張 翼,王晨燕,楊 驍,邵國青,3,侯 博*

(1.福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病疾病防治工程技術研究中心,福州 350013;2.默沙東(寧波)動物保健科技有限公司,寧波 315336;3.江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所,南京 210014)

傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科傳染性喉氣管炎病毒屬。ILTV感染雞后引起雞喉氣管炎(infectious laryngotracheitis,ILT),主要危害成年雞和產蛋雞,造成死亡和/或產蛋下降,種雞的ILT 發(fā)病呈世界性分布,世界上許多國家都有該病的發(fā)病報道,該病在我國近幾年也呈散發(fā)流行趨勢,不斷有養(yǎng)殖場發(fā)生ILTV感染的報道[1-4]。臨床上嚴重的ILTV感染往往表現為呼吸困難、喘氣、咳血等,具有很高的致死性,而溫和型感染主要表現為黏液性氣管炎、鼻炎、結膜炎、不愿活動和低死亡率等多種形式,不論是嚴重感染還是溫和型感染均給生產帶來了嚴重的損失和威脅。在集約化養(yǎng)禽的發(fā)達國家,已使用弱毒疫苗控制了蛋雞的ILT,但有報道稱在2019年4月以來我國山東省多個地區(qū)發(fā)生了多起商品肉雞、地方品種肉雞等感染ILTV的病例,臨床主要表現為嚴重的咳血、呼吸困難以及呼吸道粘膜出血和充血[3],表明ILTV感染肉雞目前在我國呈現出散發(fā)和多發(fā)現象。

ILTV的基因組大小約為155 kb,是一種雙鏈DNA病毒,與其他皰疹病毒一樣,基因組包括長獨特區(qū)、短獨特區(qū)以及兩端的反向重復序列等結構,編碼大量的糖蛋白以及與毒力和病毒復制有關的蛋白。gB和UL32基因編碼病毒粒子的表面糖蛋白,其中gB不僅是病毒感染所必需的糖蛋白,而且是一種主要的保護性抗原,可誘導體液免疫[5],并且在病毒感染過程中誘導膜融合和病毒穿入[6-7]。糖蛋白gD作為皰疹病毒的受體對于病毒結合到敏感細胞的表面是必需的[8-9]。糖蛋白gB和gD也是ILTV等皰疹病毒的保護性抗原,可誘導中和抗體和細胞免疫反應,是重要的免疫原蛋白[10-11]。而糖蛋白gE/gI對于ILTV在細胞與細胞之間擴散具有顯著的促進作用,缺失gE/gI的ILTV病毒噬斑形成能力顯著下降,僅能夠在單細胞內增殖[12]。TK基因是ILTV的主要毒力基因[13],缺失TK可以使ILTV的致病力減弱但仍然保持良好的免疫原性[14]。ICP4基因參與激活病毒早/晚期基因的表達,與病毒毒力存在關聯[15]。糖蛋白gC是ILTV主要的表面抗原蛋白,對病毒的復制是非必需的,但缺失gC可以使ILTV對雞的致病力減弱,并且增強先天性和特異性免疫反應[16]。糖蛋白gG是ILTV的毒力因子,缺失gG可以使病毒毒力顯著減弱[17]。此外還有報道糖蛋白gD、gB、gH、gL、gK、gM、gN等參與了皰疹病毒致病性的形成[18-21]。

ILTV野毒株的毒力差異很大,部分毒株感染雞后具有很高的發(fā)病率和致死率,屬于強致病力毒株,而感染后癥狀輕微或不明顯、無致死率的毒株屬于溫和型毒株,因此及時了解我國當前散發(fā)的ILTV毒株的致病性和主要抗原基因和毒力基因的系統(tǒng)發(fā)育和進化關系,以及篩選一株攻毒后發(fā)病穩(wěn)定的強毒株用于ILTV活疫苗的效力檢驗,對于做好ILT的防控具有重要的臨床意義。本研究對1株臨床ILTV分離株的主要免疫原性基因和毒力基因進行遺傳進化分析,了解其與疫苗株之間的進化親緣關系,并在28日齡和56日齡SPF雞測定了該毒株的致病力,其研究結果為我國有效預防和控制ILTV的感染提供了臨床參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

含1%慶大霉素的胰蛋白磷酸鹽肉湯(TPB),購自Sigma公司;1-5TM2×High Fidelity master Mix購自MCLAB公司;DNA膠回收試劑盒購自ThermoFisher公司,平末端載體pClone007 試劑盒購自擎科生物科技有限公司;DNA提取試劑盒購自Qiagen公司;舒泰購自法國維克有限公司;SPF雞胚購自濟南斯帕法斯家禽有限公司;56和28日齡SPF雞購自濟南賽斯家禽科技有限公司。

PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 PCR擴增使用的引物名稱和序列

1.2 病毒的繁殖與EID50測定

ILTV臨床分離株WF03株由福建省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所保存。該病毒株分離自免疫了ILTV細胞源弱毒活疫苗的黃羽肉雞群,雞群在40～50日齡出現了以咳血和死亡為特征的疑似ILT,發(fā)病率較高,部分雞出現死亡。采用有限稀釋法純化病毒,將保存的ILTV病毒液以TPB連續(xù)10倍稀釋,取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度采用雞胚尿囊膜(CAM)方式接種10日齡SPF雞胚,每個稀釋度接種6枚,接種量為0.2 mL·胚-1,棄去24 h內死亡雞胚,繼續(xù)孵化7 d,每日檢查雞胚存活情況,7 d后對存活雞胚檢查尿囊膜,死亡雞胚和尿囊膜出現灰白色斑的雞胚判定為陽性。取最高稀釋度的陽性尿囊膜以1∶5的比例加入預冷的PBS進行研磨,反復凍融3次,12 000 r·min-1,4 ℃離心10 min,取上清病毒液采用同樣方式繼續(xù)純化2次。將純化第3次收獲的陽性病毒液命名為WF03株P0代。采用CAM方式接種10日齡SPF雞胚7 d后收獲尿囊膜并按照上述方法制備病毒液,記為P1代;依次傳代制備不同代次的病毒液,分別記為P2代、P3代等。

將待測EID50的病毒液以TPB連續(xù)稀釋成10-3.6、10-4.2、10-4.8、10-5.4和10-6.05個稀釋度,從高稀釋度到低稀釋度經CAM接種病毒液,每個稀釋度接種6枚胚,每胚接種0.2 mL,置37 ℃繼續(xù)孵化7 d,每天檢查雞胚存活情況并作記錄。同時取6個SPF雞胚以同樣方式接種TPB作為陰性對照。棄去接種后24 h內的死亡雞胚,每個稀釋度應至少有4個雞胚存活,陰性對照雞胚在接種后第2～7天不應該有死亡出現,試驗才有效。接種24 h后死亡的雞胚判定感染陽性,接種第7天后對所有存活雞胚進行檢查,當雞胚尿囊膜有明顯增厚出現白色病斑,判為感染陽性。采用Reed-Muench法計算雞胚半數感染量EID50,重復測定3次,至少2次測定試驗成立,結果才有效。

1.3 ILTV主要基因的擴增與測序

將300 mL ILTV P5代病毒液以45 000 r·min-1,4 ℃離心4.5 h,棄去上清后將沉淀物使用DNA提取試劑盒按照說明書提取基因組DNA后,采用表1中的引物分別對免疫原性基因gB、UL32、gD、gC和參與毒力形成的基因TK、ICP4、gG、gE、gI、gH、gL、gK、gM、gN進行PCR擴增。反應體系:1-5TM2×High Fidelity master Mix 25 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 21 μL;反應條件:98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s,56 ℃ 15 s,72 ℃30 s,共30個循環(huán);72 ℃ 5 min。擴增結束后,將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,將目的條帶切膠并利用DNA膠回收試劑盒回收PCR產物。

將回收到的PCR產物連接到平末端載體pClone007中轉化感受態(tài)細胞DH5α后涂布含氨芐抗生素的平板,每個基因均篩選5個克隆子(菌液)送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4 關鍵抗原基因和毒力基因遺傳進化分析

從NCBI下載ILTV國內外主要分離株和疫苗株的基因組序列(表2),使用DNAStar軟件和Geneious軟件對參考毒株和分離毒株的免疫原性基因gB、UL32、gD、gC和毒力相關基因TK、ICP4、gG、gE、gI、gH、gL、gK、gM、gN進行分析和串聯拼接,對拼接后的序列采用MEGA7軟件中的ClastalW算法對所有序列進行多重序列比對后,以鄰接(neighbor-Joining,NJ)法中重復數1 000計算bootstrap值構建免疫原性基因gB-gC-gD-UL32和毒力相關基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN的進化樹。

表2 ILTV參考毒株信息

1.5 病毒對SPF雞的致病力分析

將測定過EID50的WF03 株P5代病毒液用TBP稀釋后以氣管攻毒途徑對SPF雞進行感染。選取90羽28日齡SPF雞隨機分為5組,其中第1～4組(每組20羽)以氣管內注射途徑分別以104.5、104.0、103.5和103.0EID50·羽-1的劑量接種WF03株0.2 mL;第5組(10羽)經氣管內注射途徑接種0.2 mL的TPB稀釋液,作為陰性對照。另取8周齡SPF雞,共分為2組,每組11只雞,其中1組用WF03株以104.0EID50·只-1的劑量進行氣管內注射0.2 mL,另一組以TBP稀釋液為空白對照組。

攻毒后,每日對所有雞進行觀察兩次,共觀察14 d,每天記錄每羽雞的發(fā)病情況,包括死亡、咳血、呼吸癥狀、眼部癥狀和精神狀態(tài)等。死亡雞隨時解剖,未死亡雞在試驗結束后采用舒泰過量麻醉致死后統(tǒng)一剖檢,重點觀察喉頭、氣管等病理變化,包括氣管內有無血塊、黃色酪狀物栓塞。

2 結 果

2.1 ILTV 繁殖特性

ILTV WF03株通過CAM途徑采用有限稀釋法接種10日齡SPF雞胚,在接種雞胚7 d后,幸存胚的尿囊膜出現大量灰白色病灶或尿囊膜出現大量的灰白色痘斑(圖1)。測定純化后病毒的EID50,其P1、P2、P3和P5代的病毒含量分別為105.4、105.8、105.5和105.89EID50·mL-1。

ILTV接種雞胚7 d后尿囊膜顯示灰白色痘斑(右),左側為正常尿囊膜對照

2.2 ILTV關鍵抗原基因和毒力基因的遺傳進化分析

對串聯的免疫原性基因gB-gC-gD-UL32的遺傳進化分析顯示:WF03株與中國2009年的分離株LJS09株、2012年的分離株ck/CH/LHLJ/120305株、疫苗株K317和Nobilis Laringovac(R)處在一個大的進化分支上,并且與疫苗株Poulvac ILT(R)、Laryngo Vac和LT Blen處在同一個分支上且親緣關系最近(圖2)。通過對WF03株與參考毒株的基因序列比對顯示:gB基因與參考毒株的相似性為99.67%～99.93%,gC基因與參考毒株的相似性為99.75%～100.00%,gD基因與參考毒株的相似性為99.14%～100.00%,UL32基因與參考毒株的相似性為99.90%～100.00%。

△.疫苗株;▲.本研究分離株

對串聯的毒力相關基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN的遺傳進化分析顯示:WF03株與野毒株進化關系表現為與韓國2010年分離的40798/10/Ko毒株親緣關系最近,其次與我國2012年分離株ck/CH/LHLJ/120305、2009年分離株LJS09或澳大利亞2016年分離株7b株的親緣關系較近;WF03株與疫苗株的進化關系表現為與LT Blen株的親緣關系最近,與K317和Nobilis Laringovac(R)的親緣關系次之(圖3)。通過WF03株與參考毒株的基因序列比對顯示:gE基因與參考毒株的相似性為99.47%～100.00%,gI基因與參考毒株的相似性為99.05%～100.00%,TK基因與參考毒株的相似性為99.68%～100.00%,ICP4基因與參考毒株的相似性為98.71%～99.96%,gG基因與參考毒株的相似性為98.73%～100.00%,gH基因與參考毒株的相似性為99.58%～100.00%,gK基因與參考毒株的相似性為99.59%～100.00%,gL基因與參考毒株的相似性為99.84%～100.00%,gM基因與參考毒株的相似性為99.77%～100.00%,gN基因與參考毒株的相似性為99.28%～100.00%。

2.3 ILTV對SFP雞的致病力

WF03株以104.5、104.0、103.5和103.0EID50·羽-1的劑量感染28日齡SPF雞后發(fā)病率分別為100%(20/20)、100%(20/20)、95%(19/20)和85%(17/20),死亡率分別為45%(9/20)、30%(6/20)、35%(7/20)和10%(2/20),陰性對照組未發(fā)生特異性臨床癥狀。在WF03株攻毒后2 d開始陸續(xù)出現臨床癥狀,持續(xù)期均超過2 d并且食欲廢絕,相繼出現精神沉郁、咳血、呼吸困難、張口呼吸等典型的ILT發(fā)病癥狀。對死亡雞解剖后發(fā)現氣管中有大量血液或血凝塊。其余存活雞從攻毒后第7天開始臨床癥狀逐步消失。結果表明WF03株可以導致28日齡SPF雞出現較高的發(fā)病率和死亡率。

WF03株感染56日齡SPF雞后2 d開始陸續(xù)出現臨床癥狀,持續(xù)期均超過3 d并且食欲廢絕,第5天時死亡3只,以中度至重度氣喘(11/11)(圖4)、咳血(7/11)(圖4)、中度至重度呼吸困難(7/11)為主要臨床癥狀。對第5天死亡雞解剖發(fā)現氣管中有大量血液或血凝塊(圖5),其余存活雞到攻毒后9日臨床癥狀消失。結果表明WF03株可以導致56日齡SPF雞100%(11/11)的發(fā)病率和27.3%(3/11)的死亡率。因此結果表明WF03株對于SPF雞的具有較強的致病力,其以不同劑量感染均可以使80%的雞發(fā)病。

3 討 論

在我國,雞胚源(chicken embryo origin,CEO) 和組織細胞源(tissue culture origin,TCO) 2種弱毒活疫苗已批準用于ILT預防和控制,但在近幾年仍有養(yǎng)殖場發(fā)生ILTV感染的報道,尤其在肉雞中也發(fā)現了ILTV感染的病例[1-4]。糖蛋白gB、gD和gC以及UL32蛋白是ILTV重要的保護性抗原,可以誘導中和抗體和細胞免疫反應,并且還可以增強先天性和特異性免疫反應[5,10-11,16],此外糖蛋白gB和gD還參與病毒黏附、膜融合和穿入的過程[6-9],而糖蛋白gC雖不是病毒復制必需基因,但缺失gC可以使ILTV對雞的致病力減弱[16],因此gB、gC和gD在ILTV致病力的形成中同樣發(fā)揮著重要作用。本研究通過對ILTV WF03分離株的免疫原性基因gB-gC-gD-UL32的遺傳進化分析發(fā)現WF03分離株與我國早期ILTV分離株的親緣關系較近,其主要抗原基因與現有主要疫苗毒株K317、Poulvac ILT(R)、Laryngo Vac和LT Blen的親緣關系均較近,提示現有疫苗能夠對目前的ILTV分離株提供有效保護,然而在免疫雞群中仍然具有ILT的散發(fā)病例。目前預防ILTV感染的疫苗不僅有CEO和TCO兩種弱毒活疫苗,基因工程載體疫苗也已經商品化,由于不同疫苗制備工藝不同,且ILTV臨床分離株的毒力強弱差異較大,因此選用何種疫苗免疫,應該在使用前進行有效性評估。

在皰疹病毒(包括ILTV)中,糖蛋白gE、gI和gG以及TK基因缺失可以使病毒毒力顯著減弱,并且使病毒保持良好的免疫原性[12-14,17]。ICP4基因參與激活病毒早/晚期基因的表達,與病毒毒力存在關聯[15]。此外還有報道糖蛋白gH、gL、gK、gM、gN等也參與了皰疹病毒致病性的形成[18-21]。而在本研究中通過28和56日齡SPF雞的感染試驗結果表明以104.0EID50的劑量攻毒后表現出嚴重的咳血和死亡,WF03株屬于強致病力毒株,但通過對毒力相關基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN的進化樹分析,其親緣關系與韓國2010年分離的40798/10/Ko毒株親緣關系最近,其次分別與我國2012年分離株ck/CH/LHLJ/120305、2009年分離株LJS09和澳大利亞2016年分離株7b株的親緣關系較近,并且與疫苗株中的LT Blen和K317株的親緣關系同樣較近。有報道根據TK、ICP4、gB和UL32基因核苷酸序列分析結果,近年新分離的ILTV BT株與我國早期LJS09毒株等屬于同一進化分支,未出現較大變異,但以104.0EID50的劑量氣管內攻毒2周齡SPF雞未出現死亡,僅有少部分雞出現結膜分泌物,剖檢顯示喉頭氣管正常[22],但早期毒株LJS09株對4周齡雞以102EID50攻毒,急性癥狀出現在感染后4～6 d,表現為呼吸困難,并且發(fā)病率和死亡率分別為80%和10%[23],因此本試驗ILTV WF03株感染28日齡和56日齡SPF雞后的發(fā)病時間、比例、癥狀與其他ILTV強致病力毒株感染情況基本一致。因此本研究通過對ILTV主要基因的遺傳特征分析表明目前ILTV臨床分離株與我國早期的分離株在毒力基因的遺傳關系上無顯著的差異,ILTV未發(fā)生較大的遺傳變異現象,但分離株的致病力具有較大差異,在臨床上可能呈現出溫和型和急性型ILTV共存的局面,目前現有疫苗可能仍對當前ILTV強致病力毒株的流行具有保護作用。

此外,目前由于ILTV疫苗免疫效力評估尚沒有標準株使用,不同生物制品廠使用不同ILTV強毒株對疫苗進行效力檢驗。然而,ILTV野毒株的毒力差異很大,有的毒株具有很高的發(fā)病率和致死率屬于強致病力毒株,而有的毒株感染后僅表現出結膜炎等輕微癥狀或癥狀不明顯,對于篩選一株遺傳穩(wěn)定、發(fā)病可靠、臨床癥狀易于觀察的強毒株進行ILTV疫苗的效力檢驗是非常有必要的,也是非常重要的。WF03株以104.5、104.0、103.5和103.0EID50·羽-1的劑量感染28日齡SPF雞后至少有80%的雞發(fā)病,且以咳血、死亡為主要臨床癥狀,對56日齡SPF雞以104.0EID50·羽-1的劑量攻毒后,100%的雞發(fā)病,主要以氣喘、呼吸困難和咳血為主要臨床癥狀。因此WF03株可作為疫苗效力檢驗用強毒株,其發(fā)病穩(wěn)定,臨床癥狀易于觀察。

4 結 論

本研究通過28和56日齡SPF雞的人工感染試驗結果表明ILTV WF03分離株具有很強的致病力,對28和56日齡雞的致死性也較強,但通過免疫原性基因gB-gC-gD-UL32和毒力相關基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN的遺傳進化分析以及與參考毒株的基因序列相似性比較表明WF03株未發(fā)生明顯的遺傳變異,與我國早期的ILTV分離株和目前市場上的疫苗株具有很近的親緣關系,因此WF03株可用于當前使用以及尚在開發(fā)的ILTV商品疫苗的效力檢驗用強毒株。