王婉潔,陳南珠,鄒惠影,周心儀,郝海生,龐云渭,朱化彬,趙學(xué)明,余大為,杜衛(wèi)華

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

卵巢卵泡是決定雌性哺乳動(dòng)物生殖壽命、不可再生的基本功能單位[1]。在卵泡中,卵丘細(xì)胞(cumulus cells,CCs)是包裹卵母細(xì)胞的重要體細(xì)胞,屬于顆粒細(xì)胞(granulosa cells,GCs),對(duì)卵巢發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育有重要調(diào)控作用[2]。CCs與卵母細(xì)胞形成卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complex,COCs),通過(guò)縫隙連接進(jìn)行物質(zhì)交換來(lái)調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟,為早期胚胎的發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。CCs的增殖與卵泡發(fā)育密切相關(guān),凋亡可引起卵泡閉鎖,其增殖和凋亡之間的相對(duì)平衡對(duì)卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟有至關(guān)重要的影響[4]。

在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過(guò)程中,存在廣泛的表觀遺傳修飾。組蛋白甲基化作為一種重要的表觀調(diào)控機(jī)制,在基因的表達(dá)及沉默、細(xì)胞分化、異染色質(zhì)形成、基因印跡等方面發(fā)揮著重要作用[5]。組蛋白甲基化也參與卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控[6-7],可以改變卵泡的發(fā)育命運(yùn)。缺失的、小的、同源異形1(absent,small,or homeotic 1-like,ASH1L)是組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,由位于染色體帶1q22的ash1 l基因編碼,首次發(fā)現(xiàn)于果蠅[8],因其基因突變導(dǎo)致的同源異形的表型與三胸腔結(jié)構(gòu)蛋白(trithorax,Trx)的突變體相似而被歸類于TrxG蛋白家族[9]。牛ASH1L蛋白含有2 965個(gè)氨基酸,包含SET(su(var)3-9,enhancer-of-zeste and trithorax)、AWS(associate with SET)、Post-SET、Bromo和BAH(bromo adjacent homology)等已知結(jié)構(gòu)域,其中SET域具有催化功能,負(fù)責(zé)將一個(gè)甲基從S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)輔助因子轉(zhuǎn)移到賴氨酸底物[10]。在哺乳動(dòng)物中,ASH1L可特異性催化H3K36甲基化,是染色質(zhì)的激活標(biāo)記[9,11]。在果蠅的活性基因中,ASH1能通過(guò)干擾核小體上多梳抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex2,PRC2)的活性來(lái)抑制H3K27甲基化,從而促進(jìn)基因表達(dá)[12]。Ash1 l突變導(dǎo)致部分仔鼠出生后死亡,存活的突變小鼠則存在小鼠附睪(雄性)和子宮(雌性)發(fā)育缺陷導(dǎo)致的生長(zhǎng)不足和不育[13]。在牛CCs中,下調(diào)ASH1 L表達(dá)可降低H3K36 me1/2/3水平,抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。在小鼠中,Ash1 l通過(guò)調(diào)控Hox(Homebox gene)和Smad3(drosophila mothers against decapentaplegic protein 3)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[15]。通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠減數(shù)分裂前期I中p63和p-CHK2的表達(dá),Ash1 l可保護(hù)卵母細(xì)胞基因組的完整性,清除具有嚴(yán)重DNA損傷的卵母細(xì)胞;過(guò)表達(dá)Ash1 l可通過(guò)調(diào)節(jié)DNA損傷而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致胎兒中卵母細(xì)胞的急劇丟失和原始卵泡池的容量減少[16]。

綜上所述,ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)研究主要集中于果蠅、小鼠及人,而其在調(diào)控家畜細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育方面的作用還未被揭示。本研究以牛CCs為試驗(yàn)對(duì)象,研究ASH1L過(guò)表達(dá)對(duì)牛CCs中H3K36甲基化狀態(tài)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響,為深入研究組蛋白甲基化酶ASH1L對(duì)牛CCs生長(zhǎng)的調(diào)控作用提供依據(jù),為卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

如無(wú)特殊說(shuō)明,本研究所用試劑均購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)基、TCM199、0.25%胰酶、血清和DPBS購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;ASH1L兔多克隆抗體購(gòu)自Bethyl Laboratories公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司;高靈敏度化學(xué)發(fā)光液測(cè)試試劑盒購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司;H3K36 me1/2/3兔多克隆抗體購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司;AlexaFluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Cell Signaling Technology(CST)公司。

1.2 ASH1L過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

參考Xia等[17]的報(bào)道,ASH1L SET結(jié)構(gòu)域具有甲基轉(zhuǎn)移酶功能;本試驗(yàn)按照NCBI提供的牛ASH1L基因的編碼序列(登錄號(hào):NC_037 330.1),擴(kuò)增包括SET結(jié)構(gòu)域的第2 141位氨基酸到終止密碼子的ASH1L片段,長(zhǎng)度為2 478 bp。根據(jù)目的片段設(shè)計(jì)攜帶kozak(GCCACC)、起始密碼子(ATG)及NheI(CTAGCTAGC)和NotI(ATAGTTTAGCGGCCGC)酶切位點(diǎn)的引物,由北京六合華大基因科技有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。以牛CCs的cDNA為模板,采用PCR擴(kuò)增目的片段,PCR反應(yīng)條件為:98 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性10 s,60 ℃退火1 min,68 ℃延伸1.5 min,35個(gè)循環(huán);68 ℃延伸5 min,4 ℃保持。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后,鑒定獲得序列長(zhǎng)度符合預(yù)期的片段。T4連接酶將該片段連接到經(jīng)NheI/NotI雙酶切的pcDNA3.1載體上,轉(zhuǎn)化細(xì)菌,并挑菌測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1+ASH1L,并用去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取試劑盒(OMEGA,美國(guó))提取、純化質(zhì)粒,-20 ℃保存,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 牛CCs的體外培養(yǎng)

參照Wang等[18]的文獻(xiàn),從當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)收集牛卵巢,用含100 IU·mL-1青霉素和100 mg·mL-1硫酸鏈霉素(1% PS)的30 ℃生理鹽水洗滌,2～3 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。從2～6 mm卵泡中抽出COCs,用含10%血清(FBS)、0.01 IU·mL-1卵泡刺激激素(FSH)、1 IU·mL-1黃體生成素(LH)、1 μg·mL-1雌二醇(E2)、10 μg·mL-1肝素(HP)、40 ng·mL-1胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)和50 ng·mL-1上表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的TCM199配制成的成熟液于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)22 h。用0.1%透明質(zhì)酸酶消化成熟后的COCs,2 min后加入預(yù)熱、含10% FBS的TCM199終止消化。將CCs懸浮液移入離心管,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清。用DPBS離心洗滌兩次后,DMEM/F12培養(yǎng)基(含10% FBS和1% PS)重懸細(xì)胞沉淀,混勻移入六孔板,于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

六孔板中接種的細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%匯合度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。先用Opti-MEMTM培養(yǎng)基稀釋LipofectamineTM3 000試劑,充分混勻后室溫靜置5 min;同時(shí)用Opti-MEMTM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒DNA,制備DNA預(yù)混液,添加P3000TM增強(qiáng)劑,充分混勻;然后按1∶1的比例混和已稀釋的LipofectamineTM3000和質(zhì)粒DNA,形成DNA-脂質(zhì)復(fù)合物,室溫孵育10～15 min。隨后將DNA-脂質(zhì)復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中,于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),6 h后更換為DMEM/F12培養(yǎng)基(含10% FBS和1% PS),24 h收集細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+ASH1L載體的細(xì)胞為過(guò)表達(dá)組(ASH1L-OE),未轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞為對(duì)照組(Control)。

1.5 熒光定量PCR(quantitative RT-PCR,RT-qPCR)

載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h,分別收集對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞,參照動(dòng)物細(xì)胞RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)(QIAGEN,德國(guó))提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD,美國(guó))進(jìn)行基因表達(dá)水平的定量檢測(cè)。選擇的基因包括牛ASH1 L、BCL-2、BCL-2相關(guān)X蛋白(BCL-2 associated X,BAX)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase,CASPASE-3)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,CDC42)、周期素D2(cyclin D2,CCND2)和GAPDH。以上基因的引物參考Tian等[19]的研究,并由北京六合華大基因科技有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為20 μL:上、下游引物各0.4 μL,cDNA模板2 μL,TB green Premix EX Taq(Tli RNaseH Plus)10 μL,ddH2O 6.8 μL,ROX Reference Dye II 0.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次,以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量,ΔΔCt=[(Ctgene-CtGAPDH)]過(guò)表達(dá)組-[(Ctgene-CtGAPDH)]對(duì)照組。

1.6 免疫熒光染色

將細(xì)胞預(yù)先接種到細(xì)胞共聚焦培養(yǎng)皿中,細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒,24 h后將對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。用DPBS清洗細(xì)胞3次,4%多聚甲醛室溫固定1 h,并于0.2% Triton X-100中通透40 min。用含1% BSA的DPBS(DPBS+1% BSA)清洗3次,每次5 min,細(xì)胞于DPBS+1% BSA中37 ℃封閉1 h。用含0.02% Triton X-100和1%BSA的DPBS清洗3次后,細(xì)胞于一抗(兔來(lái)源H3K36 me1/2/3抗體的稀釋比例為1∶200,兔來(lái)源ASH1L抗體的稀釋比例為1∶50)中4 ℃孵育過(guò)夜;清洗3次,于二抗(Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG稀釋比例為1∶1 000)中37 ℃孵育1 h。清洗3次后,細(xì)胞于1.5 μg·mL-1DAPI液中室溫、避光孵育5 min;清洗后,于激光共聚焦顯微鏡(Leica,德國(guó))下觀察,并收集圖像。采用Image J軟件對(duì)免疫熒光圖片的信號(hào)進(jìn)行分析。每個(gè)試驗(yàn)至少進(jìn)行3次重復(fù),數(shù)據(jù)值的平均值即為該組的熒光強(qiáng)度值。以對(duì)照組熒光強(qiáng)度值為參考,采用歸一法進(jìn)行相對(duì)熒光強(qiáng)度分析。

1.7 蛋白免疫印跡(western blotting,WB)

載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h,分別收集對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞,加入200 μL含1%抑制劑PMSF的細(xì)胞裂解液,冰上靜置20～30 min,振蕩使細(xì)胞充分裂解,細(xì)胞懸液于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(金浦來(lái),中國(guó))測(cè)定蛋白濃度。取上清與緩沖液(1∶5)混合,震蕩混勻,100 ℃變性10 min。變性蛋白經(jīng)4%～15%梯度SDA-PAGE凝膠電泳分離,之后300 V、200 mA將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,濾膜于兔源ASH1L一抗(稀釋比例1∶1 000)中4 ℃孵育過(guò)夜;TBST清洗3次后,濾膜于HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例1∶5 000)中37 ℃孵育1 h,TBST清洗3次后,用ECL發(fā)光液試劑盒顯影,于化學(xué)發(fā)光儀(天能,中國(guó))中曝光,拍照保存。

1.8 細(xì)胞增殖檢測(cè)

根據(jù)CCK-8試劑盒(碧云天,中國(guó))說(shuō)明書(shū),貼壁CCs用0.25%胰酶消化、DPBS洗滌后,按照2×103個(gè)·mL-1的密度,把細(xì)胞接種到96孔板中。培養(yǎng)24 h后,將pcDNA3.1+ASH1L質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CCs,并分別于轉(zhuǎn)染0、24、36、48、72 h,每孔加入10 μL WST-8試劑,避光孵育2 h,用酶標(biāo)記儀(Tecan,瑞士)檢測(cè)450 nm處的吸光值。對(duì)照組細(xì)胞也進(jìn)行同樣處理,記錄各時(shí)間段的吸光值。

1.9 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Annexin V-FITC/碘化丙啶(Propidium iodide,PI)熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天,中國(guó))進(jìn)行凋亡分析。載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h,將對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組CCs用0.25%胰酶消化,終止消化后收集細(xì)胞懸液,1 000 r·min-1離心5 min。PBS洗滌細(xì)胞,離心獲得的細(xì)胞用Annexin V-FITC/PI室溫染色10 min。采用FACSVerse流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson,美國(guó))進(jìn)行活細(xì)胞率、壞死細(xì)胞率、早期凋亡率和晚期凋亡率的計(jì)算分析,凋亡率為早期凋亡率與晚期凋亡率之和。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)3次,試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析,用單因素方差分析(One-way ANOVA)判斷不同處理間的差異顯著性,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 ASH1L過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

牛ASH1L cDNA全長(zhǎng)接近9 kb,構(gòu)建攜帶該基因全長(zhǎng)序列的過(guò)表達(dá)載體較為困難。通過(guò)對(duì)ASH1L各結(jié)構(gòu)域的位置和功能分析(圖1A),本研究擬從其SET結(jié)構(gòu)域的起始氨基酸位點(diǎn)(第2 141)開(kāi)始,終止密碼子氨基酸為終點(diǎn),擴(kuò)增ASH1L基因片段,替代ASH1L全長(zhǎng)序列。以牛CCs cDNA為模板,PCR擴(kuò)增獲得包含牛ASH1L基因片段(長(zhǎng)2 487 bp)、kozak序列、雙酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基的序列(長(zhǎng)2 512 bp,圖1B),并將其連接于pcDNA3.1載體。成功連接的載體經(jīng)NheI/NotI雙酶切,獲得長(zhǎng)度分別為5 351和2 512 bp的兩條片段(圖1C),與預(yù)期結(jié)果一致;對(duì)酶切鑒定正確的載體進(jìn)行測(cè)序,序列正確的載體即為成功構(gòu)建的ASH1L過(guò)表達(dá)載體,命名為pcDNA3.1+ASH1L,全長(zhǎng)7 838 bp(圖1D),可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A.牛ASH1L蛋白的氨基酸序列及包含的結(jié)構(gòu)域;B.以牛CCs cDNA為模板,PCR擴(kuò)增目的片段,長(zhǎng)2 512 bp;C.過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1+ASH1L雙酶切鑒定,泳道1、2、3、5為載體酶切后獲得的兩條片段,泳道4為未能被酶切的載體;D.過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1+ASH1L構(gòu)建策略

2.2 牛CCs中ASH1L過(guò)表達(dá)效果的驗(yàn)證

為評(píng)估轉(zhuǎn)染效率,將上述pcDNA3.1+ASH1L質(zhì)粒和pmaxGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染牛CCs。24 h后,鏡下可見(jiàn)綠色熒光(圖2A),通過(guò)流式分選出陽(yáng)性細(xì)胞的比例約為75.83%(圖2B),可見(jiàn)轉(zhuǎn)染效率較高。pcDNA3.1+ASH1L轉(zhuǎn)染CCs,24 h收集過(guò)表達(dá)組細(xì)胞(ASH1L-OE);同時(shí)收集常規(guī)培養(yǎng)的CCs作為對(duì)照組(Control),采用RT-qPCR、WB和免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞中ASH1L mRNA及其蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中ASH1L mRNA水平極顯著高于對(duì)照組(P<0.01,圖2C)。與內(nèi)源性ASH1L蛋白的分子量不同,外源ASH1L蛋白的分子量約為92 ku,過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中可檢測(cè)到92 ku的目的蛋白條帶,而對(duì)照組則沒(méi)有檢測(cè)到(圖2D),說(shuō)明過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中有外源ASH1L蛋白的表達(dá)。此外,過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中ASH1L蛋白的免疫熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著升高(P<0.05,圖2E)。可見(jiàn),本試驗(yàn)構(gòu)建的pcDNA3.1+ASH1L載體能在CCs中表達(dá),可用于后續(xù)試驗(yàn)。

A.質(zhì)粒pcDNA3.1+ASH1L和pmaxGFP共轉(zhuǎn)染牛CCs 24 h后可觀察到綠色熒光;B.轉(zhuǎn)染24 h后流式分選出陽(yáng)性細(xì)胞;C.過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后,ASH1L mRNA表達(dá)水平;D.過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后,ASH1L蛋白表達(dá)量;E.過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后,ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶的熒光染色及相對(duì)熒光強(qiáng)度。*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下同

2.3 過(guò)表達(dá)ASH1L對(duì)CCs中H3K36甲基化狀態(tài)的影響

ASH1L過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛CCs 24 h后,細(xì)胞中H3K36 me1/2甲基化水平顯著升高(P<0.05,圖3A,3B),H3K36 me3水平高于對(duì)照組,但差異不顯著(P>0.05,圖3C)。

A,B,C.過(guò)表達(dá)ASH1L后,牛CCs中H3K36me1/2/3甲基化的熒光染色及其相對(duì)熒光強(qiáng)度

2.4 過(guò)表達(dá)ASH1L對(duì)CCs增殖的影響

ASH1L過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CCs 24和36 h后,細(xì)胞增殖率顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05);但在轉(zhuǎn)染48 h時(shí),兩組間的細(xì)胞增殖率差異不顯著(P>0.05,圖4A)。ASH1L表達(dá)上調(diào)后,細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA、CCND2 mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05,圖4B、4C);而CDC42表達(dá)水平在兩組間差異不顯著(P>0.05,圖4D)。

2.5 過(guò)表達(dá)ASH1L對(duì)CCs凋亡的影響

ASH1L過(guò)表達(dá)組的活細(xì)胞率((91.85±1.25)%)顯著高于對(duì)照組((87.39±1.71)%),而細(xì)胞凋亡率((8.08±1.21)%)則顯著低于對(duì)照組((12.51±1.72)%,P<0.05)(圖5A)。相應(yīng)地,過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中促凋亡基因BAX和CASPASE-3 mRNA表達(dá)水平分別極顯著(P<0.01)和顯著地(P<0.05)低于對(duì)照組,而抗凋亡基因BCL-2 mRNA表達(dá)水平則極顯著地高于對(duì)照組(P<0.01,圖5B)。

3 討 論

一般組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶均包含SET結(jié)構(gòu)域,可催化組蛋白氨基酸的甲基化修飾。ASH1L首次發(fā)現(xiàn)于果蠅,具有保守的SET結(jié)構(gòu)域,屬于三胸腔結(jié)構(gòu)蛋白(TrxG)家族,能催化H3K4和H3K36甲基化激活基因表達(dá)[20],從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、胚胎發(fā)育及自身免疫應(yīng)答等過(guò)程[21]。本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體上調(diào)牛CCs中ASH1L表達(dá),并對(duì)細(xì)胞中組蛋白甲基化修飾、細(xì)胞凋亡與增殖,及其相關(guān)基因表達(dá)的變化進(jìn)行深入研究。

據(jù)報(bào)道,小鼠ASH1L蛋白SET結(jié)構(gòu)域中第2 212位氨基酸的突變能破壞其甲基轉(zhuǎn)移酶活性,導(dǎo)致H3K4甲基化水平降低,成骨和軟骨形成受阻,所以ASH1L SET結(jié)構(gòu)域催化H3K4甲基化活性對(duì)于成骨和軟骨細(xì)胞分化是不可或缺的[22]。另外,含有Ash1L SET結(jié)構(gòu)域片段的載體能達(dá)到過(guò)表達(dá)的效果,并誘導(dǎo)H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶活性,增強(qiáng)去泛素化酶的表達(dá),抑制白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子的產(chǎn)生[17];然而,ASH1L SET結(jié)構(gòu)域的抑制劑AS-99在白血病細(xì)胞中表現(xiàn)出了顯著的抗白血病活性,可顯著阻斷人白血病細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化[23]。通過(guò)擴(kuò)增ASH1L C端的部分片段(1 892～2 969aa)成功構(gòu)建了ASH1L過(guò)表達(dá)質(zhì)粒來(lái)替代人的ASH1L的全長(zhǎng)載體[24]。以上研究表明,ASH1L蛋白甲基化修飾的活性是由其中的SET結(jié)構(gòu)域來(lái)維持的。所以,為了克服由于牛ASH1L cDNA較長(zhǎng)而難以構(gòu)建全長(zhǎng)載體的問(wèn)題,本研究擴(kuò)增了含有SET結(jié)構(gòu)域的牛ASH1L基因片段,構(gòu)建了ASH1L過(guò)表達(dá)載體。該載體導(dǎo)入牛CCs后,細(xì)胞中H3K36甲基化水平和細(xì)胞增殖率升高,細(xì)胞凋亡率降低,與已有的研究結(jié)果一致。可見(jiàn),牛ASH1L基因中SET結(jié)構(gòu)域的片段可代替全長(zhǎng)序列用于基因過(guò)表達(dá)研究。

ASH1L在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育[25]、肌肉萎縮癥發(fā)病機(jī)制[21]和免疫細(xì)胞發(fā)育[26]等方面均發(fā)揮重要作用。組蛋白賴氨酸的甲基化修飾與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。在果蠅和哺乳動(dòng)物中,ASH1L可甲基化轉(zhuǎn)錄激活標(biāo)記H3K36,調(diào)控發(fā)育基因的表達(dá)[21]。在人的分化神經(jīng)祖細(xì)胞(neuroepithelial cells,NPC)中,ASH1L能催化H3K36me2甲基化,其缺失降低了參與大腦發(fā)育的基因表達(dá),這表明受損的神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)可能是連接ASH1L的關(guān)鍵分子機(jī)制[27]。在人的前列腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ASH1L顯著增加了H3K36me2的總體水平,但對(duì)H3K4me2/3水平?jīng)]有顯著影響[24]。ASH1L已被確定為驅(qū)動(dòng)混合譜系白血病(Mixed linkage leukemia,MLL1)的致癌復(fù)合物的關(guān)鍵成分。在這種惡性腫瘤中,ASH1L被H3K36me2標(biāo)記,這些標(biāo)記被讀取蛋白(如晶狀體上皮衍生生長(zhǎng)因子)“讀取”,導(dǎo)致關(guān)鍵白血病驅(qū)動(dòng)因素(如HOX基因)的激活[28]。作為轉(zhuǎn)錄延伸因子,果蠅TrxG家族的KISMET與基因激活有關(guān),其通過(guò)促進(jìn)ash1l催化H3K36me2/3甲基化,從而激活轉(zhuǎn)錄發(fā)生[29]。在利什曼原蟲(chóng)中,多諾瓦尼乳桿菌能可通過(guò)Ash1L介導(dǎo)的H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控宿主的巨噬細(xì)胞極化;在感染后的巨噬細(xì)胞中敲低Ash1L基因表達(dá)顯著抑制了H3K4me3活性和細(xì)胞增殖,顯著減緩了炎癥發(fā)生[30]。在MLL-AF9誘導(dǎo)的白血病中,ASHIL可通過(guò)直接結(jié)合基因啟動(dòng)子,并修飾局部組蛋白H3K36me2水平來(lái)激活MLL-AF9靶基因的表達(dá)[31]。此外,ASH1L基因的低表達(dá)導(dǎo)致了牛CCs中H3K36me1/2/3甲基化水平均顯著降低以及PRC2蛋白相關(guān)亞基EZH2和SUZ12基因表達(dá)量的升高[32]。本研究過(guò)表達(dá)ASH1L基因后,牛CCs中H3K3單甲基化、二甲基化水平均顯著升高,三甲基化水平也升高但不顯著,說(shuō)明ASH1L可調(diào)控H3K36甲基化修飾,與之前的研究結(jié)果一致。

ASH1L廣泛表達(dá)于大腦、心臟和腎臟等多種組織器官[33]。在小鼠骨質(zhì)疏松的骨骼中,Ash1 l表達(dá)水平顯著降低;野生型(wild type,WT)小鼠中敲降A(chǔ)sh1 l基因可導(dǎo)致小鼠關(guān)節(jié)炎,并抑制小鼠成骨和軟骨形成[22]。ASH1L表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致MLL白血病細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)停滯,并在體內(nèi)終止了MLL白血病的發(fā)展[34]。在人中,ASH1L通常位于細(xì)胞核和細(xì)胞間緊密連接處,通過(guò)甲基化組蛋白H3K4和H3K36促進(jìn)基因表達(dá),并拮抗由Polycomb蛋白介導(dǎo)的基因沉默。敲低ASH1L誘導(dǎo)了前列腺癌細(xì)胞的周期停滯和凋亡[24]。同樣地,牛CCs中ASH1L基因的表達(dá)下調(diào)后,促凋亡相關(guān)基因CASPASE-3和BAX表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率均顯著升高,說(shuō)明ASH1L表達(dá)的缺失可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。相反地,在小鼠的生殖系統(tǒng)中,Ash1l過(guò)表達(dá)導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂修復(fù)的缺失,卵母細(xì)胞減數(shù)分裂前期中p63和磷酸化檢查點(diǎn)激酶2(p-CHK2)異常上調(diào),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致卵母細(xì)胞大量丟失;而凋亡抑制劑則可以挽救過(guò)表達(dá)Ash1l引起的卵母細(xì)胞丟失[16]。本試驗(yàn)過(guò)表達(dá)ASH1L顯著降低了牛CCs中CASPASE-3及BAXmRNA表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率,顯著升高了BCL-2 mRNA表達(dá)量和活細(xì)胞率,所以上調(diào)ASH1L表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),抑制細(xì)胞凋亡,但具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

細(xì)胞增殖參與生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等許多重要的生命活動(dòng)[35]。在卵泡發(fā)育過(guò)程中,PCNA表達(dá)水平的升高是顆粒細(xì)胞增殖的最早標(biāo)記物[36]。細(xì)胞周期蛋白D2(cyclin D2,CCND2)的缺乏會(huì)阻礙卵巢中的顆粒增殖和卵泡生長(zhǎng),導(dǎo)致雌性小鼠不育[37]。上調(diào)細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division cycle protein 42,CDC42)可抑制雞GCs細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖[38]。ASH1L過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了乳腺癌和肝癌細(xì)胞的增殖,并導(dǎo)致侵襲性疾病的突發(fā)[34,39]。ASH1L基因表達(dá)與人和小鼠成肌細(xì)胞的融合呈正相關(guān),其缺失會(huì)導(dǎo)致肌肉細(xì)胞中選擇性成肌細(xì)胞融合缺陷,不利于骨骼肌組織的形成、生長(zhǎng)和修復(fù)[21]。在受傷小鼠中,ASH1L的突變使其表達(dá)異常升高后,會(huì)導(dǎo)致表皮細(xì)胞分化紊亂,角質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖,傷口愈合缺陷及皮膚增生[40]。本研究結(jié)果表明,上調(diào)牛CCs中ASH1L表達(dá),則細(xì)胞增殖率、增殖相關(guān)基因PCNA、CCND2 mRNA表達(dá)量均顯著升高,與已有的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了牛ASH1L過(guò)表達(dá)載體,并建立過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型。在牛CCs中,過(guò)表達(dá)ASH1L顯著提高了H3K36me1/2甲基化水平,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,為揭示ASH1L甲基轉(zhuǎn)移酶在家畜CCs生長(zhǎng)和卵泡發(fā)育中的功能和調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。