī)血小板的計(jì)數(shù)誤差。

2.2 質(zhì)控品 連續(xù)計(jì)數(shù)法血小板功能分析儀質(zhì)控品多為各生產(chǎn)廠家配套質(zhì)控品,非第三方質(zhì)控,一般為經(jīng)特殊處理的動(dòng)物細(xì)胞顆粒,不同廠家所生產(chǎn)的質(zhì)控品技術(shù)要求、生產(chǎn)工藝、添加物及基質(zhì)效應(yīng)不同,無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),僅供其自身檢測(cè)系統(tǒng)使用,決定了不同品牌儀器的血小板最大聚集率檢測(cè)結(jié)果只能相互參考,無(wú)法互認(rèn)。建議統(tǒng)一使用第三方質(zhì)控品,增加檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性,促進(jìn)不同品牌間檢測(cè)結(jié)果互認(rèn)。

2.3 誘聚劑效能對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾 要保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,除血小板計(jì)數(shù)穩(wěn)定外,檢測(cè)前必須對(duì)誘聚劑效能進(jìn)行驗(yàn)證,即檢測(cè)健康志愿者新鮮血漿時(shí),最大聚集率應(yīng)不低于30%,否則誘聚劑失效。但目前尚無(wú)廠家在試劑說(shuō)明書中明確要求每批測(cè)定前都要進(jìn)行誘聚劑效能監(jiān)測(cè),在日常工作中,操作人員經(jīng)常不進(jìn)行誘聚劑效能檢測(cè)就直接測(cè)定患者標(biāo)本。

誘聚劑性質(zhì)不穩(wěn)定或部分失效會(huì)導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果偏低[21],最常見的是花生四烯酸復(fù)溶后效能損失,花生四烯酸在復(fù)溶后2～8℃密封存放可穩(wěn)定3 d,但常溫8～30℃僅可穩(wěn)定8 h,超出保存穩(wěn)定期,誘聚劑效能會(huì)明顯下降,影響誘聚效果,導(dǎo)致血小板最大聚集率結(jié)果偏低。建議各廠家規(guī)范說(shuō)明書實(shí)驗(yàn)操作流程,在檢測(cè)前對(duì)誘聚劑效能進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4 小紅細(xì)胞或紅細(xì)胞碎片的干擾 連續(xù)監(jiān)測(cè)法將MPV-0做為一個(gè)質(zhì)控指標(biāo),當(dāng)MPV-0明顯超出正常范圍,如MPV-0≥11 fL時(shí),提示在誘聚劑加入前已經(jīng)發(fā)生血小板聚集,需重新采樣。但在使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)部分黃疸患者,紅細(xì)胞膜硬度增大,溶血?jiǎng)┎荒芡耆芙饧t細(xì)胞,儀器對(duì)部分未充分溶解的小紅細(xì)胞或紅細(xì)胞碎片會(huì)誤計(jì)為血小板,導(dǎo)致MPV-0明顯增大,影響結(jié)果判斷。當(dāng)儀器發(fā)出MPV-0異常提示時(shí),建議檢查患者其他血清或血漿標(biāo)本,查看是否有溶血、黃疸、脂血、乳糜血等干擾,也可查看患者血常規(guī)結(jié)果是否有小紅細(xì)胞及紅細(xì)胞碎片等異常提示。

2.5 標(biāo)本放置時(shí)間 朱遠(yuǎn)等[22]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)本不同放置時(shí)間對(duì)連續(xù)計(jì)數(shù)法血小板功能檢測(cè)結(jié)果有影響,以花生四烯酸為誘聚劑時(shí)影響較小,但以ADP 或膠原為誘聚劑時(shí),隨著標(biāo)本放置時(shí)間的延長(zhǎng),血小板聚集率降低。因此,建議以花生四烯酸為誘聚劑時(shí),血小板功能檢測(cè)應(yīng)在采血后4 h內(nèi)完成;以ADP或膠原為誘聚劑時(shí),應(yīng)在采血后 2 h內(nèi)完成檢測(cè)。Zhu等[23]以LTA方法檢測(cè)血小板功能,建議標(biāo)本檢測(cè)時(shí)間最好控制在采血后30 min至2 h,不宜超過(guò)4 h。程衛(wèi)紅[24]用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)70名健康人血小板參數(shù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng),血小板的各項(xiàng)參數(shù)隨之升高,采集4 h后影響更加明顯。

2.6 采血不暢和標(biāo)本運(yùn)輸過(guò)程中震蕩 無(wú)論采血不暢還是標(biāo)本運(yùn)輸過(guò)程中震蕩,均可刺激血小板體外激活,導(dǎo)致血小板最大聚集率和平均聚集率測(cè)定結(jié)果偏高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[25]。為避免采血對(duì)血小板活化的干擾,應(yīng)合理進(jìn)行采血排序,避免血小板功能檢測(cè)排采血第一管。血小板功能檢測(cè)結(jié)果是臨床上判斷抗血小板藥物療效的重要指標(biāo),故在標(biāo)本采集及運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)保證采集順暢,避免劇烈的震蕩,以免影響臨床對(duì)抗血小板藥物療效的評(píng)估。

3 小結(jié)與展望

急性血栓性疾病是臨床多發(fā)病,具有突發(fā)性強(qiáng)、致殘率高、致死率高等特點(diǎn)[26]。當(dāng)血管破裂或內(nèi)皮損傷時(shí),內(nèi)皮下膠原蛋白、組織因子、血管性血友病因子(von Willebrand disease factor,vWF)暴露,在激活內(nèi)、外源凝血系統(tǒng)的同時(shí),也激活靜息狀態(tài)下的血小板,活化的血小板通過(guò)vWF粘附到受損的血管內(nèi)皮,實(shí)現(xiàn)一期止血。活化血小板表面豐富的磷脂提供了催化凝血瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)的場(chǎng)所,導(dǎo)致大量凝血酶生成,水解纖維蛋白原為纖維蛋白,實(shí)現(xiàn)二期止血?；罨“暹€可釋放血栓烷(TXA2)、二磷酸腺苷(ADP)及炎性因子[27],通過(guò)第二信使刺激更多血小板吸附、聚集,促進(jìn)凝血酶的生成,放大凝血作用,形成血栓[28]。因此,臨床及時(shí)的抗血小板藥物干預(yù),對(duì)抑制及預(yù)防血栓形成有重要意義。

臨床上通常用抗血小板藥物來(lái)降低血小板反應(yīng)性,阻止血栓形成,減少和預(yù)防心、腦血管卒中事件的發(fā)生;根據(jù)藥物作用靶點(diǎn)不同,臨床常用抗血小板藥物分為:環(huán)氧酶抑制劑,代表藥物為阿司匹林、吲哚布芬;二磷酸腺苷受體拮抗藥,代表藥物為氯吡格雷、替格瑞洛;血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑,代表藥物為替羅非班[29]?？寡“逅幋嬖趥€(gè)體差異,即血小板反應(yīng)多樣性[30],根據(jù)患者服用抗血小板藥物后的反應(yīng),分為血小板高反應(yīng)性(high platelet reactivity,HPR)和血小板低反應(yīng)性(low platelet reactivity,LPR),HPR指患者對(duì)該抗血小板藥物不敏感,或用藥量不夠,血小板活性抑制不足,發(fā)生血栓風(fēng)險(xiǎn)較高;LPR指患者對(duì)該抗血小板藥物敏感,或用藥過(guò)量,血小板活性過(guò)度抑制,出血風(fēng)險(xiǎn)較高[31]。臨床醫(yī)生必須根據(jù)血小板功能檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行用藥調(diào)整,以減少多種強(qiáng)效抗血小板藥物聯(lián)合使用導(dǎo)致的出血不良事件[32]。2011年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)基金會(huì)(American College of Cardiology Foundation,ACCF)及美國(guó)心臟學(xué)會(huì)(American Heart Association,AHA)提出對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛(Unstable angina,UA)及非ST段抬高心肌梗死(Non-st-segment elevation myocardial infarction,NSTEMI)患者在服用抗血小板藥物治療時(shí)要進(jìn)行血小板功能檢測(cè)的建議[33]。

目前,臨床實(shí)驗(yàn)室血小板功能檢測(cè)方法主要包括光電比濁法(light transmittance aggregometry,LTA)、電阻抗法(impedance platelet aggregometry,IPA)、血栓彈力圖法(thromboelastography,TEG)、血管舒張劑刺激磷酸蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein,VASP)測(cè)定法、VerifyNow測(cè)定法、PAF-200小孔閉合時(shí)間測(cè)定法、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定法等,以LTA法應(yīng)用最為廣泛,被認(rèn)為是血小板功能檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[34]。其他實(shí)驗(yàn)方法的檢驗(yàn)結(jié)果也多與LTA進(jìn)行比較,但因原理及操作程序不同,不同方法學(xué)測(cè)定結(jié)果之間缺乏可比性[35]。如王曦[36]研究了各種方法之間的相關(guān)性,LTA 與血栓彈力圖的相關(guān)系數(shù)為 0.6(P<0.05),LTA 與Verify-Now 的相關(guān)系數(shù)為0.693,血栓彈力圖與 Verify-Now的相關(guān)系數(shù)為 0.564(P<0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間雖有相關(guān)性,但相關(guān)系數(shù)均不高。各種血小板功能檢測(cè)方法總體臨床預(yù)測(cè)價(jià)值不高,各方法的ROC曲線下面積為0.5～0.63,敏感度及特異性均<65%,且不能預(yù)測(cè)患者出血風(fēng)險(xiǎn)[37]。

綜上所述,盡管血小板功能檢測(cè)有多種方法,但因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)原理不同,各有優(yōu)缺點(diǎn)。LTA應(yīng)用最廣,因排除了RBC干擾,通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血漿濁度的變化反映PLT聚集功能,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好,但影響血漿透光率的因素,如溶血、脂血、黃疸、乳糜血會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果,且離心會(huì)誘導(dǎo)PLT活化,在非全血環(huán)境下,不能準(zhǔn)確、全面反映PLT在體內(nèi)活化、粘附、聚集、釋放功能;因操作熟練程度的不同,手工提取貧、富血小板血漿也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。IPA具有操作簡(jiǎn)單、全血檢測(cè)、無(wú)需離心、標(biāo)本用量少等優(yōu)點(diǎn),能最大程度反應(yīng)血小板在全血環(huán)境下的功能狀態(tài),但電極日常維護(hù)要求高,易受PLT數(shù)量及HCT影響,對(duì)輕度血小板功能障礙敏感度較低,多用于科研,臨床應(yīng)用較少。TEG通過(guò)對(duì)凝血纖溶過(guò)程曲線分析,可動(dòng)態(tài)反映血栓形成及溶解整個(gè)過(guò)程,PLT只是參與因子之一,對(duì)PLT功能的評(píng)價(jià)受其他因素,如纖維蛋白原、凝血因子等的影響[38]。VASP對(duì)PLT膜表面P2Y12信號(hào)通路特異性強(qiáng)[39],但不能檢測(cè)其他PLT活化通路,不能全面、完整反映PLT功能,多用于實(shí)驗(yàn)研究。VerifyNow快速血小板功能檢測(cè)儀操作簡(jiǎn)單,標(biāo)本用量少,可評(píng)價(jià)AA、ADP、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑的治療效果[40],但其實(shí)驗(yàn)原理以凝血酶作為聚集基線,檢測(cè)結(jié)果受纖維蛋白原及凝血酶影響較大。PAF-200利用小孔閉合時(shí)間來(lái)反應(yīng)PLT的功能狀態(tài),標(biāo)本用量少、檢測(cè)快速、可同時(shí)檢測(cè)血小板粘附功能,但受血流動(dòng)力學(xué)的影響較大,重復(fù)性差。流式細(xì)胞術(shù)利用熒光標(biāo)記抗體對(duì)PLT進(jìn)行表型分析,干擾因素少,特異性好,特別適用于血小板減少癥患者,但溶血產(chǎn)生的RBC碎片干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,為臨床提供一種檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好,能真實(shí)反映體內(nèi)血小板活化狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)方法,尤為重要。

連續(xù)計(jì)數(shù)法血小板功能檢測(cè)是近年來(lái)開展的一項(xiàng)評(píng)價(jià)血小板聚集功能的新技術(shù),操作簡(jiǎn)單,易于自動(dòng)化,與傳統(tǒng)“金標(biāo)準(zhǔn)”光電比濁法有較好的相關(guān)性。楊雅薇等[41]的研究顯示,SPCM、Verify-Now、血栓彈力圖、VASP檢測(cè)的血小板抑制率結(jié)果有一定的相關(guān)性,但SPCM在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及質(zhì)量控制方面還需改進(jìn)與完善,比如可以通過(guò)增加“固定時(shí)間點(diǎn)”檢測(cè)次數(shù)提高檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性;在明確校準(zhǔn)品溯源路徑、在說(shuō)明書或SOP文件中規(guī)范誘聚集效能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、合理應(yīng)用第三方質(zhì)控品進(jìn)行日常室內(nèi)質(zhì)控監(jiān)測(cè)、減小與血常規(guī)分析儀PLT計(jì)數(shù)誤差、增強(qiáng)不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果互認(rèn)等方面,需要進(jìn)一步規(guī)范與完善。除以上影響因素外,血小板聚集功能檢測(cè)還受血小板自身不穩(wěn)定的影響,標(biāo)本采血是否順暢、震蕩、存放時(shí)間及溫度、臨床用藥等均可導(dǎo)致血小板功能變化,對(duì)異常結(jié)果的判讀一定要結(jié)合臨床,與臨床醫(yī)生、采血護(hù)士充分溝通,了解臨床用藥、排除采血干擾后才能正確審核。