張 芳,陸瑞華,傅煥哲,張文華,李 重,任 鋼,陳占平,趙玉玲,郭 盛,錢大瑋,段金廒*
基于AFLP分子標(biāo)記的我國不同生態(tài)栽培產(chǎn)區(qū)枸杞資源遺傳多樣性分析
張 芳1,陸瑞華1,傅煥哲1,張文華2,李 重2,任 鋼3,陳占平3,趙玉玲4,郭 盛1,錢大瑋1,段金廒1*
1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心,江蘇 南京 210023 2. 寧夏百瑞源枸杞股份有限公司,寧夏 銀川 750200 3. 青海省海西蒙古族藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,青海 德令哈 817000 4. 新疆維吾爾自治區(qū)博爾塔拉蒙古自治州精河縣枸杞產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心,新疆 博爾塔拉 833399
利用熒光標(biāo)記輔助的擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)技術(shù),從基因組DNA水平上分析我國6個栽培生產(chǎn)區(qū)域52份枸杞樣本的遺傳多樣性。對提取的枸杞DNA樣本進(jìn)行酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增和選擴(kuò)增等步驟,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)分離和數(shù)據(jù)采集后,利用Popgene軟件計(jì)算遺傳多樣性參數(shù),利用GenAlex軟件計(jì)算遺傳距離并進(jìn)行主坐標(biāo)分析,利用MEGA-X軟件根據(jù)遺傳距離進(jìn)行聚類分析,利用Structure軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。共篩選得到10對AFLP選擇性擴(kuò)增引物組合,擴(kuò)增得到328條擴(kuò)增片段,其中多態(tài)性片段121條,且在不同產(chǎn)地枸杞居群間多態(tài)性位點(diǎn)分布不均勻。分析顯示不同栽培產(chǎn)區(qū)枸杞的遺傳多樣性較低,等位基因數(shù)(observed number of alleles,a)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,e)、觀測雜合度(Nei’s gene diversity,)和香濃信息指數(shù)(Shannon information index,)分別為1.438 0、1.231 6、0.140 7和0.215 2,Nei’s遺傳相似性范圍為0.835 4~0.890 2。不同栽培生產(chǎn)區(qū)域的枸杞居群間存在較為頻繁的基因交流,遺傳分化程度中等。居群內(nèi)部遺傳變異是枸杞遺傳變異的主要來源,居群間遺傳變異不顯著,同時(shí)遺傳距離與地理距離沒有明顯相關(guān)性??蔀殍坭降倪z傳背景信息積累、引種栽培、種質(zhì)資源保護(hù)、核心種質(zhì)庫構(gòu)建以及可持續(xù)開發(fā)策略的制定和管理提供科學(xué)依據(jù)。
枸杞屬;擴(kuò)增片段長度多態(tài)性;種質(zhì)資源;遺傳多樣性;栽培生產(chǎn)區(qū)域
遺傳多樣性是指種內(nèi)不同群體或同一群體不同個體之間通過長期進(jìn)化積累的遺傳變異的總和,是該物種在自然壓力下適應(yīng)外部復(fù)雜環(huán)境變化、維持生存和進(jìn)化潛力的物質(zhì)基礎(chǔ),也是評價(jià)物種生物多樣性、生物資源狀況的重要指標(biāo)[1]。在適應(yīng)生存環(huán)境變化的過程中,一個物種(或群體)的遺傳多樣性越豐富,表明環(huán)境適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力越強(qiáng),越容易開拓新的生長環(huán)境并擴(kuò)展自然分布范圍。相反,低水平的遺傳多樣性往往伴隨遺傳雜合度降低和近交衰退,并進(jìn)一步制約物種或種群的環(huán)境變化適應(yīng)能力和進(jìn)化潛能,增加種群滅絕的風(fēng)險(xiǎn)[2]。
DNA分子標(biāo)記技術(shù)已成為分析遺傳多樣性時(shí)必不可少的手段,主要包括基于Southen雜交的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)標(biāo)記技術(shù),基于PCR的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(random amplified polymorphism,RAPD)標(biāo)記技術(shù)、簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats,SSR)標(biāo)記技術(shù)和簡單重復(fù)序列間區(qū)(inter-simple sequence repeat,ISSR)標(biāo)記技術(shù)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)標(biāo)記技術(shù)[3-4],以及基于PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的分子標(biāo)記,如擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)標(biāo)記技術(shù)和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS)標(biāo)記技術(shù)[5]。這些標(biāo)記技術(shù)各有優(yōu)勢,其中AFLP技術(shù)是基于限制性酶切和PCR擴(kuò)增的全基因組DNA擴(kuò)增片段長度多態(tài)性檢測方法[6]。AFLP技術(shù)擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定,標(biāo)記多態(tài)性條帶比例高,獲得信息量大,不受物種基因組來源、復(fù)雜程度和環(huán)境條件的影響,尤其適用于遺傳背景模糊、材料來源廣泛的物種遺傳資源的標(biāo)記分析,是進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究的最為有效的分子標(biāo)記技術(shù)之一,目前已在多種動植物資源的遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定和評價(jià)、遺傳多樣性分析、遺傳變異規(guī)律分析及品種家系分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。近年來,AFLP技術(shù)逐漸引入中藥資源研究領(lǐng)域,并在薏苡[7]、忍冬[8]、烏頭[9]、厚樸[10]、三葉木通[11]等中藥材的遺傳多樣性分析中發(fā)揮了重要作用。
枸杞是茄科(Solanaceae)枸杞屬L.多年生多分枝落葉灌木,是我國重要的藥食兩用植物資源,其果實(shí)枸杞子早在《神農(nóng)本草經(jīng)》已被列為上品。枸杞屬植物約有80余種,我國有7個種和2個變種[12],自然分布于我國西北干旱地區(qū)溫帶荒漠區(qū)域和溫帶草原區(qū)域。枸杞對惡劣環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng),具有較強(qiáng)的抗旱耐寒耐鹽堿特性。近年來,我國枸杞的引種栽培產(chǎn)業(yè)十分活躍,核心產(chǎn)區(qū)由寧夏回族自治區(qū)逐步向外輻射至我國新疆、青海、甘肅、內(nèi)蒙等省區(qū),多數(shù)品種(系)在不同區(qū)域均有種植。在長期的自然演化、資源交流、地理隔離、遺傳漂變和人工選育等多種因素共同作用下,枸杞的基因型高度雜合,遺傳背景復(fù)雜,表型變異豐富,同物異名或同名異物現(xiàn)象普遍。
目前有關(guān)我國枸杞資源地理分布范圍內(nèi)遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)變異領(lǐng)域的研究較為缺少。尹躍等[13]建立和優(yōu)化了枸杞的SRAP反應(yīng)體系,唐燕等[14]對寧夏中寧縣26份枸杞屬種質(zhì)資源的27個表型性狀進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),供試種質(zhì)的遺傳多樣性較為豐富,李彥龍等[15]采用AFLP技術(shù)對寧夏銀川地區(qū)的15份枸杞進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)不同品種的枸杞樣本之間遺傳多樣性較為豐富,任重等[16]采用SSR分子標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)紅果枸杞栽培品種之間遺傳差異較小,鮑紅春等[17]利用ISSR技術(shù)對10個枸杞品種的遺傳差異進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)寧夏地區(qū)和內(nèi)蒙古地區(qū)的枸杞品系存在較大差異,但種群內(nèi)部遺傳相似性較高。余意等[18]采用SSR技術(shù)分析我國4個省區(qū)17個栽培寧夏枸杞居群的178個個體樣本后,發(fā)現(xiàn)栽培已經(jīng)引起枸杞遺傳多樣性明顯下降。
本研究收集了我國6個主要生產(chǎn)栽培產(chǎn)區(qū)的52份枸杞樣本,借助熒光標(biāo)記輔助的毛細(xì)管電泳檢測技術(shù),建立基于枸杞全基因組遺傳多樣性特征的AFLP分析技術(shù)體系,從基因組DNA分子水平上分析枸杞主要生態(tài)產(chǎn)區(qū)不同栽培品系的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)差異,以充分了解和掌握其遺傳多樣性和遺傳特征信息及親緣關(guān)系,為枸杞的遺傳背景信息積累、引種栽培、種質(zhì)資源保護(hù)、種質(zhì)創(chuàng)新、核心種質(zhì)庫構(gòu)建以及可持續(xù)開發(fā)策略的制定和管理提供科學(xué)依據(jù)。
ABI3730xl毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司);PowerPac HC高電流電泳儀及Mini-Sub Cell DT電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司);C1000 Touch PCR儀(美國BIO-RAD公司);ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司);Nano Drop 2000c型微量核酸檢測儀(美國Thermo Scientific公司),MicroCL 21R微量離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)。
供試樣本52個(表1),由本課題組于2019年7月至2019年8月采集自我國枸杞的主要栽培產(chǎn)區(qū)寧夏銀川平原(15株,海拔1126 m,38°40′ N,106°03′ E)、新疆維吾爾自治區(qū)博爾塔拉蒙古自治州精河縣(11株,海拔320 m,44°36′ N,82°54′ E)、甘肅省酒泉市玉門市(7個,海拔1517 m,40°18′ N,97°24′ E)、甘肅省白銀市靖遠(yuǎn)縣(4株,海拔1406 m,36°36′ N,104°44′ E)、青海省海西州德令哈市(4株,海拔2996 m,37°23′ N,97°22′ E)、內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市(11株,海拔1034 m,40°58′ N,107°00′ E)。采集時(shí)選取生長旺盛的成年單株盛果期植株,采集從上至下第5對健康、無病蟲的展開葉片,用蒸餾水沖洗表面并用濾紙干燥后迅速放入帶有標(biāo)簽的自封袋中,干冰保存運(yùn)輸。所有樣品由南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為茄科枸杞屬植物枸杞.的葉。
表1 供試樣品信息
Table 1 Sample information
序號樣品名稱采集地序號樣品名稱采集地 1寧農(nóng)杞2號寧夏銀川27短日照寧杞1號甘肅玉門 2寧農(nóng)杞9號寧夏銀川28未知種甘肅玉門 3寧杞2號寧夏銀川29寧杞5號甘肅玉門 4菜用枸杞寧夏銀川30玉門未知種甘肅玉門 5中科綠川1號寧夏銀川31寧杞5號甘肅玉門 6珍珠枸杞寧夏銀川32寧杞1號甘肅玉門 7寧杞5號寧夏銀川33寧杞1號甘肅玉門 8蒙杞1號寧夏銀川34蒙杞1號甘肅靖遠(yuǎn) 9中華枸杞寧夏銀川35靖遠(yuǎn)寧杞7號甘肅靖遠(yuǎn) 10寧杞7號寧夏銀川36寧杞5號甘肅靖遠(yuǎn) 11中科黃果1號寧夏銀川37寧杞1號甘肅靖遠(yuǎn) 12黃果枸杞寧夏銀川38寧杞5號青海德令哈 13黑枸杞寧夏銀川39寧杞1號5年青海德令哈 14寧杞1號寧夏銀川40寧杞7號青海德令哈 15寧杞1號寧夏銀川41寧杞1號青海德令哈 16蒙杞1號新疆精河42科杞608內(nèi)蒙古巴彥淖爾 17寧杞1號新疆精河43中科綠川1號內(nèi)蒙古巴彥淖爾 18精河枸杞4號新疆精河44寧杞7號內(nèi)蒙古巴彥淖爾 19精河枸杞5號新疆精河45寧杞2號內(nèi)蒙古巴彥淖爾 20寧農(nóng)杞4號新疆精河46寧杞9號內(nèi)蒙古巴彥淖爾 21寧杞3號新疆精河47寧杞10號內(nèi)蒙古巴彥淖爾 22寧杞7號新疆精河48蒙杞1號內(nèi)蒙古巴彥淖爾 23寧杞5號新疆精河49當(dāng)?shù)仄贩N內(nèi)蒙古巴彥淖爾 24寧農(nóng)杞5號新疆精河50寧杞5號內(nèi)蒙古巴彥淖爾 25寧農(nóng)杞1號新疆精河51寧杞4號內(nèi)蒙古巴彥淖爾 26寧杞1號新疆精河52寧杞1號內(nèi)蒙古巴彥淖爾
限制性內(nèi)切酶I和I購自New England BioLabs公司;DNA連接酶DNA Ligation Kit<Mighty Mix>和DNA聚合酶TMHot Start Version,DNA Marker DL5 000和DL15 000均購自TaKaRa公司;擴(kuò)增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;羥基熒光素(5’-FAM)修飾引物由北京睿博興科生物科技有限公司合成;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
取各地樣品約100 mg,采用改良的CTAB法進(jìn)行基因組總DNA的提取,具體方法參考本課題組前期報(bào)道[19],取1 μL DNA用Nano Drop 2000c微量核酸蛋白檢測儀檢測DNA的質(zhì)量和濃度,260/280比值應(yīng)在1.7~1.9;另取瓊脂糖電泳另取5 μL DNA樣品進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀下觀察,檢測DNA的完整性和純度。
2.2.1 酶切和連接體系
(1)酶切:DNA樣品分別用I與I進(jìn)行酶切:酶切反應(yīng)體系25 μL,包括DNA 300 ng,I和I各15 IU,酶切緩沖液CutSmart 2.5 μL,補(bǔ)ddH2O至25 μL,37 ℃水浴酶切10 h,65 ℃滅活20 min。
(2)連接反應(yīng):根據(jù)接頭引物表(表2),將I單鏈接頭和I單鏈接頭分別稀釋后變性并退火形成雙鏈接頭。連接反應(yīng)體系25 μL,包括5 μL酶切產(chǎn)物,7.5 μmol/L雙鏈接頭,1U DNA連接酶,16 ℃連接過夜。
(3)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng):預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL,包括2 μL稀釋后連接產(chǎn)物,1 UHS DNA聚合酶,1 μL dNTP (2.5 mmol/L),5 μmol/LE00和M00預(yù)擴(kuò)增引物(表2)。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃延伸15 min。
(4)選擇性擴(kuò)增反應(yīng):選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL,包括1.5 μL稀釋后預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物,1 U DNA聚合酶,2 μL dNTP (2.5 mmol/L),5 μmol/LI選擇性擴(kuò)增引物,1.5 μmol/LI選擇性擴(kuò)增引物。PCR反應(yīng)條件分為3個階段:第1階段為13個循環(huán),94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,65 ℃退火(每個循環(huán)退火溫度遞減1 ℃),72 ℃延伸1 min;第2階段為23個普通PCR循環(huán),94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min;最后階段72 ℃延伸10 min。選擇性擴(kuò)增完成后,根據(jù)瓊脂糖電泳結(jié)果篩選特異性條帶清晰且數(shù)量適宜的引物對。
2.2.2 毛細(xì)管電泳檢測 根據(jù)選擇性擴(kuò)增引物篩選結(jié)果,運(yùn)用熒光標(biāo)記技術(shù)在篩選出的引物對中對I引物序列末端進(jìn)行5’-FAM熒光標(biāo)記,并根據(jù)已建立的酶切、連接及PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系完成所有樣本的選擇性擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物用ABI 3730xl毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行分離,采用激光誘導(dǎo)熒光采集數(shù)據(jù)。電泳結(jié)果在Gene marker 2.2.0軟件中進(jìn)行可視化處理,獲得多態(tài)性DNA片段電泳圖譜及掃描峰圖。
2.3.1 電泳結(jié)果矩陣轉(zhuǎn)換 使用Gene marker 2.2.0 軟件電泳峰值圖進(jìn)行掃描和判讀,選取大小在50~500 bp的片段進(jìn)行統(tǒng)計(jì),同一遷移位置有表征片段位點(diǎn)記為“1”,無表征片段位點(diǎn)記為“0”,進(jìn)行結(jié)果“0/1”賦值并構(gòu)建多態(tài)性位點(diǎn)“0/1”矩陣。
表2 接頭和引物序列信息
Table 2 Sequence information of adaptors and primers
接頭與引物EcoR I (5’-3’)Mse I (5’-3’) 接頭ICTCGTAGACTGCGTACCGACGATGAGTCCTGAG 接頭IIAATTGGTACGCAGTCTACTACTCAGGACTCAT 預(yù)擴(kuò)引物GACTGCGTACCAATTC(E00)GATGAGTCCTGAGTAAC(M00)
2.3.2 遺傳多樣性數(shù)據(jù)計(jì)算 利用Popgene 32軟件計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)(number of polymorphic loic,)、多態(tài)性位點(diǎn)百分比(percentage of polymorphic loic,)、觀測等位基因數(shù)(observed number of alleles,a)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,e)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity,)、香農(nóng)多樣性信息指數(shù)(Shannon information index,)、總基因多態(tài)性(t)、群體內(nèi)基因多態(tài)性(s)、遺傳分化指數(shù)(st)、基因流(estimate of gene flow fromst,m),以及各居群間遺傳距離(genetic distance)和遺傳相似性,分析居群內(nèi)和居群間的遺傳變異分布。利用Arlequin V3.5.2.2軟件進(jìn)行分子方差分析(analysis of molecular variance,AMOVA)計(jì)算遺傳變異在各產(chǎn)地居群間及居群內(nèi)所占百分比。
2.3.3 主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)、遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析 利用GenAlex 6.502軟件計(jì)算個體間遺傳距離并進(jìn)行PCoA,根據(jù)降維處理的信息評估遺傳多樣性的分化。采用MEGA-X軟件根據(jù)遺傳距離進(jìn)行個體間的非加權(quán)組成配對法(unweighted pair group method analysis,UPGMA)聚類分析并構(gòu)建聚類圖。根據(jù)GenAlex 6.502軟件根據(jù)各栽培產(chǎn)區(qū)的經(jīng)緯度計(jì)算各產(chǎn)區(qū)之間的地理距離,并進(jìn)行所有枸杞樣本地理距離與遺傳距離的相關(guān)性分析。
2.3.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 利用Structure V2.3.4進(jìn)行基于貝葉斯算法的樣本來源判斷,以反映群體的遺傳結(jié)構(gòu)。設(shè)定群組數(shù)()為2~10,每個重復(fù)10次模擬運(yùn)算,MCMC重抽樣設(shè)為10 000,分析結(jié)果導(dǎo)入在線工具Structure Harvester (http://taylor0. biology. ucla.edu/structureHarvester/)計(jì)算預(yù)測最優(yōu)居群數(shù),然后利用Distruct 1.1軟件生成枸杞遺傳結(jié)構(gòu)條形堆積圖。
用+I(xiàn)組合后對枸杞基因組DNA進(jìn)行酶切,圖1-a和圖1-b分別是酶切后和預(yù)擴(kuò)增后的代表性電泳圖譜,可見經(jīng)雙酶切后原基因組DNA主條帶消失,在原主帶下方出現(xiàn)均勻彌散帶,經(jīng)酶切產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增后,PCR產(chǎn)物在500 bp以下區(qū)域形成連續(xù)的均勻彌散帶,在高相對分子質(zhì)量區(qū)無擴(kuò)增產(chǎn)物,表明DNA消化徹底,預(yù)擴(kuò)增結(jié)果合理,符合AFLP選擇性擴(kuò)增的要求。
圖1-c為代表性選擇性擴(kuò)增圖譜,共設(shè)計(jì)了10個I選擴(kuò)引物和9個I選擴(kuò)引物,組合后得到90對選擴(kuò)引物組合,根據(jù)選擴(kuò)圖譜,從中篩選出10對選擴(kuò)譜帶清晰、數(shù)量適宜、多樣性位點(diǎn)豐富的10對選擴(kuò)引物對,10對選擴(kuò)引物及其序列見表3。
圖2為代表性DNA擴(kuò)增片段電泳圖譜及掃描峰圖,對特征性條帶進(jìn)行“0/1”賦值并轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)矩陣用于遺傳多樣性分析。
圖1 枸杞基因組DNA酶切(a)、預(yù)擴(kuò)增(b) 及選擇性擴(kuò)增(c) 后瓊脂糖電泳圖譜
表3 選擇性擴(kuò)增引物組合
Table 3 Selective amplification primers
編號EcoRI (5’-3’)MseI (5’-3’) p1GACTGCGTACCAATTCACCGATGAGTCCTGAGTAACAC p2GACTGCGTACCAATTCACCGATGAGTCCTGAGTAACAA p3GACTGCGTACCAATTCACCGATGAGTCCTGAGTAACTA p4GACTGCGTACCAATTCACGGATGAGTCCTGAGTAACCA p5GACTGCGTACCAATTCAGGGATGAGTCCTGAGTAACTT p6GACTGCGTACCAATTCAGGGATGAGTCCTGAGTAACCA p7GACTGCGTACCAATTCAGCGATGAGTCCTGAGTAACTT p8GACTGCGTACCAATTCAGCGATGAGTCCTGAGTAACCA p9GACTGCGTACCAATTCAGAGATGAGTCCTGAGTAACTA p10GACTGCGTACCAATTCAACGATGAGTCCTGAGTAACCA
圖2 枸杞DNA的AFLP分析選擇性擴(kuò)增代表性電泳圖譜(a) 及掃描峰圖(b)
篩選后的10對選擴(kuò)引物組合對6個不同產(chǎn)區(qū)52個枸杞DNA參試樣本進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果見表4。結(jié)果表明,在50~500 bp共擴(kuò)增出328條選擇性擴(kuò)增片段,其中多態(tài)性片段121條,在不同產(chǎn)地枸杞居群多態(tài)性位點(diǎn)分布不均勻,各居群枸杞多態(tài)性位點(diǎn)百分比為25.30%~71.65%,平均為60.32%,說明本研究篩選出的選擴(kuò)引物和建立的AFLP標(biāo)記方法在參試枸杞樣本中檢測到較為豐富的多態(tài)性,適于分析其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析。
不同居群枸杞的a變化范圍為1.253 0~1.716 5,平均為1.438 0,e變化范圍為1.276 2~1.481 8,平均為1.231 6。各居群內(nèi)部a略高于e,表明各居群中等位基因的分布較為均勻,遺傳差異較小,但存在有效種群規(guī)模變小和有效等位基因丟失的情況。同時(shí),不同居群間的a和e的變化范圍較小,說明我國不同生態(tài)產(chǎn)區(qū)的枸杞居群間存在著一定的遺傳差異性,但差異程度較低。變化范圍為0.105 9~0.166 6,平均為0.140 7。范圍為0.153 9~0.273 8,平均為0.215 2,呈現(xiàn)出一定的遺傳異質(zhì)性但是水平較低、遺傳同質(zhì)性較高的多樣性特點(diǎn),說明我國枸杞種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)較為狹窄,遺傳多樣性不顯著。其中寧夏銀川居群內(nèi)部多樣性相對較高,群內(nèi)遺傳分化處于相對較高水平,與寧夏地區(qū)作為我國主要的枸杞引種起源中心的實(shí)際情況相一致。
表4 不同栽培生產(chǎn)區(qū)域枸杞居群間的遺傳多樣性指數(shù)
Table 4 Genetic diversity of different populations of L. chinense
產(chǎn)地APP/%NaNeHI 寧夏銀川(n=15)23571.651.716 5±0.451 41.248 8±0.276 60.166 6±0.150 80.273 8±0.217 6 新疆精河(n=11)14544.211.442 1±0.497 41.224 7±0.317 00.138 3±0.177 40.213 1±0.260 1 甘肅玉門(n=7)12638.411.384 1±0.487 11.220 8±0.330 00.132 7±0.181 60.200 9±0.266 1 甘肅靖遠(yuǎn)(n=4) 8325.301.253 0±0.435 41.187 2±0.336 10.105 9±0.184 80.153 9±0.266 6 青海德令哈(n=4)10933.231.332 3±0.471 81.231 1±0.342 50.134 5±0.193 40.197 2±0.281 9 內(nèi)蒙古巴彥淖爾(n=11)16450.001.500 0±0.500 81.277 0±0.348 10.166 1±0.189 50.252 4±0.274 3 群體間12136.891.368 9±0.483 21.240 1±0.350 20.140 1±0.192 40.207 8±0.279 5
由表5所示的枸杞居群AMOVA分析結(jié)果表明,不同居群的枸杞居群間存在一定程度的遺傳分化。在總的遺傳變異中,不同栽培生產(chǎn)區(qū)域的各居群間的變異僅有6.09%,居群內(nèi)的變異率為93.91%,居群內(nèi)部的遺傳變異率遠(yuǎn)大于不同產(chǎn)地間居群間的變異率,說明居群內(nèi)部變異是枸杞居群變異的主要來源,這與前述遺傳多樣性的分析結(jié)果相一致。
表5 不同栽培生產(chǎn)區(qū)域枸杞居群的分子方差分析(AMOVA)
Table 5 Molecular variance analysis (AMOVA) among different populations of L. chinense
變異來源自由度平方和方差分量變異百分率/% 居群間 5 47.1700.294 72 6.09 居群內(nèi)98445.5234.546 15 93.91
基因多樣性是衡量遺傳多樣性的重要指標(biāo)。從遺傳分化數(shù)據(jù)來看,6個不同栽培生產(chǎn)區(qū)域居群枸杞的t為0.123 1,居群內(nèi)部s為0.106 2,占86.27%。居群間st為0.137 4,呈現(xiàn)中等程度的遺傳分化。m為3.140 3,說明不同栽培生態(tài)產(chǎn)區(qū)各居群間基因交流和滲透較為充分,在一定程度上降低了居群間遺傳分化現(xiàn)象的發(fā)生??傔z傳多樣性僅有13.74%來源于居群間遺傳變異,進(jìn)一步驗(yàn)證群內(nèi)遺傳分化是枸杞遺傳多樣性的主要因素。
如表6所示,枸杞6個居群的Nei’s遺傳相似性在范圍為0.835 4~0.890 2,遺傳距離范圍為0.116 3~0.183 5,各居群間遺傳相似性較高。如寧夏銀川與新疆精河實(shí)際地理距離較遠(yuǎn),間隔2000多km,但兩地枸杞群體間仍具有高度的遺傳相似性(0.887 2)和較小的遺傳距離(0.119 7),說明這2個居群間親緣關(guān)系接近,群間變異較小。
以每一個樣本名為觀測指標(biāo),進(jìn)一步對6個不同栽培生產(chǎn)區(qū)域的52份枸杞樣本進(jìn)行PCoA,并構(gòu)建可視化二維平面圖,分析所有樣本的整體分布趨勢和自然聚集預(yù)覽,同時(shí)采用UPGMA法根據(jù)遺傳距離構(gòu)建遺傳關(guān)系聚類圖。
由圖3-a所示PCoA圖可見,除寧夏產(chǎn)區(qū)枸杞樣本在第一主成分上主要分布在第一和第四象限外,其他所有樣本分區(qū)不明顯,6個居群的樣本間存在大量重疊,沒有形成明顯的分離群體。類似地,根據(jù)遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖(圖3-b)中,各栽培生產(chǎn)區(qū)域的52份枸杞參試樣本沒有明顯的區(qū)域趨勢和特征,地理距離較近的居群沒有優(yōu)先聚在一起,而是分布在整個聚類圖中。還可發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地的同一品種,如寧杞1號、寧杞5號、寧杞7號等,也沒有聚為一簇,而是分散在整個聚類結(jié)果中。同時(shí),同一聚類分支中的材料品種和地域分布規(guī)律性不明顯,有來自于同一地區(qū)的,也有來自于不同區(qū)域的,有相同品種,也有不同品種,由此形成了相對復(fù)雜的遺傳關(guān)系。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了前述遺傳多樣性和遺傳分化的結(jié)果,在一定程度上反映出各產(chǎn)地間枸杞居群存在頻繁的基因交流,不同栽培產(chǎn)區(qū)居群間的地理隔離和遺傳分化不明顯,導(dǎo)致各地枸杞樣本間均質(zhì)化程度較為嚴(yán)重,存在明顯的種質(zhì)混雜現(xiàn)象。
根據(jù)在線軟件Structure Harvester的計(jì)算結(jié)果,當(dāng)=6時(shí),Δ值最低(Δ=0),此時(shí)居群劃分結(jié)果符合本研究的枸杞居群實(shí)際分布情況。Δ值達(dá)到最大時(shí),對應(yīng)的模擬最優(yōu)群體數(shù)=7,表明本研究中來自不同栽培生產(chǎn)區(qū)域的52個枸杞個體DNA樣本按照基因型可以分為7種類型,因此在=7的模式下分析所有枸杞樣本的群體遺傳結(jié)構(gòu)。從圖4-a可以看出,所有參試枸杞樣本沒有按照地理居群形成明顯的分區(qū),不同基因型在各栽培產(chǎn)區(qū)居群中均有分布,資源雜合度較高。各產(chǎn)區(qū)均有一定數(shù)量的單一基因型樣本,其中青海德令哈居群單一基因型的比例較高。當(dāng)按照基因型進(jìn)行分類時(shí)(圖4-b),相似的遺傳結(jié)構(gòu)類別不具有明顯的地理居群特征,各產(chǎn)區(qū)樣本在不同遺傳結(jié)構(gòu)類別中均有分布,同時(shí)相同的品種也沒有集中排列在遺傳結(jié)構(gòu)相似的類別中。
表6 成對的不同栽培生產(chǎn)區(qū)域枸杞居群間的遺傳相似性和遺傳距離
Table 6 Pairwise genetic identity values and genetic distance among different populations of L. chinense
產(chǎn)地寧夏銀川新疆精河甘肅玉門甘肅靖遠(yuǎn)青海德令哈內(nèi)蒙古巴彥淖爾 寧夏銀川****0.887 20.832 30.853 70.850 60.872 0 新疆精河0.119 7****0.841 50.868 90.835 40.887 2 甘肅玉門0.183 50.172 6****0.881 10.872 00.862 8 甘肅靖遠(yuǎn)0.158 20.140 50.126 6****0.868 90.890 2 青海德令哈0.161 80.179 90.137 00.140 5****0.844 5 內(nèi)蒙古巴彥淖爾0.137 00.119 70.147 60.116 30.169 0****
Nei’s遺傳相似性(上三角)和遺傳距離(下三角)
Nei’s genetic identity(above diagonal) and genetic distance (below diagonal)
圖3 不同栽培生產(chǎn)區(qū)域枸杞樣本間PCoA模型得分散點(diǎn)圖(a)和聚類圖(b)
圖4 按照產(chǎn)區(qū)排列(a) 和按照遺傳結(jié)構(gòu)相似性排列(b)對不同栽培生產(chǎn)區(qū)域枸杞樣本遺傳結(jié)構(gòu)分析
為了解居群遺傳距離和實(shí)際地理距離間是否存在相關(guān)性,進(jìn)行群體配對遺傳分化和地理距離的Mantel分析(圖5)。結(jié)果顯示相關(guān)系為=?0.131(=0.270),表明我國各產(chǎn)區(qū)枸杞居群間遺傳距離與地理距離沒有顯著的相關(guān)性,地理距離在枸杞遺傳分化中的作用不明顯,說明居群間基因交流充分,尚未形成明顯的離群群體。
圖5 不同栽培生產(chǎn)區(qū)域枸杞居群間遺傳距離與地理距離相關(guān)性
枸杞在我國有著悠久的應(yīng)用歷史。早在兩千多年前,《小雅·北山》中就有“陟彼北山,言采其杞”的記載?!吧癫萑缗钍啦恢?,壁間墻角自離離?!币吧坭阶郧貪h起開始在民間移植栽種,唐代《千金翼方》中已系統(tǒng)記載了寧夏枸杞的栽培方法[19-20]。寧夏回族自治區(qū)是寧夏枸杞的道地產(chǎn)區(qū),所產(chǎn)枸杞子品質(zhì)上乘,作用廣泛而溫和,符合“治未病”的健康新模式,不但作為常用大宗藥材在臨床上發(fā)揮重要作用,在民間也有具有極高的認(rèn)同感和接受度。近年來,隨著枸杞子消費(fèi)市場的持續(xù)擴(kuò)大,我國枸杞栽培地域和面積擴(kuò)展迅速,在我國寧夏、內(nèi)蒙、甘肅、青海及新疆等已建成大規(guī)模枸杞規(guī)范化種植基地,為枸杞的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了良好的生產(chǎn)環(huán)境,緩解了枸杞子供應(yīng)的市場壓力,也成為各地發(fā)展高效農(nóng)業(yè)和精準(zhǔn)扶貧的重要抓手。然而,為滿足終端市場對于枸杞子高產(chǎn)、形優(yōu)等經(jīng)濟(jì)性狀需求而進(jìn)行的人工定向選育,使栽培枸杞的遺傳多樣性逐步下降,如我國各產(chǎn)區(qū)枸杞主流栽培品種均以寧杞5號和寧杞7號為主。同時(shí),枸杞是風(fēng)媒和蟲媒同株異序或異株授粉植物,其種子主要依靠鳥類和嚙齒類動物傳播,使處于較遠(yuǎn)地理距離的不同居群間保持合理的基因流動,提高居群間遺傳多樣性,從而促使群內(nèi)個體發(fā)展出更強(qiáng)的適應(yīng)能力,同時(shí)也為創(chuàng)新育種提供更加充裕的資源。然而,發(fā)達(dá)便利的現(xiàn)代化交通運(yùn)輸,極大地弱化了地理距離帶來的阻隔效應(yīng),促進(jìn)了各栽培生產(chǎn)區(qū)域間枸杞種質(zhì)的頻繁交流,人為加大了基因流并引起居群內(nèi)和居群間的種質(zhì)混雜和均質(zhì)化。此外,枸杞植株壽命長、自然更新緩慢,加之現(xiàn)代化枸杞種植產(chǎn)業(yè)精耕細(xì)作,減輕了枸杞野外自然生長環(huán)境中的多種逆境脅迫效應(yīng),在一定程度上降低了枸杞的遺傳多樣性。
較低的遺傳多樣性一方面利于保持藥材基原和品質(zhì),但另一方面也會由于種質(zhì)退化而導(dǎo)致耐逆性和穩(wěn)定性逐漸減弱,不利于物種的延續(xù)和進(jìn)化。因此,為積累豐富的枸杞遺傳多樣性種質(zhì)資源,發(fā)揮其多方面的潛在優(yōu)勢,在開展枸杞人工種植擴(kuò)大資源產(chǎn)量、保證供給的同時(shí),加強(qiáng)種質(zhì)資源保護(hù),根據(jù)枸杞生長發(fā)育規(guī)律和對生長環(huán)境條件的要求,模擬原始生態(tài)環(huán)境進(jìn)行擬態(tài)種植,保障種植枸杞與原產(chǎn)道地枸杞藥效相當(dāng),是推動我國枸杞產(chǎn)業(yè)可持續(xù)和高質(zhì)量發(fā)展的必經(jīng)之路。
本研究采用熒光標(biāo)記輔助AFLP技術(shù),篩選出10對選擴(kuò)引物,對來自我國6個枸杞栽培生產(chǎn)區(qū)域的52份枸杞材料進(jìn)行選擇性擴(kuò)增得到328條擴(kuò)增條帶,并根據(jù)擴(kuò)增條帶多態(tài)性結(jié)果判斷各DNA樣本之間的遺傳多樣性。結(jié)果顯示,我國不同生產(chǎn)栽培區(qū)域的枸杞居群間存在頻繁的基因流,各樣本遺傳多樣性較低,存在較高的遺傳均質(zhì)化現(xiàn)象。本研究結(jié)果與余意等[18]通過微衛(wèi)星序列進(jìn)行的我國栽培枸杞遺傳多樣性結(jié)果一致。相反的,唐燕等[14]、李彥龍等[15]分別通過表型分析和AFLP進(jìn)行的研究則表明我國枸杞具有較為豐富的遺傳多樣性,得到與本研究相反的結(jié)論,這種差異可能是由于使用的分子標(biāo)記及樣本采集差異造成的。
本研究供試樣本同期進(jìn)行了基于甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)(methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)的基因組DNA甲基化水平和模式多樣性的差異分析,發(fā)現(xiàn)不同栽培生產(chǎn)區(qū)域所有樣本中非甲基化敏感性位點(diǎn)展示出較低的遺傳多樣性,這與本研究結(jié)果相一致。與此形成鮮明對比的是,甲基化敏感性位點(diǎn)表現(xiàn)出較高的表觀遺傳多樣性和產(chǎn)地內(nèi)部方差,說明在遺傳背景相對穩(wěn)定的條件下,枸杞基因組發(fā)生了較為豐富的表觀遺傳變異。主成分分析和聚類分析發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地枸杞的表觀遺傳特性各不相同,存在明顯的地域相關(guān)性,并受到溫度、降水量和土壤酸堿度等生態(tài)因子的調(diào)控[21]。因此推測,遺傳背景一致的枸杞經(jīng)引種栽培至其他生態(tài)產(chǎn)區(qū)后,通過改變自身DNA甲基化模式及水平,并調(diào)控下游相關(guān)蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物的表達(dá),以提高自身對于不同環(huán)境的適應(yīng)能力,可能是枸杞在不同生態(tài)環(huán)境下適應(yīng)能力的內(nèi)在驅(qū)動力。
作為一種較為成熟的群體遺傳學(xué)分子檢測手段,AFLP技術(shù)要求足夠數(shù)量的分析樣本,以保證結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。本研究中,受采樣規(guī)模限制,僅分析了我國6個枸杞主要栽培生產(chǎn)區(qū)域的52份枸杞DNA樣本,且均采集自人工種植基地,缺少野生枸杞樣本。因此,后續(xù)還需要對我國枸杞資源分布情況進(jìn)行深度調(diào)查,擴(kuò)大樣本收集范圍,并結(jié)合形態(tài)性狀學(xué)、內(nèi)源性代謝成分分析、表觀遺傳學(xué)及其他類型分子標(biāo)記,以獲得更加全面、準(zhǔn)確的我國枸杞種質(zhì)資源遺傳多樣性研究全景圖。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
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Genetic diversity analysis ofsamples from different cultivation areas based on AFLP molecular markers
ZHANG Fang1, LU Rui-hua1, FU Huan-zhe1, ZHANG Wen-hua2, LI Zhong2, REN Gang3, CHEN Zhan-ping3, ZHAO Yu-ling4, GUO Sheng1, QIAN Da-wei1, DUANJin-ao1
1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing 210023, China 2. Bairuiyuan Gouqi Co., Ltd., Yinchuan 750200, China 3. Haixi Agricultural Science Research Institute of Mongolian and Tibetan Autonomus Prefecture, Delingha 817000, China 4. Jinghe Gouqi Industry Development Center of Bortala Mongolian Autonomous Prefecture, Bortala 833399, China
The genetic diversity of 52samples from six cultivation areas in China was analyzed at the genomic DNA level by using the fluorescence assisted amplified fragment length polymorphism (AFLP) technique.After the successive steps of enzyme digestion, ligation, pre-amplification and selective amplification of the extracted DNA samples, the PCR products were separated by capillary electrophoresis system. The collected data were then analyzed by Popgene software to calculate the genetic diversity parameters, GenAlex software was used to calculate genetic distances and perform principal coordinate analysis, cluster analysis based on genetic distance was performed using MEGA-X software and population genetic structure analysis was performed using Structure software.A total of ten pairs of selective amplification primers were screened, and 328 amplified fragments were amplified, including 121 polymorphic fragments, which were unevenly distributed amongpopulations from different habitats. The genetic diversity ofin different habitats was relatively low. The allele numberN, effective allele numberN,observed heterozygosity, and Shannon information indexwere 1.438 0, 1.231 6, 0.140 7 and 0.215 2, respectively. Nei’s genetic consistency ranged from 0.835 4 to 0.890 2. There were frequent gene exchanges among populations ofin different cultivation and production areas.There were relatively frequent gene exchanges betweenpopulations in different cultivation and production areas, and the degree of genetic differentiation was moderate, and the genetic variation within populations was the main source of genetic variation of. Furthermore, no significant correlation between genetic distance and geographical distance was observed. This study will provide scientific basis for the accumulation of genetic background information, introduction and cultivation, protection of germplasm resources, construction of core germplasm bank and formulation and management of sustainable development strategy of.
L.; amplified fragment length polymorphism; germplasm resources; genetic diversity; cultivation areas
R286.2
A
0253 - 2670(2023)18 - 6074 - 10
10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.025
2023-02-03
國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81773837);江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心重點(diǎn)項(xiàng)目(ZDXM-2020-02,ZDXM-2022-36);國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(ZYYCXTD-D-202005);中央本級重大增減支項(xiàng)目(2060302);寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2022AAC03215)
張 芳,博士,副教授,研究方向?yàn)橹兴幧锛夹g(shù)。Tel: (025)85811516 E-mail: fangzhang@njucm.edu.cn
段金廒,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)橹兴庂Y源化學(xué)與資源循環(huán)利用。Tel: (025)85811917 E-mail: dja@njucm.edu.cn
[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]