王 瀅，胡偉武，陳 男，馮傳平

(中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(北京)水資源與環(huán)境學(xué)院，地下水循環(huán)與環(huán)境演變教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

0 引 言

據(jù)2020年城鄉(xiāng)建設(shè)統(tǒng)計(jì)年鑒顯示，我國(guó)各省市對(duì)生活污水進(jìn)行處理的建制鎮(zhèn)占總量的65.4%，但進(jìn)行處理的村鎮(zhèn)在總村鎮(zhèn)中占比較低，全國(guó)平均值僅35%[1]。當(dāng)前，農(nóng)村地區(qū)生活污水的隨意排放對(duì)水環(huán)境質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅，污水中的氮磷極易導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化、河道黑臭等[2-3]。因此，對(duì)農(nóng)村生活污水的治理成為改善村鎮(zhèn)水環(huán)境質(zhì)量的關(guān)鍵。相比城市生活污水，村鎮(zhèn)污水排放總量低且在時(shí)間和空間上分散，宜采用建設(shè)成本低，維護(hù)管理簡(jiǎn)單的就地處理技術(shù)，在土地資源豐富的村鎮(zhèn)地區(qū)，土壤滲濾技術(shù)具有很大的應(yīng)用潛力[4]。該系統(tǒng)能充分發(fā)揮土壤自凈能力，依靠物理截留、化學(xué)沉淀與微生物轉(zhuǎn)化三重機(jī)制實(shí)現(xiàn)污染物的有效轉(zhuǎn)化去除[5]?；|(zhì)填料作為系統(tǒng)的核心，具有物理吸附截留與微生物載體的雙重作用，然而單一土壤長(zhǎng)期過(guò)水后易發(fā)生壓實(shí)而導(dǎo)致系統(tǒng)堵塞，使得凈化性能失效，必須向土壤中添加其他材料來(lái)維持系統(tǒng)長(zhǎng)期穩(wěn)定的滲透性；此外，為獲得較大水力負(fù)荷，系統(tǒng)通常不斷注入生活污水，基質(zhì)在飽和水流中通常是厭氧還原的，不利于硝化反應(yīng)進(jìn)行，導(dǎo)致氨氮去除率通常為60%～87%[6-7]。

為提高系統(tǒng)滲透性能與氨氮去除率，目前大多研究聚焦于人工曝氣、改變系統(tǒng)結(jié)構(gòu)或填料組成上[8-10]，曝氣雖能促進(jìn)有機(jī)物和氨氮去除[10]，但造成了大量能耗。據(jù)報(bào)道，人工濕地中低能耗增氧方式有潮汐流運(yùn)行和設(shè)置部分不飽和區(qū)[11]，如Zheng等[12]在模擬人工濕地(SCWs)中設(shè)置了恒定不飽和帶，測(cè)得不飽和區(qū)末端DO含量(5.03±0.54 mg·L-1)遠(yuǎn)高于飽和區(qū)，COD去除率穩(wěn)定在83%±5%，氨氮去除率約45%±10%，不飽和區(qū)有效補(bǔ)充了氧含量，是一種有前景的生態(tài)高效供氧方法。

因此，本研究考慮將土壤基質(zhì)與礦物填料混配來(lái)增加基質(zhì)的孔隙率和滲透性能，結(jié)合不飽和流運(yùn)行來(lái)強(qiáng)化自然復(fù)氧。由于土壤中摻砂比例不同時(shí)，系統(tǒng)孔隙率存在差異，這勢(shì)必會(huì)影響土體內(nèi)氧環(huán)境，而對(duì)好氧-厭氧環(huán)境的控制是實(shí)現(xiàn)污染物在不同空間高效去除的關(guān)鍵，有必要闡明摻砂比例對(duì)氮、磷污染物轉(zhuǎn)化以及相關(guān)酶活性的影響，揭示不同摻砂比下微生物的群落結(jié)構(gòu)與功能，得出適宜硝化與反硝化作用的摻砂比。預(yù)期成果將為提升華北棕壤區(qū)土壤滲濾系統(tǒng)凈化效率、提高系統(tǒng)生物多樣性與穩(wěn)定性，以及組建和優(yōu)化模塊化土壤滲濾基質(zhì)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

如圖1，實(shí)驗(yàn)裝置為4個(gè)內(nèi)徑4 cm、高30 cm的有機(jī)玻璃柱，柱由下而上填充，承托層為2 cm厚的石英砂，填料層高度20 cm，S0填充綠沸石，S30、S50和S70中填充均勻混合填料，S30中土壤:石英砂:火山巖=30%:60%:10%(質(zhì)量比，下同)，S50中土壤:石英砂:火山巖=50%:40%:10%，S70中土壤:石英砂:火山巖=70%:20%:10%。通過(guò)排水法得4個(gè)柱孔隙率依次約為0.51、0.48、0.43和0.41，布水層為2 cm厚的石英砂。土壤取自中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(北京)校內(nèi)花園表層，為典型砂質(zhì)棕壤土，去除雜質(zhì)自然風(fēng)干后過(guò)2 mm篩備用，沸石、石英砂與火山巖購(gòu)自河南省鞏義市凈水材料有限公司，粒徑均為1～3 mm?；|(zhì)裝填完成后，先用去離子水沖洗多次，使得出水氨氮濃度低于檢出限，4個(gè)滲濾柱均不添加活性污泥。

圖1 滲濾實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram for the percolation experimental device

1.2 實(shí)驗(yàn)用水

模擬污水參照《華北地區(qū)農(nóng)村生活污水處理技術(shù)指南2010》(試行)中推薦的參考值配制：COD、NH4+-N、TN和TP質(zhì)量濃度分別為350、40、50、5 mg·L-1左右，具體為向自來(lái)水中加入0.328 g·L-1C6H12O6、0.1528 g·L-1NH4Cl、0.022 g·L-1KH2PO4和0.022 g·L-1CO(NH2)2。

1.3 運(yùn)行方法

模擬污水經(jīng)蠕動(dòng)泵提升到頂部后滴濾進(jìn)水，為增強(qiáng)布水均勻性，在填料表面鋪一層親水濾紙并定期更換。實(shí)驗(yàn)在(25±3.5)℃進(jìn)行，階段一：1～40 d，每天進(jìn)水6 h，進(jìn)水量5.23 mL·h-1，水力負(fù)荷0.025 m3·m-2·d-1；階段二：40～70 d，每天進(jìn)水6 h，進(jìn)水量13.08 mL·h-1，水力負(fù)荷0.0625 m3·m-2·d-1；階段三：70～96 d，每天進(jìn)水24 h，進(jìn)水量為5.23 mL·h-1，水力負(fù)荷為0.1 m3·m-2·d-1，每2～3 d分別取2次進(jìn)出水樣品。

1.4 分析方法

土壤酶活性及微生物群落結(jié)構(gòu)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取4個(gè)柱內(nèi)頂層(0～5 cm)、中層(9～13 cm)與底層(16～20 cm)填料各2份，一份室溫自然風(fēng)干，采用索萊寶土壤系列試劑盒分析土壤脲酶(S-UE)、堿性磷酸酶(S-AKP/ALP)、蛋白酶(S-ALPT)以及中性轉(zhuǎn)化酶(S-NI)活性(S0除外)。一份充分混勻后于-20 ℃冰箱中冷凍保存至分析，樣品基因組DNA按照 FastDNA?SPIN試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，并利用Nanodrop分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA濃度進(jìn)行檢驗(yàn)，對(duì)16S rRNA基因V3—V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，高通量測(cè)序分析由美吉生物公司完成，測(cè)序平臺(tái)為 Illumina MiSeq。

統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單變量方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 污染物去除性能

圖2 NH4+-N去除性能與去除率Fig.2 NH4+-N removal performance and removal efficiency

圖3 不同運(yùn)行階段與質(zhì)量濃度變化Fig.3 Changes of (a)and (b)concentration in different operation stages

圖4為磷去除性能分析結(jié)果。階段一S0去除率均值僅59%，顯著低于含土壤的3組(84%～87%)(P<0.05)。階段二S0磷去除率降低到47%，顯著低于S50與S70(P<0.05)。階段三S0、S30、S50的磷平均去除率在10%～50%之間，僅S70達(dá)到了70%。相比于沸石，土壤對(duì)磷的去除性能優(yōu)異，因此增大摻砂比會(huì)降低磷去除率，需要在后續(xù)階段補(bǔ)充高效除磷材料。此外，實(shí)驗(yàn)中所有系統(tǒng)對(duì)磷的去除波動(dòng)較大，這可能是由于非飽和流態(tài)下，填料未與磷酸鹽充分接觸[18]。階段三的磷去除率均逐漸降低甚至溶出與祁娜[19]研究中未見(jiàn)磷吸附達(dá)到飽和存在差異。為此，評(píng)估了4個(gè)系統(tǒng)的磷酸鹽平均吸附量(假設(shè)磷酸鹽僅通過(guò)吸附去除，溶出時(shí)即達(dá)到吸附飽和)，S0為47 mg·kg-1(沸石)，S30、S50和S70分別為178.8、123.5、117.8 mg·kg-1(土壤)，而祁娜[19]研究中沸石理論最大吸附量為880 mg·kg-1，顯著高于本研究；土壤理論最大吸附量為 200 mg·kg-1，略高于本研究。因此，本研究后期磷去除率降低與棕壤土的磷飽和吸附量低有關(guān)，并且由于本研究實(shí)驗(yàn)裝置尺寸也較小，柱內(nèi)土壤添加量低，使得Ca、Fe、Al等有效除磷物質(zhì)在較短時(shí)間內(nèi)就達(dá)到了飽和。

圖4 出水磷酸鹽質(zhì)量濃度(a)和磷酸鹽去除率(b)(負(fù)值表示磷酸鹽的溶出)Fig.4 Phosphate concentration of effluent (a)and phosphate removal efficiency (b)(negative value indicates phosphate dissolution)

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 多樣性分析

在97%相似度下將測(cè)序所得序列聚類(lèi)為用于物種分類(lèi)的OTU，樣品的Coverage指數(shù)均在0.98以上。數(shù)據(jù)抽平后進(jìn)行Alpha多樣性分析，由表1知，與原始土壤相比，S30、S50與S70土壤樣品Sobs、ACE與Chao指數(shù)均增大，且三組指數(shù)值無(wú)顯著差異(P>0.05)，經(jīng)污水滲濾后，土壤群落豐富度均有提高。S0依靠填料自然掛膜，群落豐富度與多樣性均較低，表明填料表面存在優(yōu)勢(shì)微生物。與原始土壤相比，S30的Shannon指數(shù)下降，微生物多樣性降低，而S50與S70的Shannon指數(shù)增大，微生物多樣性增加，且S50最大，這可能與其含有更多適宜好氧厭氧微生物生活的微環(huán)境有關(guān)。

表1 Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index

2.2.2 細(xì)菌群落組成

通過(guò)主成分分析(PCA)和聚類(lèi)分析比較了不同摻砂比下的群落結(jié)構(gòu)差異(圖5(a)和(b))，PC1和PC2的解釋量分別為41.99%和22.05%。初始土壤與S0分別單獨(dú)為一簇，S30、S50與S70聚為一簇，摻砂比對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響不大。聚類(lèi)分析也表明有無(wú)污水滲流是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的因素，且S0自然掛膜形成細(xì)菌群落與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)明顯不同。4個(gè)柱的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteriota)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteriota)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)，占所有細(xì)菌豐度的82%～91%。經(jīng)污水作用后Proteobacteria、Bacteroidotas和Nitrospirota相對(duì)豐度較原始土壤有所增加，但Actinobacteriota相對(duì)豐度降低。Proteobacteria在S0、S30、S50和S70中相對(duì)豐度依次為65.1%、34.9%、27.0%和25.3%，該門(mén)微生物種類(lèi)多，是C、N、S等污染物轉(zhuǎn)化的主要參與者[20]。Liu等[21]利用沸石過(guò)濾器在高碳源濃度下脫氮時(shí)Proteobacteria相對(duì)豐度也超過(guò)了60%，與S0一致。Actinobacteriota大多為化能異養(yǎng)型細(xì)菌，固氮能力較強(qiáng)，可分泌大量胞外酶促進(jìn)有機(jī)物如含氮聚合物的分解，對(duì)反硝化作用不大[22-23]，在4個(gè)柱中相對(duì)豐度依次為14.6%、27.0%、28.0%和31.6%。Acidobacteriota在土壤環(huán)境中豐富多樣，可參與有機(jī)質(zhì)的代謝包括腐殖質(zhì)的分解，對(duì)環(huán)境中鐵的循環(huán)有一定作用[24-25]，相對(duì)豐度分別為1.9%、8.7%、12.4%和11.9%。Chloroflexi的大多數(shù)微生物可將多糖發(fā)酵成有機(jī)酸和氫，加快土壤有機(jī)物分解[26]，相對(duì)豐度分別為3.4%、9.4%、10.9%和11.9%。Bacteroidotas相對(duì)豐度依次為5.7%、3.8%、3.7%和2.7%，其在利用蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)方面發(fā)揮巨大作用，能夠降解DOM中高分子量部分，能夠進(jìn)行反硝化[27-28]。硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirota)豐度分別為1.79%、2.27%、2.40%和2.16%，負(fù)責(zé)硝化過(guò)程，在含有土壤基質(zhì)的3個(gè)系統(tǒng)中相對(duì)豐度較高，這主要由于硝化菌為自養(yǎng)菌，在S0的高有機(jī)碳環(huán)境中，與異養(yǎng)菌競(jìng)爭(zhēng)氧氣能力弱，生長(zhǎng)受到限制[29]。

圖6 細(xì)菌群落屬水平相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of bacterial community at genus level

Nakamurella能夠在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存大量糖類(lèi)聚合物[40]，豐度依次為1.1%、1.9%、3.0%和1.2%。鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)是一種好氧菌，能夠降解芳香化合物等復(fù)雜有機(jī)物[41]，豐度分別為5.06%、3.43%、2.28%和2.16%。此外，Microbacterium也是處理結(jié)構(gòu)復(fù)雜有機(jī)物方面具有突出的貢獻(xiàn)[37]，小月菌屬(Microlunatus)在治理磷污染方面呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)，為化能有機(jī)異養(yǎng)的嚴(yán)格好氧菌，是強(qiáng)化生物除磷(EBPR)過(guò)程中的主要聚磷微生物(PAO)之一[42]。微枝形桿菌屬(Microvirga)是根瘤菌中的一類(lèi)新種屬，與植物共生時(shí)能產(chǎn)生明顯的結(jié)瘤，即具有顯著的固氮活性[43]，Ensifer也具有固氮的功能[44]。

2.3 土壤酶活性分析

圖7為不同深度與碳氮磷轉(zhuǎn)化相關(guān)的土壤酶活性變化，S30表層脲酶活性最高，而S50脲酶活性隨深度增加而增大，S70脲酶活性與高度變化無(wú)明顯關(guān)系；蛋白酶活性與深度變化無(wú)明顯相關(guān)性，S30不同深度的活性均較低，S50表層與中層活性較高，而S70底層活性較高；對(duì)于磷酸酶活性，S30隨深度增加而增加，S50和S70卻隨深度增加而降低；轉(zhuǎn)化酶活性均隨深度增加而下降，在0～5 cm活性最高，這與進(jìn)水區(qū)富含有機(jī)質(zhì)有關(guān)。摻砂比對(duì)土壤酶活性影響不大，不同深度的污染物濃度變化可能是影響酶活性的直接因素。

圖7 不同高度處土壤酶活性Fig.7 Soil enzyme activity at different heights(a)脲酶; (b)堿性蛋白酶; (c)堿性磷酸酶; (d)中性轉(zhuǎn)化酶

土壤酶主要由土壤微生物(細(xì)菌和真菌)分泌而來(lái)，土壤細(xì)菌作為土壤酶的主要來(lái)源，可能與土壤酶活性存在相關(guān)關(guān)系。通過(guò)分析原始土壤、S30、S50和S70中部分優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與土壤酶活的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)(表2)，Enterobacteriaceae、Sphingomonas與轉(zhuǎn)化酶活性正相關(guān)，Microvirga、Arthrobacter、Nocardioides、Bacillus、MND1與脲酶活性正相關(guān)，與硝化作用有關(guān)的Nitrospira、Nitrosospira與蛋白酶活性正相關(guān)，而B(niǎo)acillus、MND1以及Xanthobacteraceae與磷酸酶活性正相關(guān)。但這些菌屬的相對(duì)豐度與土壤酶活性的相關(guān)性并不顯著，可能土壤酶活性與土壤細(xì)菌的關(guān)系是多元的，內(nèi)在原因還需要深入到每一類(lèi)細(xì)菌門(mén)的性質(zhì)和功能以及土壤酶活性本身的作用機(jī)制等方面的研究[45]。

表2 土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)科/屬與土壤酶活之間的相關(guān)關(guān)系Table 2 Correlation between dominant families/genera of soil bacteria and soil enzyme activities

2.4 菌群功能預(yù)測(cè)分析

為揭示摻砂比對(duì)系統(tǒng)好氧-缺氧環(huán)境影響，預(yù)測(cè)了菌群的氧需求表現(xiàn)型豐度，如圖8(a)所示。天然土壤中60%為好氧菌，污水滲濾后好氧菌豐度降低為50%左右，而S0自然富集的好氧菌豐度僅接近30%，兼性厭氧菌豐度高達(dá)52%，非曝氣情況下，礦物填料易富集兼性厭氧菌，而體系內(nèi)厭氧菌相對(duì)豐度S0(5%)低于S30、S50和S70(10%左右)，摻砂比越高，兼氧菌相對(duì)豐度越大。

圖8 細(xì)菌需氧性表型(a)和氮轉(zhuǎn)化有關(guān)功能基因豐度(b)預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of aerobic phenotype of bacteria (a)and functional genes related to nitrogen transformation (b)

如圖8(b)，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的6個(gè)功能基因模塊(M00175：固氮；M00528：硝化；M00529：反硝化；M00530：異化硝酸鹽還原；M00531：同化硝酸鹽還原；M00804：完全硝化)豐度進(jìn)行了預(yù)測(cè)[46]。整體上S30中與氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能基因豐度最高；S0中固氮、硝化與反硝化基因均較少，但同化與異化硝酸鹽還原基因較高。張進(jìn)等[47]對(duì)一株好養(yǎng)反硝化菌的研究中發(fā)現(xiàn)該菌的主要脫氮途徑為同化與異化還原。S50與S70中硝化功能基因豐度低于S30，這可能是受限于氧氣傳輸效率，而反硝化功能基因豐度仍低于S30主要是由于缺乏有機(jī)物提供電子供體。

3 結(jié) 論

(1)0.1 m3·m-2·d-1的水力負(fù)荷下，S0、S30、S50和S70出水NH4+-N質(zhì)量濃度分別為1.93±0.43、1.88±0.64、3.33±1.24和3.84±0.61 mg/L，磷去除率分別為14%、25%、38%和73%。土壤占比30%時(shí)，適宜構(gòu)建硝化模塊，占比50%及以上適宜構(gòu)建反硝化模塊，但需補(bǔ)充反硝化電子供體。

(2)經(jīng)污水滲濾后，表層土壤轉(zhuǎn)化酶活性均顯著高于中下層，成為有機(jī)物降解的“熱區(qū)”。Enterobacteriaceae、Sphingomonas與轉(zhuǎn)化酶活性正相關(guān)，Microvirga、Arthrobacter、Nocardioides、Bacillus、MND1與脲酶活性正相關(guān)。

(3)綠沸石去除氨氮受水力負(fù)荷影響最小，在自然掛膜過(guò)程中富集了unclassified_f_Enterobacteriaceae、Arthrobacter、Bacillus等同步硝化好氧反硝化菌。

(4)非飽和區(qū)土壤中好氧菌近50%，以固氮和有機(jī)物降解為主(Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi)，由于進(jìn)水中有機(jī)物優(yōu)先用于細(xì)菌生長(zhǎng)代謝，反硝化作用微弱。