劉桃雪,蘇冰倩,齊艷麗,郭江濤,劉忠虎,褚貝貝,王 江*,曾 磊*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,鄭州 450046;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450046;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué),河南省動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450046)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家豬和各種野豬(如非洲野豬、歐洲野豬等)而引起的一種急性、出血性、烈性傳染病。其特征是發(fā)病過(guò)程短,最急性和急性感染死亡率高達(dá)100%。非洲豬瘟的爆發(fā),給全球養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。雖然對(duì)非洲豬瘟已進(jìn)行了廣泛的研究,但是仍然缺乏有效的疫苗或抗病毒策略[1],目前主要是采取早期檢測(cè)、嚴(yán)守衛(wèi)生程序、大規(guī)模撲殺帶毒家畜和野豬等措施將ASF控制在一定區(qū)域[2]。

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員,是具有雙層膜結(jié)構(gòu),直徑為200 nm的大型雙鏈DNA病毒,呈復(fù)雜的二十面體結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)由內(nèi)到外依次是內(nèi)核、內(nèi)核心殼、內(nèi)膜、衣殼、囊膜,基因組全長(zhǎng)為170～193 kb,中央為保守區(qū),兩側(cè)為可變區(qū)。ASFV基因組龐大且復(fù)雜,并具有雙層囊膜,所以病毒耐受力強(qiáng)變異度高導(dǎo)致難以形成中和抗體[3]。ASFV基因組有150～167個(gè)開放閱讀框,編碼150～200種蛋白質(zhì),其中至少有54個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[4],主要的結(jié)構(gòu)蛋白有p30、p54、p72、pp220、pp62和 CD2v蛋白等[5]。其中,ASFV的p72、p54和 p30等結(jié)構(gòu)蛋白均具有良好的抗原性和免疫原性[6-9],具備血清學(xué)診斷價(jià)值[10-11]。

p30蛋白是由CP204L基因編碼的重要的內(nèi)囊膜蛋白,是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,也是最具免疫原性的蛋白之一。它能夠介導(dǎo)ASFV對(duì)巨噬細(xì)胞的吸附和內(nèi)化,干擾宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄與翻譯,在感染后4 h,能在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到[12],然后在整個(gè)感染周期中持續(xù)高水平表達(dá),含量豐富且抗原性較高,是重要的病毒早期診斷靶標(biāo)[13-14]。p30的表達(dá)表明病毒已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞并脫殼,病毒基因的早期表達(dá)已經(jīng)開始[15]。p30蛋白在非洲豬瘟病毒粒子進(jìn)入宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要作用,抗p30蛋白的抗體對(duì)病毒內(nèi)化有一定的抑制作用[6],這提示p30蛋白參與ASFV的內(nèi)化過(guò)程,但具體作用機(jī)制尚不清楚[7,16]。

鑒于p30是早期檢測(cè)的優(yōu)良靶標(biāo),本研究通過(guò)對(duì)ASFV p30蛋白氨基酸序列進(jìn)行原核密碼子優(yōu)化,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得可溶性重組p30蛋白,將其作為抗原免疫BALB/c小鼠,制備了2株針對(duì)p30蛋白的單克隆抗體,均具有良好的特異性,對(duì)其抗原表位進(jìn)行鑒定,并在預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中進(jìn)行標(biāo)注。為ASFV p30 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究及血清學(xué)診斷試劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株 NCBI(MK128 995.1)中China/2018/AnhuiXCGQ-ASFV毒株CP204L基因序列由上海金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成。表達(dá)菌株BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司、克隆菌株Top10由本實(shí)驗(yàn)室制備及保存。

1.1.2 細(xì)胞及毒株 骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)購(gòu)自美國(guó)ATCC;豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬圓環(huán)病毒(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(SADS-CoV)為本實(shí)驗(yàn)室保存。ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 動(dòng)物 雌性6～8周齡的BALB/c小鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.4 試劑 考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;弗氏佐劑、HAT、HT貯存液、融合劑PEG1450購(gòu)自Sigma公司;Ni-NTA Agarose購(gòu)自QIAGEN公司;AEC酶底物顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購(gòu)自Sino Biological公司;Millipore超濾管購(gòu)自密理博中國(guó)有限公司;透析袋購(gòu)自VAKE公司(USA)。

1.2 方 法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 參考NCBI(MK128 995.1)中China/2018/AnhuiXCGQ-ASFV毒株CP204L基因序列,運(yùn)用在線密碼子優(yōu)化工具GenSmartTMCodon Optimization根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性調(diào)整p30基因的同義密碼子進(jìn)行密碼子優(yōu)化CP204L全基因。表達(dá)序列兩端引入酶切位點(diǎn)NdeⅠ和HindⅢ及6×His標(biāo)簽,便于基因克隆和蛋白純化,提交金斯瑞生物科技有限公司合成。將重組質(zhì)粒命名為pET30a-His-p30。使用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ對(duì)合成的重組質(zhì)粒pET30a-His-p30進(jìn)行雙酶切鑒定,酶切鑒定正確后將重組質(zhì)粒送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 重組p30蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞,于37 ℃恒溫振蕩搖床中振蕩培養(yǎng)4 h,至OD600 nm=0.6左右,取1 mL菌液作為未誘導(dǎo)對(duì)照,然后分別加入0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol·L-1IPTG,于37 ℃及16 ℃,180 r·min-1條件下誘導(dǎo)表達(dá)10 h,以確定誘導(dǎo)p30重組蛋白表達(dá)的最佳條件。富集菌體,超聲波破碎后,4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min分離上清和沉淀。SDS-PAGE凝膠電泳后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)蛋白可溶性。

1.2.3 表達(dá)蛋白的純化及Western blot鑒定 以最佳誘導(dǎo)條件大量誘導(dǎo)表達(dá)p30重組蛋白,參照Ni-NTA Agarose操作技術(shù)手冊(cè)對(duì)破碎后的上清進(jìn)行純化,通過(guò)SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色鑒定蛋白純度。然后經(jīng)BCA法測(cè)定p30蛋白濃度,將其定量為1 mg·mL-1后分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆?。?duì)純化后的p30蛋白進(jìn)行Western blot鑒定,使用按1∶1 000比例稀釋的his標(biāo)簽抗體作為一抗,1∶5 000比例稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗鼠的IgG抗體作為二抗,顯色后,進(jìn)行免疫印跡結(jié)果分析。

1.2.4 動(dòng)物免疫 取5只6～8周齡雌性BALB/c小鼠(分別記為鼠1～5),將純化的重組p30蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混勻乳化,通過(guò)皮下多點(diǎn)注射方式免疫小鼠,免疫劑量為每只50 μg。二次免疫、三次免疫用弗氏不完全佐劑乳化p30蛋白,每次免疫間隔2周,第3次免疫后1周自小鼠尾部采血,分離血清,用間接ELISA方法測(cè)定血清抗體效價(jià);融合前3 d選擇抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行再次免疫,每只腹腔注射100 μg重組蛋白。

1.2.5 雜交瘤細(xì)胞融合及篩選 再次免疫3 d后將小鼠安樂死,分離脾細(xì)胞,在PEG1450作用下將脾細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞按照7∶1的比例進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后將細(xì)胞鋪至含有HAT選擇培養(yǎng)基的96孔細(xì)胞板中培養(yǎng)。細(xì)胞融合7 d后,取100 μL培養(yǎng)上清用間接 ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞需進(jìn)行2～3次亞克隆,直至抗體陽(yáng)性率達(dá)100%。將穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存于液氮中長(zhǎng)期保存。

間接 ELISA方法:將重組p30蛋白用1×PBS稀釋至2 μg·mL-1包被酶標(biāo)板,4 ℃包被過(guò)夜,棄去包被液,100 μL·孔-1PBST,洗滌3次;用5%脫脂奶于37 ℃封閉2 h,PBST洗滌3次;將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗,加入酶標(biāo)板,同時(shí)設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照,于37 ℃反應(yīng)1 h,PBST洗滌3次;加入100 μL HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶2 500稀釋)于37 ℃反應(yīng)1 h,PBST洗滌3次;每孔加入100 μL TMB顯色液于37 ℃避光顯色15 min;加入100 μL 2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD450 nm值,待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm(S/N)>2.1判定為陽(yáng)性。

1.2.6 腹水制備及純化 選取12周齡雌性BALB/c小鼠,向小鼠腹腔內(nèi)注射300 μL弗氏不完全佐劑。7 d后,向小鼠腹腔中注射3×106～4×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。5～7 d后,小鼠的腹部變大,待觸之有波動(dòng)感、行動(dòng)不敏捷、被毛粗糙時(shí)收集腹水,于4 000 r·min-1離心5 min,取中間層液體。用飽和硫酸銨沉淀法對(duì)所獲得腹水進(jìn)行純化,收集純化后的目標(biāo)抗體,標(biāo)記清楚名稱等信息并分裝后于-80 ℃保存。

1.2.7 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定 利用間接ELISA以純化的p30蛋白為抗原,用PBS稀釋至100 ng·mL-1后加入96孔的ELISA板內(nèi),用5%的BSA連續(xù)2倍倍比稀釋的待檢抗體作為一抗,用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG按照1∶5 000的比例進(jìn)行稀釋作為二抗,TMB顯色15 min后終止,使用酶標(biāo)儀,讀取各樣品孔OD450 nm值。

1.2.8 單克隆抗體亞型鑒定 包被亞型抗體:用PBS按比例稀釋同型特異性抗體:IgG1(1∶1 000)、IgG2a(1∶2 000)、IgG2b(1∶200)、IgG3(1∶500)、IgM(1∶4 000),之后分別加入96孔微孔板內(nèi),每個(gè)亞型重復(fù)3孔;以單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗,同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG按照1∶5 000的比例進(jìn)行稀釋作為二抗,TMB顯色15 min后終止,讀取各樣品的OD450 nm值,并判定抗體亞型。

1.2.9 Western blot 反應(yīng)性鑒定 將pcDNA3-HA及pcDNA3-p30-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293 T細(xì)胞,收取細(xì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行 Western blot驗(yàn)證,用HA標(biāo)簽抗體按1∶1 000比例稀釋作為一抗,用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG按照1∶5 000的比例進(jìn)行稀釋作為二抗,加入顯色試劑,顯色后,進(jìn)行免疫印跡結(jié)果分析。

1.2.10 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)反應(yīng)性鑒定 取轉(zhuǎn)染pcDNA3-p30-HA質(zhì)粒24 h的HeLa細(xì)胞及其玻片(4 mL·L-1多聚甲醛固定),以單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗,用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG按照1∶200的比例進(jìn)行稀釋作為二抗,并對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,固定玻片后,將玻片置于在熒光顯微鏡下觀察,使用EVOS FL細(xì)胞成像系統(tǒng)拍攝照片并保存。

1.2.11 單克隆抗體抗原表位鑒定 利用NetSurfP Ver.1.1 (http:∥gps.biocuckoo.cn/online_full.php)預(yù)測(cè)p30二級(jí)結(jié)構(gòu),對(duì)CP204L基因進(jìn)行逐步截短(避開α螺旋和β折疊),連接至pGEX4T-3載體,將構(gòu)建成功的截短質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài),用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,取1 mL菌液,99 ℃變性10 min,制作蛋白樣品。以純化抗體作為一抗,進(jìn)行Western blot反應(yīng)性鑒定,以確定其抗原表位區(qū)域。然后使用I-TASSER(https:∥zhanggroup.org/I-TASSER/)在線預(yù)測(cè)ASFV p30蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu),在PyMOL軟件中標(biāo)注出p30單克隆抗體所識(shí)別抗原表位區(qū)域。

2 結(jié) 果

2.1 密碼子優(yōu)化

密碼子優(yōu)化后,與原始序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)堿基序列發(fā)生改變(以淺色字體表示,圖1A),編碼的氨基酸類型并未發(fā)生改變(圖1B),所表達(dá)的p30蛋白的類型也未發(fā)生變化。

2.2 重組p30蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

為了誘導(dǎo)重組p30蛋白表達(dá)及摸索其最適表達(dá)條件,將合成的原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-His-p30轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株BL21(DE3)中,分別采用不同濃度的IPTG和溫度誘導(dǎo)蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)在30 ku處出現(xiàn)目的蛋白,且IPTG濃度為0.4～0.6 mmol·L-1,溫度為16 ℃,10 h誘導(dǎo)效果最佳(圖2A、2B)。SDS-PAGE電泳分析其表達(dá)產(chǎn)物有少量以可溶性形式存在于上清中(圖2C)。

A.37 ℃誘導(dǎo)10 h重組蛋白表達(dá)情況;B.16 ℃誘導(dǎo)10 h重組蛋白表達(dá)情況;C.重組p30蛋白可溶性分析。M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量;1.pET30a-CP204L未誘導(dǎo)全菌液;2.pET30a-CP204L誘導(dǎo)全菌液;3.pET30a-CP204L誘導(dǎo)上清;4.pET28a-CP204L誘導(dǎo)沉淀

2.3 原核表達(dá)蛋白的純化及Western blot鑒定

為了進(jìn)一步從上清中純化重組蛋白p30,將未誘導(dǎo)全菌液、誘導(dǎo)全菌液、破碎后上清、破碎后沉淀、收集的流穿液、不同咪唑濃度的洗雜緩沖液及洗脫液進(jìn)行蛋白制樣,SDS-PAGE 檢測(cè)樣品中蛋白純化效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在100和250 mmol·L-1咪唑洗脫液樣品中存在洗脫的目的蛋白p30,大小為30 ku,且條帶單一(圖3A)。為了驗(yàn)證純化后的目的蛋白,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot驗(yàn)證,一抗為鼠源的His標(biāo)簽抗體,二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗鼠的IgG抗體,結(jié)果顯示目的蛋白可與His標(biāo)簽一抗結(jié)合良好,條帶與預(yù)期大小30 ku一致(圖3B),說(shuō)明蛋白成功表達(dá)。

2.4 單克隆抗體 Western blot 及IFA反應(yīng)性鑒定

為了鑒定獲得的2株ASFV p30蛋白的單抗與真核表達(dá)p30蛋白是否具有良好的結(jié)合活性,將pcDNA3-HA及pcDNA3-p30-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293 T細(xì)胞,收取細(xì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行 Western blot驗(yàn)證,一抗為anti-HA和2G10-2、6D2-1,二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗鼠的IgG抗體,結(jié)果顯示目的蛋白pcDNA3-p30-HA成功表達(dá),獲得的2株p30單克隆抗體均能與p30蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),蛋白質(zhì)大小約為30 ku(圖4A)。其次,IFA結(jié)果顯示,2株單克隆抗體均與細(xì)胞內(nèi)ASFV p30瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合良好,在顯微鏡下可見綠色熒光,定位于細(xì)胞質(zhì)中,空載體轉(zhuǎn)染孔對(duì)照無(wú)熒光呈現(xiàn)(圖4B)。

A.Western blot鑒定p30單克隆抗體的特異性;B.IFA鑒定p30單克隆抗體的特異性

表明獲得的2株ASFV p30蛋白的單抗與真核表達(dá)p30蛋白均具有良好的特異性。

2.5 單克隆抗體抗原表位鑒定

ASFV p30蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由無(wú)規(guī)卷曲、α螺旋、β折疊構(gòu)成(圖5A),對(duì)p30肽段進(jìn)行截短,保證每段α螺旋、β折疊的完整,進(jìn)一步Western blot分析,結(jié)果表明ASFV-P30識(shí)別的氨基酸序列范圍是C端170～194 aa共25個(gè)氨基酸,氨基酸序列為:IYGTPLKEEEKEVVRLMVIKLLKKK(圖5B)。在p30蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)可視化的基礎(chǔ)上,標(biāo)注出p30單克隆抗體識(shí)別抗原表位區(qū)域170～194 aa(圖5C,以紅色區(qū)域表示)。

A.ASFV p30蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果;B.ASFV p30蛋白截短示意圖及抗原表位鑒定(M.蛋白分子量 Marker;1.pGEX4T-p30;2.pGEX4T-p30-Δ1;3.pGEX4T-p30-Δ2;4.pGEX4T-p30-Δ3;5.pGEX4T-p30-Δ4;6.pGEX4T-p30-Δ5;7.pGEX4T-p30-Δ6);C.ASFV p30蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討 論

非洲豬瘟病毒作為非洲豬瘟病毒科唯一成員,堿基數(shù)多達(dá)17萬(wàn)～19萬(wàn)個(gè),基因組龐大,能夠編碼多種蛋白質(zhì),包括結(jié)構(gòu)蛋白和免疫調(diào)節(jié)蛋白,其結(jié)構(gòu)和免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜,能夠逃避宿主免疫細(xì)胞的清除,但其與宿主細(xì)胞的互作機(jī)制尚不清晰。針對(duì)非洲豬瘟的各種疫苗策略已經(jīng)進(jìn)行了研究,早期側(cè)重于以抗原為基礎(chǔ)的方法,旨在誘導(dǎo)中和血清學(xué)反應(yīng),以CD2v為抗原不能引起機(jī)體足夠的免疫保護(hù),此后,許多亞單位疫苗的方法都集中在p54和p30,數(shù)據(jù)結(jié)果顯示p54和p30同時(shí)免疫機(jī)體可延緩ASFV臨床癥狀,因此深入對(duì)ASFV蛋白質(zhì)組和單個(gè)蛋白質(zhì)功能的研究,對(duì)合理設(shè)計(jì)靶向疫苗方法具有重要意義[17-19]。

現(xiàn)階段對(duì)非洲豬瘟的控制主要依靠傳統(tǒng)的措施:動(dòng)物一旦確診感染,立刻采取全撲殺以防范ASFV的進(jìn)一步擴(kuò)散和蔓延。因此,快速準(zhǔn)確的診斷識(shí)別ASF是該病流行病學(xué)管理的關(guān)鍵。目前主要將p72、p54、p30蛋白作為診斷抗原用于ASFV感染時(shí)的血清學(xué)診斷。有研究表明,與p54蛋白相比,可能由于p30擁有構(gòu)象表位,在ELISA上的靈敏度更高[20]。且p30蛋白在ASFV感染后2～4 h即可表達(dá),能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生,在整個(gè)感染期都能檢測(cè)到,更適用于早期診斷。因此本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng),獲得了純度較高的可溶性p30蛋白,建立了獲得可溶性p30蛋白的體系,且蛋白純度高,經(jīng)鑒定具有良好的反應(yīng)原性,可用于間接ELISA來(lái)檢測(cè)ASFV的感染。進(jìn)一步利用p30蛋白免疫小鼠,制備了高特異性的p30單克隆抗體,可應(yīng)用于阻斷ELISA方法的建立,這為血清學(xué)檢測(cè)方法的進(jìn)一步發(fā)展提供了材料。

研究病毒蛋白的特性及評(píng)估p30蛋白的抗原表位特征,尤其是保守表位特征,有助于研究人員更好理解病毒的生物特性和宿主的免疫反應(yīng)機(jī)制,還能為發(fā)展和改進(jìn)ASF診斷和監(jiān)測(cè)的血清學(xué)檢測(cè)方法以及疫苗的研發(fā)提供重要信息[21-22]。Petrovan等[23]的研究初步鑒定了p30的61～93位氨基酸之間的表位,該區(qū)域也被ASFV感染豬的血清識(shí)別,提示該區(qū)域是具有重要免疫功能的表位[24]。同時(shí)也鑒定了p30蛋白C端部分中的一個(gè)大多肽片段(120～204 aa)與高度柔性和潛在無(wú)序傾向區(qū)域(91～143 aa)部分重疊可能是 p30 蛋白的抗原表位區(qū)域,該結(jié)果與本研究的試驗(yàn)結(jié)果相似。本研究進(jìn)一步縮小了p30蛋白的抗原表位分布范圍。目前已有研究報(bào)道ASFV病毒顆粒[25]、p54蛋白[26]和p72[8]蛋白的結(jié)構(gòu)解析,但是沒有關(guān)于p30蛋白結(jié)構(gòu)解析的報(bào)道,故本研究通過(guò)I-TASSER軟件在線預(yù)測(cè)ASFV p30蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu),并標(biāo)注出p30單克隆抗體識(shí)別的抗原表位區(qū)域,為ASFV p30蛋白結(jié)構(gòu)的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究制備了2株非洲豬瘟病毒China/2018/AnhuiXCGQ-ASFV毒株p30蛋白的單克隆抗體,同時(shí)利用蛋白截短表達(dá)的方式鑒定了170I～K194是其識(shí)別的抗原表位區(qū)域,進(jìn)一步通過(guò)I-TASSER軟件在線預(yù)測(cè)ASFV p30蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu),并標(biāo)注出p30單克隆抗體識(shí)別的抗原表位區(qū)域,豐富了p30蛋白的抗原表位信息,為ASFV p30蛋白結(jié)構(gòu)的研究及血清學(xué)檢測(cè)方法的進(jìn)一步發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。