于海偉, 李銘楊, 張 軍, 李珊珊, 張梅娟, 馬天意, 趙 艷, 蘭紅宇, 翟 瑩

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006; 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院,黑龍江 齊齊哈爾 161005; 3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

脫落酸(Abscisic acid,ABA)是以異戊二烯為基本單位的半萜烯化合物。作為植物的重要激素,ABA不僅具有促進(jìn)種子休眠、影響根系結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉、促使葉片衰老脫落等多種生理作用[1],還參與逆境條件下植物的適應(yīng)過程[2]。在ABA合成路徑中,9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)是一種關(guān)鍵的限速酶[3],該酶由NCED基因編碼。因此,NCED基因的表達(dá)量直接影響植物體內(nèi)ABA的含量。

第1個(gè)NCED基因是從玉米中克隆而來[4]。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)NCED基因在植物中常以多基因家族的形式出現(xiàn)。擬南芥NCED基因家族包括9個(gè)成員,其中5個(gè)成員(AtNCED2、AtNCED3、AtNCED5、AtNCED6、AtNCED9)的編碼產(chǎn)物具有NCED酶活性,參與ABA的合成[5]。AtNCED3與擬南芥的抗旱性相關(guān),過表達(dá)AtNCED3的轉(zhuǎn)基因植株抗旱性得到提高[6-7]。AtNCED6和AtNCED9與種子萌發(fā)過程中的ABA合成相關(guān)[5]。此外,AtNCED9還參與高溫脅迫下ABA的合成和種子萌發(fā)的抑制[8]。AtNCED5與AtNCED3共同參與水分脅迫下的ABA合成,AtNCED5與AtNCED6和AtNCED9則共同調(diào)控種子的休眠[9]。NCED基因在植物基因工程中的應(yīng)用也在逐漸開展。在擬南芥中異位表達(dá)甘藍(lán)型油菜BnNCED3促進(jìn)了擬南芥種子休眠,使開花期提前,植株的抗逆性也得到提高[10]。番茄LeNCED1能夠使轉(zhuǎn)基因白三葉植株的ABA含量顯著提高,蒸騰速率顯著下降,從而使長(zhǎng)期水分利用效率提高[11]。水稻OsNCED4在擬南芥中的異源表達(dá)改變了轉(zhuǎn)基因植株大小和葉片形狀,延緩了種子萌發(fā)并導(dǎo)致萌發(fā)后的植株生長(zhǎng)對(duì)糖超敏感,增強(qiáng)了對(duì)干旱脅迫的耐受性[12]。過表達(dá)野海棠MhNCED3的轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)滲透和鎘脅迫的耐受性增強(qiáng)[13]。AtNCED3的過表達(dá)則能夠提高溫室和大田條件下轉(zhuǎn)基因大豆的抗旱性[14]。

作為一種重要的油料作物,人們對(duì)大豆的功能基因研究始終熱度不減。前人已從大豆中鑒定出一個(gè)能夠應(yīng)答非生物脅迫和外源ABA的NCED基因(GmNCED1),其過表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性和抗旱性[15-16]。本研究對(duì)大豆中的另一個(gè)NCED基因GmNCED1-2進(jìn)行克隆及功能初探,為其后續(xù)功能研究及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用大豆品種北豆9號(hào)、煙草品種NC89、菌種大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存和提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆幼苗非生物脅迫處理 使用Hoagland營養(yǎng)液,參照李銘楊等的方法水培大豆幼苗[17]。播種14 d后,幼苗的第一片三出復(fù)葉已經(jīng)完全展開,此時(shí)進(jìn)行非生脅迫處理。將幼苗移至含有200 μmol/L ABA的Hoagland營養(yǎng)液中處理培養(yǎng)。干旱、高鹽、高溫和低溫處理均參照李銘楊等的方法[17]。在ABA、干旱、高鹽、高溫和低溫處理不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、1 h、2 h、5 h、10 h和24 h)取幼苗的三出復(fù)葉0.1 g,同時(shí)取未經(jīng)處理的幼苗葉片、根和莖各0.1 g,所有取樣均重復(fù)3次,于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) 使用TaKaRa公司RNAiso Plus試劑提取大豆葉片mRNA并反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA(cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Innovagene公司)。以第一鏈cDNA為模板,通過qPCR檢測(cè)GmNCED1-2的表達(dá)量。20.0 μl qPCR反應(yīng)體系包括cDNA 2.0 μl、上下游引物各0.8 μl、2×TaqSYBR Green qPCR Premix(購自Innovagene公司)10.0 μl,ddH2O補(bǔ)至20.0 μl。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中GmNCED1-2的mRNA序列設(shè)計(jì)qPCR引物,上游引物5′-ACGTCGTCCAGAAGCCTTAC-3′,下游引物5′-ATCGTGCATCATGGTGGGTT-3′。內(nèi)參基因?yàn)镚mβ-Tubulin,上游引物5′-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3′,下游引物5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′[18]。在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR儀上設(shè)置參數(shù)如下:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s,共循環(huán)40次。所有樣品重復(fù)3次計(jì)算基因表達(dá)量。使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.3 基因克隆及生物信息學(xué)分析 根據(jù)GmNCED1-2的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,上游引物5′-GGAATTCCATATGATGGCATCATCAGCAGCAGC-3′,下劃線代表NdeI酶切位點(diǎn);下游引物5′-GGAATTCTCAAGCTTGTTTCCTCAAATCATT-3′,下劃線代表EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。以大豆cDNA為模板,PCR擴(kuò)增GmNCED1-2完整ORF序列,PCR退火溫度設(shè)為60 ℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后與pMD18-T克隆載體(購自TaKaRa公司)連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取質(zhì)粒通過雙酶切驗(yàn)證。菌液寄送生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。GmNCED1-2蛋白相對(duì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)的預(yù)測(cè)使用在線網(wǎng)址https://web.expasy.org/compute_pi/。GmNCED1-2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)使用在線網(wǎng)址http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1。GmNCED1-2蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析使用在線網(wǎng)址https://www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar。使用MEGA軟件構(gòu)建NCED蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。GmNCED1-2啟動(dòng)子序列的獲取使用在線數(shù)據(jù)庫http://www.plantgdb.org/GmGDB/。啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測(cè)分析使用在線網(wǎng)址http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/。

1.2.4 植物表達(dá)載體構(gòu)建及煙草遺傳轉(zhuǎn)化 使用DNA Ligation Kit(購自TaKaRa公司)將GmNCED1-2與植物表達(dá)載體pRI101(購自TaKaRa公司)連接,所用限制性內(nèi)切酶為NdeⅠ和EcoRⅠ。重組載體質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗(yàn)證后,熱激轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞。煙草的遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌侵染煙草葉盤法[19]。在MS培養(yǎng)基中添加50 mg/L卡那霉素篩選T0代和T1代轉(zhuǎn)基因煙草。使用基因組DNA提取試劑盒(購自TaKaRa公司)提取煙草葉片基因組DNA,通過PCR檢測(cè)GmNCED1-2是否整合進(jìn)入煙草基因組中。通過qPCR檢測(cè)GmNCED1-2在T0代轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量,檢測(cè)方法參照方法1.2.2,退火溫度改為56 ℃,內(nèi)參基因換為煙草Ntα-Tubulin基因,上游引物5′-ATGAGAGAGTGCATATCGAT-3′,下游引物5′-TTCACTGAAGAAGGTGTTGAA-3′[18]。通過SPSS軟件分析數(shù)據(jù)差異顯著性。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草根長(zhǎng)及生物量測(cè)定 對(duì)MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)18 d的野生型(Wild type,WT)煙草和T1代轉(zhuǎn)基因煙草的根長(zhǎng)和生物量進(jìn)行測(cè)量。通過SPSS軟件分析數(shù)據(jù)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmNCED1-2的克隆及序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取一個(gè)大豆NCED基因GmNCED1,GenBank登錄號(hào)XM014768319,其功能尚未被鑒定。通過PCR從大豆葉片cDNA中克隆獲得基因的完整ORF序列,測(cè)序結(jié)果顯示所獲得的序列與GenBank中公布的序列相符。由于大豆中已經(jīng)鑒定出1個(gè)GmNCED1基因[15-16],故將本研究中克隆的基因命名為GmNCED1-2。GmNCED1-2位于大豆基因組15號(hào)染色體上。GmNCED1-2的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如圖1所示,GmNCED1-2基因ORF全長(zhǎng)1 818 bp,編碼605個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量6.693×104,理論等電點(diǎn)8.00。GmNCED1-2蛋白含有1個(gè)RPE65超家族結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列第134位至597位),還含有2個(gè)保守序列MIAHPKxDP和HDFAITE及4個(gè)保守的組氨酸殘基,這些均屬于NCED蛋白家族特征。GmNCED1-2蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其位于葉綠體中。

下劃線表示保守的4個(gè)組氨酸殘基;陰影部分表示保守序列MIAHPKxDP和HDFAITE;*表示終止密碼子。圖1 GmNCED1-2的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of GmNCED1-2

2.2 NCED蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

將功能已經(jīng)得到鑒定的13個(gè)植物NCED蛋白與GmNCED1-2蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化分析結(jié)果(圖2)表明,GmNCED1-2蛋白與柑橘CrNCED1蛋白和野海棠MhNCED3蛋白的親緣關(guān)系較近,與大豆中的另一個(gè)GmNCED1蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

括號(hào)里列出的是蛋白質(zhì)GenBank登錄號(hào)。圖2 植物NCED蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of plant NCED proteins

2.3 GmNCED1-2表達(dá)模式分析

通過qPCR對(duì)GmNCED1-2在根、莖、葉中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。如圖3所示,GmNCED1-2在葉中的表達(dá)量最高,是根中表達(dá)量的28.5倍;在莖中的表達(dá)量約是根中表達(dá)量的4.4倍。通過qPCR對(duì)GmNCED1-2在ABA、干旱、高鹽、高溫和低溫處理24 h內(nèi)葉片中的表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。如圖3所示,脅迫處理后,GmNCED1-2的表達(dá)量均存在升高趨勢(shì)。ABA處理后,GmNCED1-2的表達(dá)量在1 h和24 h出現(xiàn)2次峰值;干旱處理后GmNCED1-2的表達(dá)量升高最明顯,在24 h的表達(dá)量是未處理對(duì)照(0 h)的455.8倍;高鹽、高溫和低溫處理后,GmNCED1-2表達(dá)量峰值分別出現(xiàn)在10 h、5 h和24 h。

圖柱上不同小寫字母表示不同組織間或不同處理時(shí)間間差異顯著(P<0.05)。圖3 GmNCED1-2的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of GmNCED1-2

2.4 GmNCED1-2啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)分析

對(duì)GmNCED1-2基因起始密碼子上游2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)其含有4種逆境及激素響應(yīng)相關(guān)順式作用元件(表1),包括2個(gè)脫落酸響應(yīng)元件(ABRE),3個(gè)厭氧誘導(dǎo)元件(ARE),1個(gè)防御和脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)和1個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(TGACG-motif)。這些順式作用元件的存在,與GmNCED1-2能夠應(yīng)答ABA和非生物脅迫的結(jié)果相符合。

表1 GmNCED1-2啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

2.5 GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草遺傳轉(zhuǎn)化及鑒定

煙草葉片基因組DNA PCR檢測(cè)結(jié)果(圖4A)顯示,共獲得3棵GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草植株,分別命名為OE1、OE2和OE3。GmNCED1-2在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達(dá)量為OE1>OE3>OE2(圖4B)。

A:煙草基因組DNA PCR 檢測(cè);B:GmNCED1-2在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達(dá)量;M:Marker(基因大小標(biāo)記);WT:野生型煙草植株;+:pRI101-GmNCED1-2陽性質(zhì)粒;OE1～OE3:T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株。圖柱上不同小寫字母表示不同煙草植株間GmNCED1-2相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。圖4 GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草鑒定Fig.4 Identification of GmNCED1-2 transgenic tobacco

2.6 T1代GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草根長(zhǎng)和生物量分析

對(duì)生長(zhǎng)18 d的野生型(WT)煙草和GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草的根長(zhǎng)和生物量進(jìn)行測(cè)定。根長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果(圖5)顯示,WT煙草的根長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于轉(zhuǎn)基因煙草。生物量測(cè)定結(jié)果(圖5)顯示,WT煙草的生物量顯著高于轉(zhuǎn)基因煙草。以上結(jié)果表明GmNCED1-2的過表達(dá)抑制了轉(zhuǎn)基因煙草根的伸長(zhǎng)及植株的生長(zhǎng)。

WT:野生型煙草;OE1～OE3:T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株。圖柱上不同小寫字母表示不同煙草植株間差異顯著(P<0.05)。圖5 WT煙草和GmNCED1-2轉(zhuǎn)基因煙草根長(zhǎng)和生物量Fig.5 Root length and biomass of WT tobacco and GmNCED1-2 transgenic tobacco

3 討 論

ABA在植物生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)逆境脅迫過程中的生物合成受NCED基因表達(dá)水平的調(diào)控,這一點(diǎn)已經(jīng)得到了廣泛的證實(shí)。因此,對(duì)NCED基因進(jìn)行遺傳操作可以提高植物體內(nèi)ABA水平,調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育并增強(qiáng)其脅迫耐受性[20-21]。盡管從大豆中已經(jīng)鑒定出一個(gè)具有非生物脅迫抗性的GmNCED1[15-16],但由于NCED基因?yàn)槎嗷蚣易寤?且各基因之間存在一定的分工[5-9],因此有必要對(duì)大豆中其他NCED基因的功能進(jìn)行探索。本研究克隆的GmNCED1-2所編碼的蛋白質(zhì)含有一個(gè)類胡蘿素裂解酶均有的RPE65結(jié)構(gòu)域,還含有4個(gè)保守的組氨酸殘基,這些殘基負(fù)責(zé)與鐵輔因子相結(jié)合[22-24]。以往研究結(jié)果表明,NCED蛋白大多定位于葉綠體中[25-26],因?yàn)樗鼈兊淖饔玫孜镂挥谫|(zhì)體中[23]。本試驗(yàn)也預(yù)測(cè)GmNCED1-2蛋白定位在葉綠體中。GmNCED1-2蛋白與CrNCED1蛋白和MhNCED3蛋白的親緣關(guān)系較近,它們可能在功能上存在相似性。MhNCED3可以被干旱、低溫、鹽和鎘脅迫誘導(dǎo)表達(dá),其過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)滲透和鎘脅迫的耐受性[13]。CrNCED1可以被干旱、低溫脅迫和ABA誘導(dǎo)表達(dá)[27],這些也為后續(xù)GmNCED1-2的功能鑒定提供了參考。

GmNCED1-2在葉中的表達(dá)量最高,在根中的表達(dá)量最低,這一結(jié)果與CrNCED1的組織定量結(jié)果一致,意味它們具有組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)[27]。以往研究結(jié)果也表明,NCED基因可以在不同組織中表達(dá)并調(diào)節(jié)ABA的生物合成,包括根、莖和葉,但在根部的表達(dá)量往往最低[28]。因此后續(xù)選擇大豆幼苗葉片作為試驗(yàn)材料,分析GmNCED1-2對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答情況。GmNCED1-2在不同的脅迫處理下表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式,這表明存在不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制控制著GmNCED1-2的轉(zhuǎn)錄。GmNCED1-2對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答最為明顯,其次是高鹽脅迫,但在高溫或低溫脅迫下其表達(dá)量的變化不超過10倍。不同NCED基因?qū)Σ煌巧锩{迫的應(yīng)答也不盡相同,例如VuNCED1的表達(dá)能夠被干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo),但對(duì)ABA和高溫或低溫脅迫無響應(yīng)[29];TaNCED3能夠被ABA誘導(dǎo)表達(dá),但對(duì)高鹽和低溫脅迫無響應(yīng)[30];而FvNCED3的表達(dá)則被ABA、干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo),但在高溫和低溫脅迫下表達(dá)量卻下降[31]。

ABRE是響應(yīng)ABA的主要順式作用元件,常位于脅迫誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子中[26]。GmNCED2-1啟動(dòng)子中含有2個(gè)ABRE,qPCR結(jié)果也證實(shí)ABA可以誘導(dǎo)GmNCED2-1的表達(dá)。而TGACG-motif則是響應(yīng)茉莉酸的順式作用元件,茉莉酸信號(hào)也參與植物的抗逆機(jī)制調(diào)控[32]。此外,GmNCED2-1啟動(dòng)子中還含有3個(gè)厭氧誘導(dǎo)元件和1個(gè)防御和脅迫響應(yīng)元件,這些元件的存在表明GmNCED1-2可能受復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的調(diào)控,是其能夠響應(yīng)多種逆境脅迫的重要原因。

研究結(jié)果表明,用ABA處理擬南芥幼苗,可以抑制主根伸長(zhǎng),濃度過高時(shí)會(huì)導(dǎo)致幼苗子葉無法張開,不能長(zhǎng)出真葉[33]。NCED基因通過控制ABA的合成可以調(diào)控種子萌發(fā)和根系生長(zhǎng)等植物生長(zhǎng)發(fā)育過程。GmNCED1-2在煙草中的過表達(dá)抑制了轉(zhuǎn)基因煙草根的伸長(zhǎng)和植株的生長(zhǎng),這應(yīng)該與GmNCED1-2過表達(dá)后導(dǎo)致煙草中ABA含量升高相關(guān)。在其他NCED過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物中也存在類似現(xiàn)象。例如,BnNCED3轉(zhuǎn)化擬南芥后促進(jìn)了擬南芥種子休眠,抑制側(cè)根生長(zhǎng),并使轉(zhuǎn)基因擬南芥提前開花[10]。CrNCED1轉(zhuǎn)基因煙草的根生長(zhǎng)速度慢于野生型,但在含ABA的培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因煙草的根生長(zhǎng)速度則快于野生型,表明ABA對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草根的生長(zhǎng)抑制作用較小[27]。另有文獻(xiàn)報(bào)道,干擾NtNCED3-2的表達(dá)會(huì)抑制煙草初生根的發(fā)育,出現(xiàn)發(fā)育遲緩和葉片腺毛數(shù)量減少的現(xiàn)象[34]。綜上,大豆GmNCED1-2作為NCED基因家族成員能夠響應(yīng)非生物脅迫,其過表達(dá)抑制了轉(zhuǎn)基因煙草根的伸長(zhǎng)和植株的生長(zhǎng)。