張 穎,金 華,韓 楊,眭 丹,肖 鑫,郝秀靜*,李 敏*

(1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,銀川 750021;2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,銀川 750021;3.寧夏中牧億林畜產(chǎn)股份有限公司,銀川 750021;4.寧夏農(nóng)業(yè)勘察設(shè)計(jì)院,銀川 750021)

呼吸系統(tǒng)疾病作為一種高發(fā)病,嚴(yán)重影響著動(dòng)物健康[1-3]。羊呼吸系統(tǒng)疾病是冬春季節(jié)羊養(yǎng)殖業(yè)面臨的棘手問題之一,其導(dǎo)致感染羊群健康狀況不佳,生長緩慢,發(fā)病率和死亡率增加以及治療和疫苗接種成本增加,給養(yǎng)羊業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。羊呼吸道疾病的發(fā)生和發(fā)展一方面與致病性細(xì)菌、病毒和支原體等的感染密切相關(guān),其中,多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)[6]、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)[7]、山羊副流感病毒3型(Caprineparainfluenzavirus type 3)[8]和綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae)[9]等較為常見。另一方面,呼吸道中定植的優(yōu)勢益生菌群在抵抗病原菌感染中發(fā)揮重要作用,Timsit等[10]研究發(fā)現(xiàn),健康公牛中乳酸乳球菌和干酪乳桿菌能夠抵抗細(xì)菌性病原體在呼吸道中的定植。最近的研究表明,呼吸道中多種病原體的協(xié)同感染會(huì)改變呼吸道中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu),進(jìn)而對機(jī)體造成更大的損害[11]。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)呼吸道中具有致病潛力的常駐細(xì)菌與流感病毒的合并感染,通過影響微生物群落結(jié)構(gòu)和整體微生物基因表達(dá),間接影響呼吸道中抗生素耐藥基因的表達(dá),從而使疾病惡化。Shobo等[13]研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境是細(xì)菌病原體的“蓄水池”,可能是疾病發(fā)生發(fā)展的潛在風(fēng)險(xiǎn)因素。環(huán)境因素,如灰塵、氣溶膠和濕度等在維持呼吸系統(tǒng)微生物穩(wěn)態(tài)方面和調(diào)節(jié)病原體致病性方面也扮演著重要的角色,其不僅能夠降低宿主的防御機(jī)制,還能夠增加宿主的易感性[14-15]。近年來,隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,16S rRNA基因測序有助于全面識別與疾病相關(guān)的微生物菌群變化[16]。鼻腔作為呼吸道的起始部位,是阻擋病原體入侵機(jī)體的第一道防線[17]。鼻咽中微生物群的群落結(jié)構(gòu)和豐度可能影響整個(gè)呼吸道的健康,對于防止呼吸道病原體定植具有積極意義[18],但有關(guān)羊鼻腔微生物菌群的多樣性及其與疾病的關(guān)系鮮有報(bào)道,而且其群落結(jié)構(gòu)是否受其生活環(huán)境影響尚不清楚。因此,本研究采用16S rRNA測序技術(shù),獲得了羊鼻腔及羊舍地面表層堆積物的微生物菌群,以健康羊和其所在羊舍地面表層堆積物為對照,分析患呼吸道疾病羊鼻腔及其所在羊舍地面表層堆積物的群落結(jié)構(gòu)、alpha多樣性及beta多樣性,旨在探究患呼吸道疾病羊鼻腔及其生活環(huán)境中微生物菌群的變化,分析羊患呼吸道疾病與其生活環(huán)境的菌群結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系,為進(jìn)一步開展羊呼吸系統(tǒng)微生物多樣性研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ),同時(shí)為羊呼吸系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2019年4月,從寧夏回族自治區(qū)銀川市某一規(guī)?；蝠B(yǎng)殖場采集3～4月齡羊鼻腔拭子和羊舍地面表層堆積物(糞便、墊料,毛發(fā)和塵土的混合物)。在收集樣本之前對羊只進(jìn)行跟蹤調(diào)查和健康檢查,記錄具有咳嗽、喘息、流鼻涕和消瘦等典型患呼吸道疾病癥狀的羊。使用無菌一次性棉棒采集10份患呼吸道疾病羊的鼻腔拭子樣本(每份鼻拭子收集4個(gè)重復(fù)樣本),設(shè)為D組,采集6份健康羊鼻腔拭子作為對照,設(shè)為H組。同時(shí),在每一羊舍地面表層堆積物區(qū)域隨機(jī)選取4處位置,按照10 cm的深度采集樣本,將4處樣本混合后作為一份樣本進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。共采集8份患呼吸道疾病羊所在羊舍地面表層堆積物樣本,設(shè)為ED組,采集7份健康羊所在羊舍地面表層堆積物樣本,設(shè)為EH組。所有樣本均被密封,詳細(xì)登記其分組及編號信息,干冰保存運(yùn)送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行后續(xù)測序。

1.2 羊鼻腔拭子和羊舍地面表層堆積物微生物測定

使用QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN公司,Germany)和基因組DNA 提取試劑盒(天根生物科技有限公司)分別提取羊鼻腔拭子和羊舍地面表層堆積物樣本中的總DNA,利用NanoDrop-8000檢測樣本DNA濃度和純度,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。選擇細(xì)菌 16S rRNA V3-V4 區(qū)域進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,并利用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司,Germany)純化 PCR 產(chǎn)物?；贗onS5TMXL測序平臺,構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行單端測序。

1.3 16S rRNA數(shù)據(jù)處理

測序完成后,用Cutadapt(Martin M.2011)軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和質(zhì)控,主要工作包括剪切末端低質(zhì)量較多的部分、拆分樣本數(shù)據(jù)、去除reads中的接頭序列和barcode序列并過濾掉序列中的嵌合體序列。質(zhì)控得到有效數(shù)據(jù)后,以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs),然后與Silva132數(shù)據(jù)庫比對,對OTUs序列進(jìn)行物種注釋。

1.4 微生物結(jié)構(gòu)組成和多樣性分析

基于樣本的 OTUs 聚類和注釋,樣本測序深度、物種的豐富度和均勻度由稀釋曲線和等級聚類曲線表示。微生物菌群alpha多樣性由觀測物種數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)表示。計(jì)算各組樣本在不同分類單元的相對豐度,并分別在門、綱、目、科、屬和種水平上構(gòu)建矩陣?；赨nweighted-UniFrac距離的主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)和多響應(yīng)排列程序分析(multiple response permutation procedure,MRPP)用于顯示微生物群落的beta多樣性。最后,效應(yīng)大小的線性判別分析(linear discriminant analysis of effect size,LEfSe)用于估算每個(gè)物種豐度對差異效果影響的大小,從而在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)識(biomarker),即組間差異顯著的物種(logLDA分?jǐn)?shù)>4被認(rèn)為具有顯著差異)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 7 軟件對alpha多樣性指數(shù)及相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn),結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(standard error,SE)”表示,P>0.05被認(rèn)為沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05為差異顯著性,P<0.01和P<0.001為差異極顯著)。

2 結(jié) 果

2.1 16S RNA測序結(jié)果及質(zhì)控

基于IonS5TMXL測序平臺,對羊鼻腔拭子和羊舍地面表層堆積物樣本進(jìn)行單端測序后,每個(gè)樣本平均測得77 810條原始序列。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和過濾后,如表1所示,每個(gè)樣本平均得到73 215條有效數(shù)據(jù),平均長度為408.61 nt,Q20占比80.24%,GC含量為52.12%,質(zhì)控有效率達(dá)94.08%。

表1 數(shù)據(jù)質(zhì)控平均數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

以97%的一致性將有效序列聚類成為OTUs,分析樣本測序深度和樣本中物種的豐富度和均勻度。由圖1A可知,所有樣本的稀釋曲線隨著測序深度的增加逐漸趨于平緩,表明當(dāng)前測序深度足夠反映該群落樣本所包含的微生物多樣性。由等級聚類曲線(圖1B)可知,所有樣本在橫軸上的跨度較大,而在縱軸上趨于平緩,表明樣品中物種的豐富度和均勻度良好。

圖1 所有樣本稀釋曲線和等級聚類曲線

2.2 羊鼻腔及周邊環(huán)境中微生物菌群OTUs聚類

本試驗(yàn)共得到2 918個(gè)OTUs,如圖2A所示,健康羊(H組)和患呼吸道疾病羊(D組)中共有的OTUs數(shù)為1 389個(gè),H組中特有的OTUs數(shù)明顯多于D組。如圖2B所示,健康羊所在羊舍地面表層堆積物(EH組)中特有的OTUs數(shù)多于患呼吸道疾病羊所在羊舍地面表層堆積物(ED組),EH組和ED組共有的OTUs數(shù)為1 804個(gè)。H組和EH組中共有的OTUs數(shù)為1 907個(gè)(圖2C)。ED組中特有的OTUs數(shù)多于D組,二者共有的OTUs數(shù)為1 234個(gè)(圖2D)。上述結(jié)果表明,不同組別之間菌種的豐度具有差異,健康羊鼻腔及其所在羊舍地面表層堆積物中所含菌種的豐度較高,而患呼吸道疾病羊鼻腔及其所在羊舍地面表層堆積物中所含菌種豐度較低。

圖2 羊鼻腔及羊舍地面表層堆積物中微生物菌群OTUs聚類

2.3 羊鼻腔及周邊環(huán)境中微生物alpha多樣性分析

為了進(jìn)一步分析羊鼻腔及其生活環(huán)境中微生物群落的豐富度和多樣性,對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行alpha多樣性分析。各組樣本的覆蓋度指數(shù)均為0.9～1.0,表明測序結(jié)果能反映各組菌群多樣性組成(圖3A)。與健康羊(H組)相比,患呼吸道疾病羊(D組)中觀測物種數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)均顯著下降(P<0.01)(圖3B～F),表明患呼吸道疾病羊鼻腔微生物的多樣性和豐富度降低。進(jìn)一步比較健康羊所在羊舍地面表層堆積物(EH組)和患呼吸道疾病羊所在羊舍地面表層堆積物(ED組)中Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù),發(fā)現(xiàn)ED組中Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)均顯著低于EH組(P<0.05)(圖3E～F),表明患呼吸道疾病羊生活環(huán)境中菌群豐富度也降低。

*.P<0.05;**.P<0.01

2.4 羊鼻腔及周邊環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)

本試驗(yàn)共鑒定出個(gè)32個(gè)門(Phylum),51個(gè)綱(Class),97個(gè)目(Order),175個(gè)科(Family),359個(gè)屬(Genus),237個(gè)種(Species)。各組中占據(jù)主導(dǎo)地位的菌門主要包括變形菌門(Proteobacteria)(H組:26.42%;D組:79.99%;ED組:3.05%;EH組:5.11%)、厚壁菌門(Firmicutes)(H組:53.01%;D組:6.08%;ED組:63.04%;EH組:65.14%)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(H組:11.93%;D組:9.05%;ED組:23.92%;EH組:21.84%)。與H組相比,D組中變形菌門的相對豐度增加,而厚壁菌門相對豐度降低。與EH組相比,ED組中變形菌門和厚壁菌門的相對豐度增加,而擬桿菌門的相對豐度降低(圖4A)。

在綱水平上(圖4B),各組占據(jù)主導(dǎo)的菌群均為變形菌綱(Gammaproteobacteria)、梭菌綱(Clostridia)和擬桿菌綱(Bacteroidia),與H組相比,D組鼻腔中變形菌綱相對豐度增加(H組:24.98%;D組:79.41%),梭菌綱相對豐度降低(H組:43.98%;D組:4.43%)。假單胞菌目(Pseudomonadales)(H組:1.38%;D組:66.30%;ED組:0.41%;EH組:0.47%)、黃色單胞菌目(Xanthomonadales)(H組:18.81%;D組:5.51%;ED組:0.23%;EH組:1.98%)和梭菌目(Clostridiales)(H組:43.97%;D組:4.43%;ED組:60.48%;EH組:62.14%)均是各組目水平上的優(yōu)勢物種(圖4C),它們在EH組和ED組的相對豐度無明顯變化,H組中黃色單胞菌目和梭菌目相對豐度較高,而D組中黃色單胞菌目和梭菌目的豐度明顯降低,假單胞菌目豐度明顯增加。

在科水平上(圖4D),黃色單胞菌科(Xanthomonadaceae)(H組:18.81%;D組:5.49%)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)(H組:23.17%;D組:2.48%)是H組和D組的優(yōu)勢物種,但莫拉菌科(Moraxellaceae)在兩組中相對豐度差異較為明顯,其在D組中的相對豐度較高(H組:1.30%;D組:66%)。在屬水平上(圖4E),與H組相比,D組中莫拉菌屬(Moraxella)(H組:1.22%;D組:66.23%)、伯杰菌屬(Bergeyella)(H組:0.04%;D組:3.68%)和絲狀桿菌屬(Filobacterium)(H組:0.26%;D組:2.33%)的相對豐度明顯增加,而寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)(H組:18.72%;D組:5.46%)的相對豐度明顯降低。除此之外,支原體屬(Mycoplasma)(H組:0.03%;D組:1.93%)、波氏桿菌屬(Bordetella)(H組:0.00%;D組:1.79%)和曼氏桿菌屬(Mannheimia)(H組:0.32%;D組:1.08%)等細(xì)菌性病原的相對豐度在D組中也有明顯增加。通過與數(shù)據(jù)庫Silva比對,注釋到種水平的OTUs比例為9.53%,如圖4F所示,在已注釋到的種中,D組的優(yōu)勢種為腔隙莫拉菌(Moraxella_lacunata)(H組:0.03%;D組:1.63%)和動(dòng)物潰瘍伯杰菌(Bergeyella_zoohelcum)(H組:0.03%;D組:1.12%)。

上述結(jié)果提示,羊鼻腔及羊舍地面表層堆積物樣品中微生物學(xué)分類具有多樣性,各組樣品的分類結(jié)構(gòu)相似,但部分物種相對豐度差異較大?；己粑兰膊⊙虮乔慌c健康羊鼻腔微生物的優(yōu)勢種屬存在明顯差異,患呼吸道疾病羊鼻腔中明顯增加的種屬,如:莫拉菌屬(Moraxella)、伯杰菌屬(Bergeyella)等相對豐度的增加可能是引起羊患病的主要病原微生物。

2.5 羊鼻腔及周邊環(huán)境中微生物菌群beta多樣性分析

為了更好地了解羊鼻腔及生活環(huán)境中微生物群的動(dòng)態(tài)演替規(guī)律,基于Unweighted-UniFrac距離進(jìn)行PCoA分析,如圖5A所示,樣本之間存在明顯的聚類分離,表明各組具有不同的群落結(jié)構(gòu)。由Beta多樣性組間差異分析的箱型圖可知(圖5B),D組和H組的群落結(jié)構(gòu)具有極顯著差異(P<0.01),ED組和EH組的群落結(jié)構(gòu)也具有顯著差異(P<0.05)。另外,MRPP分析(表2)也得到了同樣的結(jié)果。以上數(shù)據(jù)證實(shí)患呼吸道疾病羊的微生物群落組成發(fā)生了顯著變化。

*.P<0.05;**.P<0.01

表2 MRPP 分析組間差異顯著性

2.6 羊鼻腔及周邊環(huán)境中差異微生物分析

為了明確健康羊鼻腔及周邊環(huán)境與患呼吸道疾病羊鼻腔及周邊環(huán)境之間顯著變化的微生物,作者利用LEfSe分析對差異微生物進(jìn)行篩選,由圖6可知,LAD>4的微生物標(biāo)志物共有48個(gè),厚壁菌門(Firmicutes)是EH組具有顯著差異的微生物菌門,而擬桿菌門(Bacteroidetes)是ED組具有顯著差異的微生物菌門。H組共獲得16個(gè)差異微生物,D組共獲得15個(gè)差異微生物。在屬水平上,H組具有顯著差異的微生物菌群為寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas),而莫拉菌屬(Moraxella)、伯杰菌屬(Bergeyella)和絲狀桿菌屬(Filobacterium)等是D組具有顯著差異的微生物菌群。經(jīng)分析,未發(fā)現(xiàn)H組和D組有共同的差異顯著的微生物菌群,這可能與健康羊鼻腔和患呼吸道疾病羊鼻腔具有不同的微生物群落結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3 討 論

傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)難以分離不易培養(yǎng)的、微量的微生物,不利于全面識別與疾病相關(guān)的微生物菌群變化。近年來,隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展,16S rRNA基因測序技術(shù)逐漸成為了研究微生物群落組成和分布的重要手段[19-20]。鼻咽部作為呼吸道的起始部位,其內(nèi)定植的微生物群是一個(gè)動(dòng)態(tài)而復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),在抵御病原體感染,維持呼吸道健康中具有重要調(diào)控作用[21-22]。研究發(fā)現(xiàn),呼吸系統(tǒng)生態(tài)失衡與呼吸道疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其微生物群的組成和多樣性的差異是導(dǎo)致疾病的重要因素[23-24]。

本研究通過16S rRNA基因組測序技術(shù)分析健康羊和患呼吸道疾病羊鼻腔及所在羊舍地面表層堆積物微生物菌群的結(jié)構(gòu)。alpha多樣性和beta多樣性分析結(jié)果顯示:健康羊鼻腔與患呼吸道疾病羊鼻腔具有不同的微生物群落結(jié)構(gòu),二者之間具有極顯著的差異(P<0.01)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),變形菌門是患呼吸道疾病羊鼻腔中顯著增加的菌門。在屬水平,造成健康羊鼻腔和患呼吸道疾病羊鼻腔菌群結(jié)構(gòu)顯著差異的屬為寡養(yǎng)單胞菌屬、莫拉菌屬、伯杰菌屬和絲狀桿菌屬。此前的研究表明,寡養(yǎng)單胞菌屬是一類革蘭陰性菌,至少包括8個(gè)種,其存在于整個(gè)環(huán)境中,土壤和植物來源的寡養(yǎng)單胞菌屬有利于生物修復(fù)和植物健康[25],而嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌作為寡養(yǎng)單胞菌屬唯一一類被報(bào)道的致病菌,其在動(dòng)物中是一種機(jī)會(huì)性致病菌[26]。莫拉菌屬是牛和豬上呼吸道中最豐富的屬之一,其可單獨(dú)或與其他致病菌協(xié)同感染引起疾病[27-28]。最近,董文龍等[29]、Li等[30]相繼從患有呼吸道疾病的羊鼻腔中分離出了莫拉菌,可見其在羊呼吸道疾病中具有重要的潛在致病性。Lorenzo等[31]從仔豬鼻道中分離出的伯杰菌屬在體外表現(xiàn)出明顯的潛在毒力特征,如:抵抗吞噬、耐受血清和黏附上皮細(xì)胞等。絲狀桿菌屬被鑒定為嚙齒類動(dòng)物的主要病原菌[32]。綜上所述,患呼吸道疾病羊鼻腔中顯著增加的莫拉菌屬、伯杰菌屬和絲狀桿菌屬等可能是引起羊患呼吸道疾病的重要的潛在致病因子。

越來越多的研究表明,環(huán)境中的微生物群對疾病發(fā)展具有潛在的影響[33-34]。Volenis-Chacin等[35]對豬氣管微生物群與空氣、糞便和口腔液中微生物群的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)來自不同生態(tài)位的細(xì)菌群落之間存在復(fù)雜的相互作用。本研究中,作者分析了羊生活環(huán)境中微生物多樣性與羊呼吸道疾病之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)健康羊所在羊舍地面表層堆積物與患呼吸道疾病羊所在羊舍地面表層堆積物的菌群結(jié)構(gòu)具有顯著差異(P<0.05)。厚壁菌門和擬桿菌門是健康羊所在羊舍地面表層堆積物和患呼吸道疾病羊所在羊舍地面表層堆積物中具有顯著差異的微生物菌門,患呼吸道疾病羊所在羊舍地面表層堆積物中厚壁菌門的相對豐度高于健康羊所在羊舍地面表層堆積物。然而,患呼吸道疾病羊鼻腔顯著變化的菌門為變形菌門。在屬水平,寡養(yǎng)單胞菌屬是健康羊鼻腔和患呼吸道疾病羊鼻腔中具有顯著差異的屬,其在健康羊鼻腔中的相對豐度高于患呼吸道疾病羊鼻腔,而其在健康羊所在羊舍地面表層堆積物和患呼吸道疾病羊所在羊舍地面表層堆積物中并無顯著變化。在患呼吸道疾病羊鼻腔中相對豐度較高的莫拉菌屬、伯杰菌屬和絲狀桿菌屬在患呼吸道疾病羊所在羊舍地面表層堆積物中的相對豐度也無顯著變化。由此可見,羊生活環(huán)境中微生物菌群結(jié)構(gòu)的改變對羊呼吸道疾病的發(fā)生和發(fā)展無直接聯(lián)系,但其與羊鼻腔微生物群之間復(fù)雜的相互作用及對羊呼吸道疾病的潛在危害需進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

4.1患呼吸道疾病羊鼻腔及其生活環(huán)境中微生物的豐富度和均勻度低于健康羊。

4.2莫拉菌屬、伯杰菌屬和絲狀桿菌屬是患呼吸道疾病羊鼻腔中相對豐度較高的差異菌屬,支原體屬、波氏桿菌屬和曼氏桿菌屬等細(xì)菌性病原相對豐度的增加以及患呼吸道疾病羊鼻腔中菌群結(jié)構(gòu)的改變,可能是引起羊患呼吸道疾病的重要因素。

4.3本研究未發(fā)現(xiàn)羊生活環(huán)境中微生物菌群結(jié)構(gòu)與羊呼吸道疾病的發(fā)生和發(fā)展的直接聯(lián)系,但其潛在的風(fēng)險(xiǎn)仍需進(jìn)一步研究。