劉會(huì)雪，牛立遠(yuǎn)，張佩佩，安江科，魏貫?zāi)?/p>

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）由多種因素導(dǎo)致胰酶的異常激活，引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死，以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征，是臨床上常見的急腹癥之一［1-2］。AP起病急、進(jìn)展快，若不積極治療，可能發(fā)展為重癥AP，危及病人生命。目前有關(guān)AP發(fā)病機(jī)制尚不清楚，研究與AP發(fā)生發(fā)展有關(guān)的細(xì)胞因子，可能有助于臨床AP發(fā)生的診斷和病情程度的評(píng)估，并采取措施以防止預(yù)后不良的發(fā)生。Toll樣受體（Toll like receptors，TLR）是一種1型跨膜蛋白質(zhì)，在先天性免疫系統(tǒng)中起重要作用，能夠識(shí)別侵入體內(nèi)的微生物，激活免疫細(xì)胞的應(yīng)答，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［3-4］。TLR2是TLR家族的重要組成，TLR2介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)異常，可引起炎性因子的釋放，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致免疫炎癥性疾病的發(fā)生［5］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non coding RNA，LncRNA）廣泛表達(dá)于真核生物體內(nèi)，核富集轉(zhuǎn)錄體1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）是一種未拼接的多腺苷酸化非編碼轉(zhuǎn)錄本，研究表明LncRNA NEAT1參與TLR2介導(dǎo)的炎性因子的表達(dá)［6］。有關(guān)LncRNA NEAT1、TLR2在AP中的表達(dá)目前還少有研究，本研究通過(guò)檢測(cè)AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平，探討二者在AP病人中的表達(dá)變化及臨床意義，以期為臨床上AP的病情評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2020年12月石家莊平安醫(yī)院收治的AP病人125例為AP組，男67例，女58例，年齡（49.16±10.83）歲，范圍為26～71歲。根據(jù)疾病嚴(yán)重程度分為輕癥AP（mild AP，MAP）56例、中重癥AP（moderate and severe AP，MSAP）40例和重癥AP（severe AP，SAP）29例。根據(jù)發(fā)病原因分為膽源性72例；非膽源性53例，其中高脂血癥16例，乙醇性7例，醫(yī)源性27例，原因不明3例。AP病人納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《急性胰腺炎診治指南（2014）》［7］中AP診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）發(fā)病24 h內(nèi)入院；（3）影像學(xué)檢查結(jié)果顯示胰腺炎癥改變。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在肺部感染、敗血癥等其他急性感染性疾?。唬?）合并免疫性疾病病人；（3）合并心肝腎功能不全者；（4）合并惡性腫瘤病人。同期選取該院健康體檢者130例為健康組，其中男71例，女59例，年齡（49.87±11.05）歲，范圍為25～73歲，健康組與AP組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。研究經(jīng)石家莊平安醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(guò)，倫理號(hào)：20170402。

根據(jù)急性生理學(xué)和慢性健康狀況評(píng)價(jià)Ⅱ（acute physiology andchronic health evaluation，APACHEⅡ）對(duì)AP病人進(jìn)行評(píng)分，并將病人分為輕癥組（APACHEⅡ評(píng)分＜8分，即MAP）56例，重癥組（APACHEⅡ評(píng)分≥8分，即MSAP和SAP）69例［8］。根據(jù)住院期間重癥組AP病人預(yù)后情況，將病人分為預(yù)后不良25例，預(yù)后良好44例。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑與儀器 總RNA提取試劑盒（DP433），天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（205311）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（208052），德國(guó)QIAGEN公司；TLR2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（EH0300），武漢菲恩生物科技有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96），美國(guó)BIO-RAD公司；超微量分光光度計(jì)（NanoDrop2000），酶標(biāo)儀（Multiskan FC），美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2.2 血液采集 AP病人于入院24 h內(nèi)，健康組于體檢當(dāng)日清晨采集空腹靜脈血3 mL，3 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至新離心管中，-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)血清LncRNA NEAT1表達(dá)水平 RNA提取試劑盒提取血清中RNA，并檢測(cè)RNA濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），之后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s；共40個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算血清中LncRNA NEAT1的相對(duì)表達(dá)量。LncRNA NEAT1、GAPDH引物序列見表1。

表1 qRT-PCR檢測(cè)血清LncRNA NEAT1表達(dá)水平引物序列

1.2.4 ELISA法檢測(cè)血清TLR2水平 ELISA試劑盒檢測(cè)血清TLR2水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)；Pearson相關(guān)性分析探索AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平相關(guān)性及二者與病人APACHEⅡ評(píng)分的關(guān)系；受試者操作特性曲線（ROC曲線）分析血清LncRNA NEAT1、TLR2對(duì)AP病人病情程度的評(píng)估價(jià)值，曲線下面積（AUC）比較行Z檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康組與AP組血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比較 與健康組比較，AP組血清LncRNA NEAT1、TLR2水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 健康組與AP組血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比較/

表2 健康組與AP組血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比較/

注：LncRNA為長(zhǎng)鏈非編碼RNA，TLR2為Toll樣受體2，AP為急性胰腺炎。

TLR2/（μg/L）0.59±0.24 6.43±1.05 61.76＜0.001組別健康組AP組t值P值例數(shù)130 125 LncRNA NEAT1 1.00±0.00 2.16±0.31 42.67＜0.001

2.2 不同嚴(yán)重程度AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比較 與輕癥組比較，重癥組AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 不同嚴(yán)重程度AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比較/

表3 不同嚴(yán)重程度AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比較/

注：LncRNA為長(zhǎng)鏈非編碼RNA，NEAT1為核富集轉(zhuǎn)錄體1，TLR2為Toll樣受體2。

TLR2/（μg/L）5.86±0.92 6.89±1.16 5.40＜0.001 A例數(shù)56 69組別輕癥組重癥組t值P值LncRNA NEAT1 1.98±0.27 2.31±0.33 5.95＜0.001

2.3 不同預(yù)后重癥AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比較 與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組重癥AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表4）。

表4 不同預(yù)后重癥AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比較/

表4 不同預(yù)后重癥AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平比較/

注：LncRNA為長(zhǎng)鏈非編碼RNA，NEAT1為核富集轉(zhuǎn)錄體1，TLR2為Toll樣受體2。

TLR2/（μg/L）6.45±1.02 7.12±1.24 2.42 0.018組別預(yù)后良好組預(yù)后不良組t值P值例數(shù)44 25 LncRNA NEAT1 2.14±0.27 2.43±0.36 3.79＜0.001

2.4 AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平的相關(guān)性 AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2呈正相關(guān)（r=0.65，P＜0.001）（圖1）。

圖1 急性胰腺炎（AP）病人血清長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）核富集轉(zhuǎn)錄體1（NEAT1）、Toll樣受體2（TLR2）水平的相關(guān)性

2.5 AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平與APACHEⅡ評(píng)分的關(guān)系 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明，AP病人血清LncRNA NEAT1、TLR2水平與病人APACHEⅡ評(píng)分均呈正相關(guān)（r=0.50、0.52，均P＜0.001）。

2.6 血清LncRNA NEAT1、TLR2對(duì)AP病人重癥的評(píng)估價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，血清LncRNA NEAT1水平預(yù)測(cè)AP病人重癥的AUC為0.73［95%CI：（0.64，0.82）］，靈敏度為68.1%，特異度為80.4%，截?cái)嘀禐?.17；TLR2預(yù)測(cè)AP病人重癥的AUC為0.75［95%CI：（0.67，0.84）］，靈敏度為62.3%，特異度為83.9%，截?cái)嘀禐?.39 μg/L；血清LncRNA NEAT1聯(lián)合TLR2水平預(yù)測(cè)AP病人重癥的AUC為0.88［95%CI：（0.82，0.94）］，靈敏度為84.1%，特異度為71.4%。血清LncRNA NEAT1聯(lián)合TLR2水平預(yù)測(cè)AP病人重癥的AUC明顯大于二者單獨(dú)預(yù)測(cè)（Z=2.74、2.40，P=0.006、0.016）。

3 討論

LncRNA是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，廣泛參與機(jī)體表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種生命活動(dòng)［9］。LncRNA NEAT1是從位于人類第11號(hào)染色體上多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病I型的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄而來(lái)，主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)［10］。LncRNA NEAT1被認(rèn)為是人體組織中各種炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，參與免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［11-12］。金曌等［13］研究表明LncRNA NEAT1在銀屑病病變皮膚組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，且與銀屑病嚴(yán)重程度和炎性因子的表達(dá)量有關(guān)。He等［14］研究表明NEAT1與膿毒癥的發(fā)病和嚴(yán)重程度有關(guān)，是膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物。Sheng等［15］研究槲皮素通過(guò)抑制LncRNA NEAT1的表達(dá)促進(jìn)miR-216b抑制的雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠AP。本研究表明AP病人血清LncRNA NEAT1表達(dá)顯著高于健康組，且重癥組AP病人顯著高于輕癥組病人，預(yù)后不良組顯著高于預(yù)后良好組，提示LncRNA NEAT1與AP的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。臨床上常用APACHEⅡ評(píng)分評(píng)估AP病人病情及預(yù)后，然而APACHEⅡ評(píng)分系統(tǒng)操作繁瑣，因此尋找方便、快捷、且具有較高靈敏度和特異度的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)AP病情評(píng)估具有重要意義。Pearson相關(guān)性分析顯示血清LncRNA NEAT1水平與AP病人APACHEⅡ評(píng)分呈正相關(guān)，提示LncRNA NEAT1可能是評(píng)估AP病人病情的生物標(biāo)志物。進(jìn)一步ROC曲線分析表明血清LncRNA NEAT1對(duì)AP病人重癥有一定的評(píng)估價(jià)值，截?cái)嘀禐?.17，提示當(dāng)臨床上檢測(cè)LncRNA NEAT1水平超過(guò)2.17時(shí)，病人可能為重癥AP，需密切關(guān)注病人情況，避免不良預(yù)后的發(fā)生。

AP發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞因子的過(guò)度釋放會(huì)刺激各種炎癥信號(hào)的激活和炎性因子的釋放，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的積聚和T細(xì)胞反應(yīng)的減弱，這會(huì)引起腺泡細(xì)胞損傷，而胰腺星狀細(xì)胞被激活為肌成纖維細(xì)胞樣表型和胰腺損傷［16-17］。TLR是一種模式識(shí)別受體，通過(guò)感知和識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）激活免疫信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，PAMP是微生物高度保守的結(jié)構(gòu)，TLRs在激活后發(fā)生二聚化，觸發(fā)核因子κB（NF-κB）等信號(hào)通路的激活，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生；另一方面，TLRs的激活能夠調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的成熟，誘導(dǎo)Th1和Th2細(xì)胞的增殖和分化［18］。TLR2是TLR家族重要一員，Ma等［19］研究表明TLR2與哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，敲除TLR2基因可能抑制NF-κB信號(hào)通路減輕哮喘小鼠模型氣道炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)與健康組比較，AP病人血清TLR2水平顯著升高，提示TLR2可能參與AP的發(fā)生，猜測(cè)可能與TLR2引起的炎癥信號(hào)通路的激活和炎性因子的釋放有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。研究還發(fā)現(xiàn)重癥組病人血清TLR2水平顯著高于輕癥組，且與病人APACHEⅡ評(píng)分呈正相關(guān)，與預(yù)后良好組重癥AP病人比較，預(yù)后不良組AP病人TLR2水平顯著升高，提示TLR2水平與AP病人嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果表明，TLR2對(duì)AP病人病情具有一定的評(píng)估價(jià)值，截?cái)嘀禐?.39 μg/L，提示臨床上通過(guò)檢測(cè)血清TLR2水平可能有助于AP疾病嚴(yán)重程度的判斷，病人血清TLR2水平超過(guò)6.39 μg/L時(shí)，病人可能為AP重癥，需密切關(guān)注病人，避免不良預(yù)后的發(fā)生。且通過(guò)繪制血清LncRNA NEAT1與TLR2聯(lián)合的ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合的AUC更高，且能提高靈敏度，提示聯(lián)合檢測(cè)LncRNA NEAT1與TLR2對(duì)判斷AP疾病嚴(yán)重程度可能更有意義。本研究還發(fā)現(xiàn)AP病人血清LncRNA NEAT1與TLR2水平呈正相關(guān)，LncRNA能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)從而參與機(jī)體多種生物學(xué)過(guò)程，Wang等［20］研究表明敲除LncRNA NEAT1可能通過(guò)抑制TLR2/NF-κB信號(hào)通路改善脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥心肌損傷，猜測(cè)LncRNA NEAT1可能與TLR2協(xié)同參與AP的發(fā)生發(fā)展，具體機(jī)制有待研究。

綜上所述，AP病人血清LncRNA NEAT1與TLR2水平顯著升高，且與AP病人嚴(yán)重程度有關(guān)，可能是臨床上評(píng)估AP病人疾病嚴(yán)重程度的潛在生物標(biāo)志物，LncRNA NEAT1與TLR2可能協(xié)同參與AP的發(fā)生發(fā)展。然而，本研究?jī)H收集AP病人入院24 h內(nèi)的血清標(biāo)本進(jìn)行分析，且僅從臨床水平上檢測(cè)了LncRNA NEAT1與TLR2在AP病人血清中的表達(dá)變化，下一步需收集更多時(shí)間點(diǎn)的血清標(biāo)本，并結(jié)合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，探討二者在AP發(fā)生中的可能機(jī)制，可能為臨床AP病情評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。