馮永智,龔 婷,吳東東,高 琦,鄭曉宇,張桂紅,3,4,孫彥闊,4*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇?廣州),廣州 510642;2.廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室,廣州 510642;3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心,茂名 525000;4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人畜共患病重點實驗室,廣州 510642)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒感染(African swine fever virus,ASFV)引起的野豬和家豬的一種急性高度致死性疾病[1]。ASFV屬于非洲豬瘟病毒科家族唯一成員,也是目前唯一已知的DNA蟲媒病毒[2]。作為一種大型的雙鏈DNA病毒,其基因組長度為170～193 bp,分為左側(cè)可變區(qū)、中央保守區(qū)和右側(cè)可變區(qū)[3]。ASFV病毒粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu),直徑為260～300 nm,有150多個開放閱讀框[4]。目前,ASFV已被鑒定出68種結(jié)構(gòu)蛋白和100多種非結(jié)構(gòu)蛋白,但是對于大部分蛋白功能的研究是有限的[5]。ASF自1921年出現(xiàn)以來已有百年歷史,2018年我國首次報道ASF疫情,給全國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失[6]。由于對病毒粒子的研究有限,應用于臨床的商業(yè)化疫苗仍在研制中[7]。

病毒生物學特性的研究及生物制品(如疫苗)制備均需要良好的體外細胞系,家豬為ASFV的終末宿主,因此研究病毒與宿主的互作機制通常使用豬源細胞作為體外模型。在豬體內(nèi),ASFV具有高度限制的細胞嗜性,原代單核細胞和豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophage,PAMs)是ASFV的主要靶細胞[8]。體外試驗中用到的PAMs感染模型,通常由約4周齡的SPF豬的肺泡灌洗液獲得[9]。豬肺泡巨噬細胞(3D4/21)則是由長白豬的肺中分離后經(jīng)過Psv3neo轉(zhuǎn)化的SV40大T抗原永生化細胞系[10],而豬腎上皮細胞(PK15)是由豬腎上皮細胞癌變而來的一種傳代細胞系[11],這兩種細胞系對多種豬源病毒均具有良好的感染能力,但未曾報道過3D4/21和PK15為ASFV的體外易感細胞系。

基于此,本研究通過對ASFV感染PAMs、3D4/21以及PK15細胞的全基因轉(zhuǎn)錄譜進行分析,并根據(jù)差異基因的GO功能富集與KEGG通路分析結(jié)果,分別對3D4/21和PK15細胞的生物學功能進行調(diào)節(jié),初步探究了影響ASFV體外感染的主要因素,為建立并完善ASFV體外細胞培養(yǎng)體系奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

ASFV GZ/2018毒株、3D4/21和PK15細胞系均由華南農(nóng)業(yè)大學傳染病教研室保存,PAMs通過4周齡仔豬的肺泡灌洗液獲得[12]。G1/S期抑制劑諾考噠唑(nocodazole)、G2/M期抑制劑帕比司他(panobinostat)和硫酸長春新堿(vincristine sulfate)均購自于Sigma公司。谷氨酰胺抑制劑BPTES、乙酰輔酶A羧化酶-α的變構(gòu)抑制劑TOFA、脂肪酸合成酶抑制劑C75、糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖(2-deoxy-D-glucose)均購自MCE。胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基和高糖DMEM培養(yǎng)基購自Thermo Fisher Scientific公司。NunclonTMSpheraTM細胞培養(yǎng)皿購自Thermo Fisher Scientific公司。Cell Counting Kit-8購自新賽美公司。ASFVB646L特異性引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 ASFV全基因轉(zhuǎn)錄譜分析

獲得有效的數(shù)據(jù)后與參考序列GCF_000 003 025.6_Sscrofa11.1(NCBI)進行比對。此后,進行差異表達分析以確定各比較組的差異表達基因(DEGs)。Fold change>2且P≤0.05的單基因被認為是明顯的差異表達。使用BGI的Dr.Tom多組學數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng),進行聚類熱圖和KEGG分析以及差異基因結(jié)果顯示。利用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對DEGs進行功能注釋和通路分析,并將結(jié)果圖示出來。

1.3 病毒感染

將PAMs、3D4/21、PK15接種于細胞培養(yǎng)皿,待細胞生長完全后,以MOI=1接種ASFV,放置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中2 h,然后用PBS洗滌3次,PAMs在10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基中維持,3D4/21和PK15在10%FBS DMEM培養(yǎng)基中維持。

1.4 細胞周期的調(diào)控與感染

應用G1/S期抑制劑諾考噠唑(nocodazole)、G2/M期抑制劑帕比司他(panobinostat)和硫酸長春新堿(vincristine sulfate)分別調(diào)控3D4/21、PK15細胞周期的同時并感染病毒,2 h后使用PBS洗滌3次,然后在含有藥物的培養(yǎng)基中維持。

1.5 細胞代謝的調(diào)控與感染

應用谷氨酰胺抑制劑BPTES、乙酰輔酶A羧化酶-α的變構(gòu)抑制劑TOFA、脂肪酸合成酶抑制劑C75、糖酵解抑制劑2-deoxy-D-glucose調(diào)控3D4/21、PK15細胞代謝的同時并感染病毒,2 h后使用PBS洗滌3次,然后在含有藥物的培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)。

1.6 用于檢測ASFV基因組拷貝數(shù)的實時定量PCR

使用DNA提取試劑盒提取ASFV感染細胞的DNA,使用SYBY qPCR Master Mix(Vazyme)在95 ℃,30 s進行預變性,然后在95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s進行40個循環(huán),最后在95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s生成熔解曲線。所使用B646L引物為中國動物疾病預防控制中心(CADC)推薦,正向引物:5′-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3′,反向引物:5′-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3′,探針:5′-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-3′。

1.7 目的蛋白Western blot分析

細胞經(jīng)裂解液充分裂解后取上清與上樣緩沖液混合均勻,煮沸10 min。將樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上,轉(zhuǎn)膜完畢后用5%脫脂乳封閉1 h,分別使用抗ASFV p30抗體、抗Tubulin抗體稀釋液孵育過夜;用TBST洗滌3次,每次15 min,使用二抗孵育45 min;TBST洗滌3次,每次15 min,掃描拍照成像。

1.8 統(tǒng)計分析

本試驗所有數(shù)據(jù)除全基因轉(zhuǎn)錄譜外,均通過GraphPad Prism 8T-test檢驗方法對數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析。**表示差異顯著(P<0.01);***表示差異極顯著(P<0.001)。

2 結(jié) 果

2.1 ASFV不能感染2D培養(yǎng)3D4/21和PK15細胞系

使用不含血清的培養(yǎng)基,以 1 MOI 的ASFV接種3D4/21、PK15和PAMs細胞,48 h收集細胞,反復凍融3次,提取樣本DNA,并進行熒光定量PCR檢測ASFVB646L基因的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,ASFV接種PAMs后的病毒拷貝數(shù)與對照組差異顯著,但是ASFV在接種3D4/21和PK15細胞后與對照組的病毒拷貝數(shù)無顯著差異(圖1)。結(jié)果表明ASFV不具有感染3D4/21和PK15細胞系的能力。

2.2 ASFV全基因組轉(zhuǎn)錄譜分析

基于上述結(jié)果,作者進一步分析了ASFV接種PAMs、3D4/21、PK15細胞后基因組轉(zhuǎn)錄譜的表達差異。從ASFV接種的PAMs、PK15和3D4/21中提取總RNA,通過聚類熱圖分析轉(zhuǎn)錄組學結(jié)果(圖2A,圖中橫坐標代表樣本名稱,縱坐標表示差異基因,顏色越深表示表達量越高),結(jié)果顯示不同組間基因表達量出現(xiàn)明顯分散,表明組間差異較大。作者通過火山圖可視化兩組之間差異基因整體分布情況,結(jié)果顯示,與PAMs相比,3D4/21細胞有4 023個差異基因上調(diào),3 393個基因下調(diào)(圖2C),PK15細胞有3 279個差異基因上調(diào),4 674個差異基因下調(diào)(圖2D)。KEGG通路富集分析表明,3D4/21、PK15細胞系與PAMs細胞的共同上調(diào)差異基因顯著富集在以下途徑:1)細胞黏附途徑中,如Src、Caveolin、RhoGEF、Vinculin等基因;2)細胞周期途徑中,如DP-1、DP-2、SCF、DNA-PK等基因;3)細胞代謝途徑中,如UGT1A6、GUSB、UGDH等基因(圖2B)。

A.全基因組轉(zhuǎn)錄譜熱圖;B.KEGG信號通路富集分析;C.PAMs與3D4/21細胞差異基因統(tǒng)計;D.PAMs與PK15細胞差異基因統(tǒng)計

2.3 懸浮培養(yǎng)顯著提高ASFV感染3D4/21和PK15細胞系能力

針對全基因組轉(zhuǎn)錄譜的分析結(jié)果,為了進一步探究細胞黏附對ASFV體外感染的影響,作者采用了懸浮培養(yǎng)以調(diào)節(jié)細胞的物理黏附環(huán)境。結(jié)果顯示,ASFV在懸浮培養(yǎng)的3D4/21和PK15細胞中病毒拷貝數(shù)、病毒滴度和p30蛋白表達水平顯著高于2D培養(yǎng)的3D4/21和PK15細胞(圖3A、B、C),但是隨著傳代次數(shù)的增加,ASFV在懸浮培養(yǎng)的細胞中的復制能力下降(圖3D)。以上結(jié)果表明,改變細胞物理黏附環(huán)境可以顯著提高ASFV感染3D4/21和PK15細胞系的能力,但隨著傳代次數(shù)的增加其復制能力逐漸下降。

A.2D培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)病毒拷貝數(shù);B.2D培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)病毒滴度;C.2D培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)病毒蛋白水平;D.連續(xù)懸浮培養(yǎng)病毒拷貝數(shù)

2.4 細胞周期對ASFV感染體外細胞系的影響

為了進一步探究細胞周期對ASFV感染體外細胞系的影響,首先使用Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒分別測定了3種細胞周期藥物對3D4/21(圖4A～C)和PK15(圖4D～F)細胞的毒性。接下來使用G1/S期抑制劑諾考噠唑(nocodazole,0.002 5 ng·mL-1)、G2/M期抑制劑帕比司他(panobinostat,0.002 5 ng·mL-1)和硫酸長春新堿(vincristine sulfate,0.05 ng·mL-1)調(diào)控3D4/21,使用諾考噠唑(0.1 ng·mL-1)、帕比司他(0.05 ng·mL-1)和硫酸長春新堿(0.006 25 ng·mL-1)調(diào)控PK15細胞的細胞周期并同時接種MOI=1的ASFV。使用qPCR檢測ASFVB646L基因,結(jié)果顯示,應用G1/S、G2/M期細胞周期抑制劑后,ASFV在3D4/21和PK15細胞中的病毒拷貝數(shù)與對照組無顯著差異(圖4G、H)。以上結(jié)果表明,細胞周期對ASFV在體外感染無顯著影響。

2.5 細胞代謝對ASFV感染體外細胞系的影響

最后探究了細胞代謝對ASFV感染體外細胞系的影響,使用CCK8細胞活性檢測試劑盒分別測定4種代謝藥物對3D4/21(圖5A～D)和PK15(圖5E～H)的細胞毒性。分別使用谷氨酰胺抑制劑BPTES(100 μg·mL-1)、乙酰輔酶A羧化酶-α的變構(gòu)抑制劑TOFA(40 μg·mL-1)、脂肪酸合成酶抑制劑C75(40 μg·mL-1)、糖酵解抑制劑2-deoxy-D-glucose(100 μg·mL-1)調(diào)控3D4/21細胞代謝途徑,使用谷氨酰胺抑制劑BPTES(80 μg·mL-1)、乙酰輔酶A羧化酶-α的變構(gòu)抑制劑TOFA(100 μg·mL-1)、脂肪酸合成酶抑制劑C75(20 μg·mL-1)、糖酵解抑制劑2-deoxy-D-glucose(100 μg·mL-1)調(diào)控PK15細胞代謝途徑,并同時接種1 MOI的ASFV。通過qPCR檢測ASFVB646L基因,結(jié)果顯示,調(diào)控細胞代謝途徑后,ASFV在3D4/21和PK15細胞中的病毒拷貝數(shù)與對照組無顯著差異(圖5I、J)。以上結(jié)果表明,細胞代謝途徑對ASFV在體外感染無顯著影響。

3 討 論

PAMs為研究ASFV的生物學特性提供了良好的體外模型,但是原代細胞的制作成本昂貴且耗時,同時,由于供體動物健康狀況的差異可能導致不同批次細胞存在高度差異性,這種差異性可能會阻礙ASFV與宿主相互作用的研究。雖然有報道稱,ASFV能夠在已建立的一些非宿主細胞系中復制,但是病毒的復制效率較低并且堿基容易發(fā)生變異,嚴重限制了ASFV與宿主互作的研究[13]。已有報道表明,Ⅰ型ASFV的BA71V毒株可以在非洲綠猴腎細胞(Vero)中增殖,但是隨著傳代次數(shù)的增加,病毒基因存在不同程度的點突變或缺失,并且喪失其在巨噬細胞中復制的能力,BA71V毒株適應在Vero中生長后,其毒力完全喪失[14-17]。同樣作為免疫抑制性疾病,豬繁殖與呼吸綜合征病毒對非洲猴腎上皮細胞(Marc-145)系具有良好的感染能力,但是最近有研究發(fā)現(xiàn)Marc-145無法持續(xù)維持ASFV的復制[18]。此外,商業(yè)化豬傳代細胞系,如永生化豬腎巨噬細胞(IPKM)、Zuckerman巨噬細胞-4(ZMAC-4)、普拉姆島豬上皮細胞(PIPEC)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)對ASFV具有良好的復制能力,可應用于ASFV的生物學特性研究,但以上細胞系對ASFV體外連續(xù)傳代和感染能力的決定性因素尚未研究[19-21]。

本試驗通過對ASFV的易感細胞系PAMs和非易感細胞系3D4/21、PK15進行全基因轉(zhuǎn)錄譜的分析,發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在細胞黏附等功能上。使用懸浮培養(yǎng)的3D4/21、PK15細胞系對ASFV的體外感染條件進行探究,發(fā)現(xiàn)可以顯著提高ASFV對3D4/21、PK15細胞的感染能力,但是隨著傳代次數(shù)的增加,懸浮培養(yǎng)不能保持病毒的復制能力,這可能是由于毒株在傳代過程發(fā)生的基因突變所致。據(jù)報道,細胞培養(yǎng)的器材基質(zhì)的固有化學或物理特性會影響細胞的黏附,從而會進一步影響細胞的生物學功能[22]。因此與傳統(tǒng)的細胞貼壁培養(yǎng)方式相比,懸浮培養(yǎng)能夠最大程度地發(fā)揮細胞的生物學潛能,目前此方式已廣泛應用于病毒培養(yǎng)中。

4 結(jié) 論

通過懸浮培養(yǎng)調(diào)控細胞黏附后,可顯著提高ASFV感染3D4/21和PK15細胞系的能力,但復制能力隨傳代次數(shù)的增加而下降,但是通過調(diào)控細胞周期和細胞代謝對ASFV感染3D4/21和PK15細胞系的能力無顯著影響。本研究為ASFV體外細胞系的建立奠定了一定的研究基礎。