郝妍 白相宇 霍峰 陳喜波

口腔癌是我國常見惡性腫瘤,發(fā)病率逐年遞增,其具有侵襲性,預(yù)后較差的特點,5年生存率僅45%左右[1,2]?；蛐蛄懈淖兪窃斐砂┌Y的發(fā)生發(fā)展的重要因素,但基因的表觀遺傳變化在腫瘤中也發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[3]。研究發(fā)現(xiàn),口腔癌中某些關(guān)鍵抑癌基因的甲基化修飾可影響基因表達,進而調(diào)控口腔癌的生物學(xué)功能,最終影響患者的預(yù)后[4,5]。SOX7在口腔鱗癌中可以發(fā)生甲基化修飾,且具有一定特異性,但其作為分子診斷的敏感度相對較低[6]。因此,探討口腔癌SOX7基因甲基化修飾上游分子至關(guān)重要。SETDBl是組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶家族中重要一員,參與多種基因的甲基化修飾,并與多種腫瘤密切相關(guān)[7,8]。SETDBl可催化基因的甲基化,但其作為甲基化轉(zhuǎn)移酶對SOX7的甲基化修飾作用尚不明確。本研究中通過檢測口腔癌中SOX7基因的甲基化水平、SETDBl的表達,分析SETDBl表達與SOX7基因甲基化的相關(guān)性,探討口腔癌的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本與細胞 取口腔外科手術(shù)治療的口腔鱗癌患者癌組織及癌旁組織各52例。納入研究的患者均無其他腫瘤病史,手術(shù)前均無任何治療史。52例患者中,男39例,女13例;≥60歲35例,<60歲17例;TNM分期:I期17例,Ⅱ期22例,Ⅲ期13例;高分化11例,中分化32例,低分化9例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例?？谇话㎏B細胞購自南京科佰生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 甲基化試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司;DNA提取試劑購于深圳市益百順科技有限公司;SETDBl單克隆抗體購于中國Abeam公司;免疫組化SP試劑盒和濃縮型DAB試劑均購自廣州威佳科技有限公司;RNA引物由南京聚雄華生物科技有限公司設(shè)計合成。

1.3 方法

1.3.1 焦磷酸測序:對癌組織和癌旁組織提取DNA并進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化,將DNA擴增產(chǎn)物進行焦磷酸測序,PyroQ-CpG軟件分析位點甲基化狀態(tài),計算甲基化率。甲基化引物序列:F,5’-GTTTTGGACGTCGAGTTGTC-3’R,5’-AACCCAAACCATAAAAACGTT-3’。PCR反應(yīng)條件:95℃,預(yù)變性10 min,1個循環(huán);94℃,變性,45 s,退火45 s,72℃,延伸45 s,共35個循環(huán);72℃再延伸10 min。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法:組織切片脫蠟,高溫修復(fù)抗原。山羊血清封閉,加入一抗過夜(SETDB1抗體,1∶1 000;SOX7抗體,1∶1 000)。次日二抗孵育,DBA顯色,蘇木素復(fù)染。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR):提取RNA,應(yīng)用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄。熒光定量試劑盒檢測目的基因mRNA。

1.3.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:細胞常規(guī)培養(yǎng)口腔癌KB細胞,以轉(zhuǎn)染siRNA SETDBl細胞為實驗組(si-SET),轉(zhuǎn)染無siRNA細胞為陰性對照組(si-N),正常細胞為空白對照組(NC)。細胞懸液計數(shù),接種到6孔板。用30 μl 1×riboFECT CP Buffer(V1)稀釋1.25 μl 20 μmol/L siRNA儲存液(V2),輕輕混勻,室溫孵育;加入3 μl riboFECT CP Reagent(V3),混勻孵育;將riboFECT CP混合液加入到465.75 μl細胞培養(yǎng)基(V4)中,使總體積達到500 μl,混勻;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后以熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.3.5 Western Blot:提取總蛋白,測定濃度,制備電泳蛋白上樣液,行凝膠電泳。電泳后,轉(zhuǎn)膜。加一抗4℃過夜。次日孵育二抗,重復(fù)洗膜后顯影。

2 結(jié)果

2.1 口腔癌和癌旁組織中SOX7甲基化水平 口腔癌組織和癌旁組織中,SOX7基因甲基化率分別為(62.34±2.14)%和(11.41±1.87)%,二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 口腔癌和癌旁組織中SOX7甲基化率 %,

2.2 口腔癌和癌旁組織中SOX7和SETDB1mRNA相對表達量 口腔癌組織中SOX7 mRNA相對表達量為低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。癌組織中SETDB1 mRNA相對表達量高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 口腔癌和癌旁組織中SOX7和SETDB1 mRNA相對表達量

2.3 口腔癌和癌旁組織中SOX7和SETDB1蛋白表達量 癌組織SOX7蛋白陽性表達率低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。癌組織SETDB1蛋白陽性表達率高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2,表3。

圖1 口腔癌和癌旁組織中SOX7和SETDB1蛋白表達(HE ×200);CT 癌組織,PT 癌旁組織

圖2 口腔癌和癌旁組織中SETDB1和SOX7蛋白表達量(Western Blot);CT 癌組織;PT 癌旁組織

表3 口腔癌和癌旁組織中SOX7和SETDB1蛋白表達量 %,

2.4 口腔癌組織中SOX7甲基化和SETDB1的相關(guān)性 SOX7甲基化和SETDB1表達,呈正相關(guān)(r=0.324,P<0.05)。見表4。

表4 癌組織中SOX7甲基化與SETDB1表達的相關(guān)性 例

2.5 口腔癌組織中SOX7甲基化及SETDB1與臨床病理特征的相關(guān)性 SOX7甲基化與口腔癌TNM分期、組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),與性別和年齡無關(guān)(P>0.05)。SETDB1陽性表達與TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 口腔癌組織中SOX7甲基化、SETDB1與臨床病例特點的關(guān)系

2.6 RNA干擾下調(diào)SETDB1后KB細胞中SETDB1和SOX7的表達 Rt-qPCR和Wesrern Blot結(jié)果顯示,si-SET、si-N和NC組中,以si-SET組SETDB1 mRNA和蛋白表達最低,而si-N和NC組SETDB1 mRNA和蛋白表達無差異。SETDB1 si-RNA干擾在KB細胞中成功。si-SET組SOX7 mRNA和蛋白表達最高,明顯高于si-N和NC組,而si-N和NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3～5,表6,7。

明視野 熒光顯微鏡 明視野與熒光顯微鏡的疊加

圖4 RNA干擾SETDB1轉(zhuǎn)染KB細胞后SETDB1蛋白表達量;Si-SET SETDB1 si-RNA組,Si-N 陰性對照組,NC 空白對照組

圖5 RRNA干擾SETDB1轉(zhuǎn)染KB細胞后SOX7蛋白表達量;Si-SET SETDB1 si-RNA組;Si-N 陰性對照組;NC 空白對照組

表6 RNA干擾SETDB1轉(zhuǎn)染KB細胞后SETDB1 mRNA相對表達量 %,

表7 RNA干擾SETDB1轉(zhuǎn)染KB細胞后SOX7 mRNA相對表達量

2.7 Si-RNA干擾 SETDB1對口腔癌KB細胞SOX7甲基化的影響 焦磷酸測序檢測結(jié)果顯示,si-SET組SOX7甲基化水平最低(P<0.05),而si-N和NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示抑制甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1的表達可以明顯降低KB細胞中SOX7甲基化水平。見表8。

表8 干擾SETDB1后3組細胞內(nèi)SOX7甲基化率 %,

3 討論

口腔癌是是全世界范圍內(nèi)高發(fā)癌癥,也是我國一種常見的頭頸部惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率逐年增加,嚴重影響人民群眾的生命健康[9,10]。針對口腔癌的綜合治療使得患者整體生存期有所提高,但預(yù)后仍然較差[11]。因此,從基因分子水平探究口腔癌發(fā)病機制,為口腔癌的早期診斷和治療提供新的靶點成為本領(lǐng)域研究的首要任務(wù)。

現(xiàn)代分子生物學(xué)研究顯示,表觀遺傳學(xué)重點甲基化修飾幾乎存在于所有的腫瘤細胞內(nèi),該變化參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。人體細胞內(nèi)基因異常的甲基化修飾使多種腫瘤基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達異常,最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、惡化[13,14]。SOX7是編碼轉(zhuǎn)錄因子SOX基因家族中的重要一員,參與多種生命體活動。SOX7在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達狀態(tài),與前列腺癌和膀胱癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[15,16]。進一步研究表明,SOX7基因在肝癌和肺癌中呈高甲基化狀態(tài),且甲基化與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17,18]。

本研究通過檢測口腔癌組織中SOX7甲基化進行分析,結(jié)果表明SOX7基因在口腔癌組織中發(fā)生了甲基化,且其甲基化率明顯高于癌旁組織。口腔癌組織中SOX7的高甲基化狀態(tài)與腫瘤的TNM分期、分化以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性;結(jié)果說明SOX7基因的高甲基化可能與口腔癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進一步檢測SOX7的表達水平發(fā)現(xiàn),癌組織中SOX7 mRNA和蛋白的表達水平顯著下降,提示SOX7可能因其發(fā)生甲基化而抑制了基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達。筆者推測,SOX7可能在口腔癌組織中扮演了“抑癌因子”的角色,其高甲基化狀態(tài)使其基因表達抑制或缺失,進而促進了口腔癌的進展。

甲基轉(zhuǎn)移酶的參與癌基因的甲基化修飾,且其動態(tài)變化對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起了至關(guān)重要的作用[19]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),多種甲基轉(zhuǎn)移酶家族中蛋白質(zhì)在腫瘤中呈現(xiàn)高表達,與腫瘤關(guān)系密切[20,21]。研究顯示,甲基轉(zhuǎn)移酶的異常表達與其甲基化異常有關(guān),參與了多種腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[22,23]。

SETDB1是一種重要的甲基化轉(zhuǎn)移酶,參與多種腫瘤的發(fā)生[24]。本研究結(jié)果顯示,口腔癌組織中SETDB1 mRNA和蛋白的表達均顯著明顯升高,且其陽性表達與口腔癌的分期、癌分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。隨著腫瘤分期的增加、腫瘤分化的降低,SETDB1表達量上升;且SETDB1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織。這提示SETDB1可能增強了口腔癌細胞的增殖侵襲能力,進而使口腔癌的惡性程度增強。

研究證實,聯(lián)合降低多種甲基化轉(zhuǎn)移酶可使腫瘤細胞的整體基因甲基化率明顯下降,并促進多種癌癥的發(fā)生[25]。目前國內(nèi)外研究中,SETDB1作為一種甲基化酶是否參與SOX7甲基化的修飾尚未見相關(guān)研究。本研究統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,口腔癌組織中SOX7高甲基化與SETDB1的陽性表達具有相關(guān)性,二者呈正相關(guān)。提示SETDB1作為甲基化轉(zhuǎn)移酶參與了SOX7基因的甲基化,可能促進了口腔癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,SETDB1可能是促進SOX7基因發(fā)生甲基化的一個重要上游分子。體外實驗結(jié)果顯示,SETDB1表達下調(diào)后SOX7基因發(fā)生了去甲基化,且SOX7 mRNA和蛋白表達均顯著上升。這提示抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1的表達可以降低SOX7基因甲基化率,促進SOX7的表達,進而發(fā)揮其促癌作用。同時也說明,在口腔癌中SETDB1可以作為甲基化轉(zhuǎn)移酶催化SOX7發(fā)生甲基化修飾。

綜上所述,在口腔癌中甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1與SOX7甲基化修飾密切相關(guān),SETDB1的高表達促進了SOX7高甲基化狀態(tài),二者可能是促進口腔癌發(fā)生發(fā)展的重要分子學(xué)生物事件。