張寒月,趙 丹,梁 煜,趙弼時,范蒙丹,喬利英,劉建華,楊凱捷,潘洋洋,劉文忠

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,太谷 030801)

脂肪沉積的過程十分復(fù)雜,而廣靈大尾羊尾部脂肪的含量在動物體脂肪沉積中占較大比例,脂肪沉積量的提高在綿羊養(yǎng)殖中具有重要意義[1-3]。羊尾脂作為動物皮下脂肪組織的一類,是在惡劣生存環(huán)境下通過自然選擇遺傳進(jìn)化而來的,不僅能為胴體提供日常營養(yǎng)[4],還能為對抗缺水少糧的惡劣環(huán)境提供能量[5]。此外,羊尾脂在工業(yè)方面、醫(yī)藥方面、飲食方面都發(fā)揮著重要的作用[6]。機(jī)體多余的能量以甘油三酯為最主要的存在形式存儲于綿羊尾部的白色脂肪組織中[7],在能量平衡中起著不可或缺的作用,為機(jī)體提供所需的大量熱能[8]。脂肪細(xì)胞作為脂肪組織的主要成員之一,受調(diào)控因子的影響進(jìn)而決定脂肪組織的沉積量。許多研究表明,microRNAs(miRNAs)等調(diào)控因子直接或間接參與脂肪組織發(fā)育以及能量代謝[9]。研究脂肪細(xì)胞的細(xì)胞發(fā)育和能量代謝中發(fā)揮重要作用的調(diào)控因子及其作用機(jī)制具有重要意義。

miRNAs是小的內(nèi)源性RNA,由大約22個核苷酸組成,miRNAs(從核苷酸2到8)與靶標(biāo)mRNA的3′非翻譯區(qū)域(UTR)互補(bǔ)性介導(dǎo),從而抑制mRNA翻譯[10]。miRNAs在不同的物種有較高的保守性,這表明它們在生物體生理學(xué)中具有重要作用,參與關(guān)鍵的細(xì)胞過程和疾病[11-13]。在miRNAs中,miR-150被稱為循環(huán)miRNA,參與脂蛋白運(yùn)輸?shù)倪^程[14-16]。bta-miR-150通過靶向mTOR信號通路中的AKT1,抑制牛前體脂肪細(xì)胞的分化[17]。miR-150可以通過調(diào)節(jié)小鼠B細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞的相互作用來調(diào)節(jié)肥胖相關(guān)的胰島素抵抗和組織炎癥[14]。miR-150對B細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要,并通過調(diào)節(jié)脂肪組織B細(xì)胞功能抑制肥胖相關(guān)的炎癥[18]。綜上,miR-150影響著各物種機(jī)體的脂質(zhì)代謝,但miR-150對廣靈大尾羊的尾部脂肪發(fā)育過程的影響尚不清楚。

含銅胺氧化酶3(amine oxidase copper contatining 3,AOC3),又稱為血管凋亡誘導(dǎo)蛋白1(vascular apoptosis-inducing protein 1,VAP1)。AOC3在哺乳動物組織中的分布范圍很廣,在脂肪細(xì)胞和脂肪組織中表現(xiàn)出相對較高的表達(dá)[19]。AOC3與白細(xì)胞外滲到發(fā)炎組織中有關(guān),被作為粘附蛋白。但在脂肪細(xì)胞中AOC3被認(rèn)為不作為粘附蛋白起作用,其作用可能是參與胰島素信號傳導(dǎo)和脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)[20]。小鼠敲除AOC3,可減少白細(xì)胞浸潤到脂肪組織中,有利于小鼠脂肪沉積[21]。在豬中,AOC3是DNA甲基化的候選基因之一,且通過DNA甲基化來調(diào)控脂肪的沉積,進(jìn)而影響肥胖癥[22]。綜上,AOC3在脂肪代謝中有著重要的作用,但AOC3在脂肪細(xì)胞發(fā)育過程中的作用機(jī)制尚不明確。

本研究基于本課題組前期的測序結(jié)果及幼齡動物的組織細(xì)胞比老齡動物的組織細(xì)胞更易于培養(yǎng)的經(jīng)驗,在5日齡的廣靈大尾羊中采集試驗材料。旨在研究miR-150通過靶向AOC3的3′-UTR調(diào)控綿羊前體脂肪的分化,調(diào)控脂肪的沉積作用,更為清晰的闡述miRNA通過靶向下游靶基因的3′-UTR調(diào)控綿羊脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品的采集 在實(shí)驗室內(nèi)采集5日齡廣靈大尾羊的尾部脂肪,采樣步驟如下:屠宰后,立刻用剃毛器除去廣靈大尾羊的尾部毛發(fā),露出尾部皮膚,防止毛發(fā)污染脂肪組織。用手術(shù)刀在尾部皮膚上開出創(chuàng)口,使得尾部脂肪暴露于表面。用無菌的手術(shù)剪與手術(shù)鑷將脂肪組織與動物體分離,分離時盡量避開尾部的血管。分離后,先在75%的酒精中清洗脂肪組織,之后轉(zhuǎn)移至含有1%雙抗(青霉素與鏈霉素)的預(yù)冷PBS(phosphate buffered solution)中,冰上保存,立刻帶入細(xì)胞房中,在超凈臺中進(jìn)行組織分離與細(xì)胞培養(yǎng)。

1.1.2 儀器與試劑 Ⅱ型膠原酶、牛胰島素、羅格列酮、地塞米松、IBMX和油紅O染色試劑購自索萊寶生物有限公司;TB Green?Premix Ex TaqTMII、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和Trizol試劑購自TaKaRa公司;細(xì)胞培養(yǎng)級PBS、高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶和雙抗購自Gibco公司;胎牛血清購自Dcell公司;蛋白裂解試劑盒與蛋白凝膠制備試劑盒購自BOSTER公司;AOC3抗體購自Proteintech公司;β-actin抗體購自Immunoway公司;膠回收與質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司;轉(zhuǎn)染試劑Lip3000購自Invitrogen公司;Dual-Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 脂肪組織的分離與細(xì)胞培養(yǎng) 將待分離的脂肪組織放入少量含1%雙抗的PBS的6 cm培養(yǎng)皿中,用組織分離剪與鑷子(無菌)將組織上微量血管剔除,并將其剪碎至肉糜狀,收集至無菌的15 mL離心管中,向離心管中加入與組織液等量的Ⅱ型膠原酶在孵育搖床上消化(30 min、37 ℃、300 r·min-1),加入完全培養(yǎng)基(含1%雙抗和10%胎牛血清)終止消化后,分別用70和40 μm的細(xì)胞篩過濾,鋪至10 cm的培養(yǎng)皿中,得到前體脂肪細(xì)胞。

在培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)中培養(yǎng)細(xì)胞,每隔2 d更換一次完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞長滿后,更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(0.5 mmol·L-1IBMX、1.0 μmol·L-1地塞米松和1.0 μmol·L-1牛胰島素),誘導(dǎo)分化3 d后,更換為維持培養(yǎng)基(1.0 μmol·L-1牛胰島素),待細(xì)胞分化10 d后,對細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色處理,顯微鏡下觀察脂滴的生成量。采用細(xì)胞免疫熒光法檢測脂肪細(xì)胞因子Adiponectin的含量以鑒定細(xì)胞的純度[23]。

1.2.2 qPCR檢測 本試驗采用Trizol-氯仿-異丙醇法提取組織和細(xì)胞的總RNA,使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到所需cDNA后,并使用TB Green?Premix Ex TaqTMII試劑對目的基因進(jìn)行qPCR檢測試驗,qPCR引物如表1所示。

表1 qPCR引物序列

1.2.3 miR-150過表達(dá)與干擾載體的構(gòu)建 根據(jù)miRbase數(shù)據(jù)庫查詢出oar-mir-150的成熟序列,由上海生物工程股份有限公司合成miR-150的mimics、mimics NC、inhibitors和inhibitors NC,序列如表2所示。

表2 miR-150的序列信息

1.2.4 miR-150的靶基因預(yù)測 依據(jù)本課題組對廣靈大尾羊尾部脂肪的高通量測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果,miR-150靶向AOC3、IBTK、KHNYN和VAMP2等多個基因,使用BiBiServ2、miRBas等多個軟件對miR-150與AOC3進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測,發(fā)現(xiàn)二者存在結(jié)合位點(diǎn),說明miR-150與AOC3可能存在靶標(biāo)關(guān)系。

依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中綿羊AOC3(登錄號:XM_015098797.3)的序列,設(shè)計AOC3的3′-UTR野生型與突變型擴(kuò)增引物序列,引物序列見表3。

表3 AOC3的3′-UTR序列信息

1.2.5 綿羊AOC3過表達(dá)和干擾載體的構(gòu)建 根據(jù)NCBI中AOC3的數(shù)據(jù),設(shè)計2對AOC3 CDS區(qū)序列的干擾序列(AOC3-sh1、AOC3-sh2)和1對干擾對照序列(AOC3-shNC),序列如表4所示。

表4 AOC3的表達(dá)引物序列信息

2 結(jié) 果

2.1 綿羊前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與成脂能力的鑒定

體外培養(yǎng)綿羊尾部前體脂肪細(xì)胞4 d后,細(xì)胞形態(tài)呈梭形(圖1A)。誘導(dǎo)分化10 d后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變生成大量脂滴,采用油紅O染色的方法對其鑒定,脂肪細(xì)胞分化的脂滴呈紅色(圖1B)。采用免疫熒光染色檢測Adipogenictin的表達(dá)發(fā)現(xiàn),紅色熒光分布于細(xì)胞質(zhì)中(圖1C),藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核(圖1D),95%以上的細(xì)胞帶有紅色熒光(圖1E),表明試驗中體外培養(yǎng)的綿羊尾部脂肪細(xì)胞為綿羊前體脂肪細(xì)胞,純度達(dá)到95%以上,可用于后續(xù)試驗。

A.綿羊前體脂肪細(xì)胞;B.成脂誘導(dǎo)的綿羊前體脂肪細(xì)胞;C～E.Adiponectin標(biāo)記的綿羊前體脂肪細(xì)胞純度鑒定

2.2 miR-150在不同脂肪組織的qPCR結(jié)果

在前期課題組測序結(jié)果中可篩選出miR-150,且3個不同部位脂肪組織定量結(jié)果顯示,所篩選出的miR-150在各組織中均有表達(dá),miR-150在尾部脂肪表達(dá)量高,差異極顯著(P<0.001,圖2)。因此選擇miR-150為后續(xù)試驗對象,在綿羊尾部脂肪中進(jìn)行功能驗證。

***表示P<0.001;n.s.表示P>0.05,下同

2.3 miR-150對綿羊前體脂肪細(xì)胞分化作用的影響

培養(yǎng)綿羊尾部前體脂肪細(xì)胞,待匯集度達(dá)到80%后,通過轉(zhuǎn)染miR-150 mimics與miR-150 inhibitors來實(shí)現(xiàn)對miR-150的過表達(dá)與抑制。48 h后檢測轉(zhuǎn)染效率顯示,與其陰性對照組相比過表達(dá)miR-150組的表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.001),抑制miR-150則結(jié)果相反(圖3A),說明成功實(shí)現(xiàn)了對miR-150的過表達(dá)與抑制。

A.過表達(dá)和干擾miR-150后miR-150的相對表達(dá);B.過表達(dá)和干擾miR-150后AOC3的相對表達(dá);C.過表達(dá)miR-150后成脂標(biāo)志基因的相對表達(dá);D.干擾miR-150后成脂標(biāo)志基因的相對表達(dá);E.AOC3蛋白的表達(dá);F.AOC3蛋白相對表達(dá)量。* P<0.05,** P<0.01,下同

待前體脂肪細(xì)胞匯集度達(dá)到100%時,用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行4 d的誘導(dǎo)培養(yǎng),維持培養(yǎng)基進(jìn)行6 d的培養(yǎng)。檢測得到,過表達(dá)miR-150后,下游靶基因AOC3和脂肪分化標(biāo)志基因C/EBPα的mRNA表達(dá)量極顯著下降(P<0.01),其他脂肪分化標(biāo)志基因Adiponectin、PPARγ和FABP4的mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.05,圖3B、3C)。抑制miR-150后,則結(jié)果相反(圖3B、3D)。Western blotting檢測得到,過表達(dá)miR-150組與NC組相比較,AOC3蛋白的相對表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.01),抑制miR-150組與NC組相比較,結(jié)果相反(圖3E、3F)。油紅O染色可知,過表達(dá)miR-150的細(xì)胞較其對照組產(chǎn)生較少脂滴;而抑制miR-150則脂滴較多,表明miR-150抑制脂滴沉積(圖4)。綜上,miR-150下調(diào)AOC3和成脂分化標(biāo)志基因的表達(dá),抑制綿羊前體脂肪細(xì)胞的成脂分化。

2.4 miR-150 和AOC3的靶標(biāo)關(guān)系

由BiBiServ2預(yù)測軟件可知miR-150的種子區(qū)序列與下游基因AOC3的3′-UTR存在結(jié)合位點(diǎn),如圖5A所示。圖5B所示為miR-150與AOC3的3′-UTR的種子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)。分別構(gòu)建AOC3的3′-UTR的野生型與突變型載體,并同miR-150 mimics與mimics NC進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。由圖5C可知,miR-150 mimics極顯著降低了AOC3的3′-UTR野生型的熒光活性(P<0.001),而AOC3的3′-UTR的突變型組與其陰性對照的熒光活性差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果可知,AOC3是miR-150的下游靶基因。

A,B.RNAhybird預(yù)測miR-150和AOC3的結(jié)合位點(diǎn);C.AOC3 3′-UTR重組雙熒光質(zhì)粒的相對熒光活性

2.5 過表達(dá)和干擾AOC3對綿羊前體脂肪細(xì)胞分化的影響

構(gòu)建AOC3的慢病毒過表達(dá)和干擾載體,通過共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞293 T,對綿羊前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行慢病毒介導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)AOC3的過表達(dá)與干擾。在293 T細(xì)胞和綿羊前體脂肪細(xì)胞中都出現(xiàn)了大量綠色熒光。分別如圖6A、6B所示。表明AOC3慢病毒包裝效果良好,并成功感染了綿羊前體脂肪細(xì)胞。

A.在293T細(xì)胞中包裝慢病毒;B.慢病毒感染綿羊前體脂肪細(xì)胞。pHB-AOC3.過表達(dá)AOC3;pHB-NC.對照;AOC3-sh1.干擾AOC3-1;AOC3-sh2.干擾AOC3-2;AOC3-shNC.shRNA對照;下同

待細(xì)胞匯集到90%以上,對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化處理。檢測得到,過表達(dá)組與其陰性對照組相比,AOC3的表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.01),AOC3-sh1、AOC3-sh2與其陰性對照組相比,AOC3-sh1顯著下調(diào)了AOC3的表達(dá)(P<0.05),AOC3-sh2極顯著下調(diào)了AOC3的表達(dá)(P<0.01),說明成功實(shí)現(xiàn)了對AOC3的過表達(dá)與干擾,并且AOC3-sh2的干擾效果更好(圖7A、7C)。所以選擇AOC3-sh2作為后續(xù)試驗對象。過表達(dá)AOC3后,成脂分化標(biāo)志基因PPARγ(P<0.001)、Adiponectin、C/EBPα和FABP4的mRNA表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01),如圖7B所示。干擾AOC3后,結(jié)果與其相反(圖7D)。過表達(dá)AOC3組與NC組相比較,AOC3蛋白的相對表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.001),干擾AOC3組與NC組相比較,結(jié)果相反(圖7E、7F)。說明在蛋白水平也成功實(shí)現(xiàn)了對AOC3的過表達(dá)和干擾。AOC3能夠上調(diào)成脂分化標(biāo)志基因的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)綿羊前體脂肪的成脂分化。

A.過表達(dá)AOC3后AOC3的相對表達(dá);B.過表達(dá)AOC3后成脂標(biāo)志基因的相對表達(dá);C.干擾AOC3后AOC3的相對表達(dá);D.干擾AOC3后成脂標(biāo)志基因的相對表達(dá);E.AOC3蛋白的表達(dá);F.AOC3蛋白相對表達(dá)量

油紅O結(jié)果顯示,過表達(dá)AOC3組產(chǎn)生較多脂滴,干擾AOC3組產(chǎn)生的脂滴較少(圖8)。表明過表達(dá)AOC3后,促進(jìn)了綿羊前體脂肪細(xì)胞的脂滴形成。綜上所述,可知AOC3可促進(jìn)綿羊前體脂肪細(xì)胞的成脂分化。

圖8 過表達(dá)和干擾AOC3后綿羊前體脂肪細(xì)胞油紅O染色結(jié)果圖

3 討 論

miRNA與相應(yīng)的靶基因相互作用,抑制mRNA的表達(dá),并阻斷翻譯過程或啟動切割。miRNA和mRNA之間復(fù)雜的相互作用有助于更好地了解潛在的生物過程[24]。最初研究發(fā)現(xiàn),miRNAs可多結(jié)合于靶基因的3′-UTR,例如miR-15a、miR-15b和miR-16通過靶向MYCN的3′-UTR抑制其表達(dá)[25]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),miR-346通過靶向APP的5′-UTR區(qū)上調(diào)其表達(dá)和淀粉樣蛋白β產(chǎn)生[26];miR-532-5p mimics通過與人HT-29 CRC細(xì)胞中RUNX3的5′-UTR特異性結(jié)合,顯著下調(diào)了RUNX3的表達(dá)量和蛋白質(zhì)水平[27]。關(guān)于結(jié)合位點(diǎn)處于CDS區(qū)的位置研究表明,miR-646通過靶向MIIP的CDS區(qū)破壞了其mRNA的穩(wěn)定性,抑制了MIIP的表達(dá),進(jìn)而抑制了胰腺癌細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖和侵襲能力[28]。由此可知,miRNAs與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)存在多樣性。本研究通過雙熒光素酶活性報告驗證得到miR-150與AOC3的3′-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。且miR-150與AOC3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。由以上可知,miRNAs與下游靶基因的結(jié)合位置存在差異性,miRNAs靶向基因的5′-UTR時正調(diào)控基因的表達(dá);靶向基因的3′-UTR和CDS區(qū)時負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)。因此,對基因的調(diào)控作用是否受二者結(jié)合位點(diǎn)所在位置影響,可以做更進(jìn)一步的探究。

miRNAs通過調(diào)控靶基因的表達(dá)既能促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化,又能抑制脂肪細(xì)胞的分化。研究表明,gga-miR-106-5p通過結(jié)合KLF15,抑制雞的腹部脂肪生成[29]。MYOD1通過結(jié)合miR-206來抑制KLF4表達(dá)進(jìn)而抑制脂肪細(xì)胞分化[30]。miRNAs與目的基因結(jié)合抑制了脂肪的分化。也有文獻(xiàn)提出,miR-34a通過靶向AdipoR2抑制AMPK信號通路進(jìn)而抑制PPARα的信號傳導(dǎo),使脂滴生成量增加[31]。miR-370-3p、miR-345-5p分別通過結(jié)合MKNK1和VEGF-B的3′-UTR,調(diào)控脂肪生成和脂肪酸代謝[32-33]。本研究表明,在綿羊前體脂肪細(xì)胞中,miR-150有效地降低了成脂分化標(biāo)志基因的表達(dá),從而減少了脂滴的沉積量。可知,miRNAs對脂肪分化有著重要的影響,因此,研究miRNA對廣靈大尾羊尾部前體脂肪細(xì)胞分化的影響可提高綿羊養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)效益。

miR-150是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞炎癥的小RNA之一[34],可在生理上調(diào)節(jié)細(xì)胞和動物的脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)[35]。一項有關(guān)于巨噬細(xì)胞的研究顯示,miR-150可調(diào)控脂質(zhì)積累并且與細(xì)胞的促炎因子表達(dá)升高有關(guān)[36]。敲除miR-150的小鼠高脂飲食后,全身重量減輕,脂肪堆積減少,表現(xiàn)出肥胖相關(guān)組織炎癥和全身胰島素抵抗加劇[14]。以上多項研究表明,miR-150是影響脂質(zhì)代謝和炎癥發(fā)生的研究熱點(diǎn)。而在家畜模型中的研究發(fā)現(xiàn),在豬脂肪組織中,miR-150-5p通過調(diào)控CYP3A4促進(jìn)游離脂肪酸誘導(dǎo)脂肪變性[37]。miR-150能夠促進(jìn)肉牛前體脂肪細(xì)胞的增殖,在肉牛前體脂肪細(xì)胞分化的階段,miR-150又可以通過靶向AKT1抑制肉牛前體脂肪細(xì)胞分化[17]。近幾年有關(guān)于miR-150的研究從小鼠動物模型轉(zhuǎn)向了家畜。因此,本研究以綿羊前體脂肪細(xì)胞為模型,在廣靈大尾羊尾部前體脂肪細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-150 mimics后,脂肪分化標(biāo)志基因C/EBPα(P<0.01)、Adiponectin(P<0.05)、PPARγ(P<0.05)和FABP4(P<0.05)的表達(dá)量均下調(diào),脂滴的形成減少;干擾miR-150后,得到相反結(jié)果。由以上結(jié)果可知,miR-150通過抑制成脂分化基因的表達(dá),進(jìn)而抑制綿羊前體脂肪細(xì)胞分化,同時也抑制了下游靶基因AOC3的表達(dá)。然而,miR-150對綿羊前體脂肪細(xì)胞的調(diào)控是直接作用于脂肪標(biāo)志基因,還是通過其他調(diào)控因子間接作用于脂肪標(biāo)志基因有待研究。因此,本試驗還對miR-150的下游靶標(biāo)基因AOC3進(jìn)行了研究。

慢病毒載體是遞送遺傳物質(zhì)最常用的轉(zhuǎn)移載體之一,是分子轉(zhuǎn)染試驗的首選載體[38]。慢病毒生產(chǎn)系統(tǒng)是基于瞬時生產(chǎn)的,通過快速有效地共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48～72 h后收獲病毒上清液,滴度達(dá)到106～108UT·mL-1[39]。本試驗在對AOC3功能驗證中采用了慢病毒載體轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞,在慢病毒包裝質(zhì)粒和293 T的輔助下,成功包裝為具有感染性的病毒顆粒,收集病毒液后感染綿羊前體脂肪細(xì)胞,在綠色熒光以及AOC3的表達(dá)量定量數(shù)據(jù)的鑒定下,成功實(shí)現(xiàn)了對目的基因AOC3在綿羊前體脂肪細(xì)胞中的過表達(dá)和抑制。采用慢病毒包裝質(zhì)粒對目的基因進(jìn)行功能驗證,該試驗過程需小心謹(jǐn)慎和防止感染液的污染,但該試驗方法可以更直觀的觀察試驗現(xiàn)象,并及時發(fā)現(xiàn)試驗是否有必要繼續(xù)進(jìn)行。

AOC3通過編碼胺氧化酶調(diào)控脂肪組織中的組胺氧化促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化[40],因此AOC3在脂質(zhì)形成中發(fā)揮著重要作用。本研究過表達(dá)AOC3后,成脂分化標(biāo)志基因的表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01),脂滴的形成增多。因此,AOC3能夠通過調(diào)控脂肪分化標(biāo)志基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)綿羊前體脂肪細(xì)胞的分化。研究表明,AOC3是DNA甲基化的候選基因之一,且通過DNA甲基化來調(diào)控脂肪的沉積,進(jìn)而影響肥胖癥[22,41]。以上文獻(xiàn)說明,AOC3與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。本試驗在廣靈大尾羊的前體脂肪細(xì)胞中對AOC3進(jìn)行分子水平的驗證,可為分子遺傳提供一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

通過軟件預(yù)測與試驗驗證,miR-150與AOC3的3′-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。在脂肪細(xì)胞分化的過程中,miR-150與AOC3的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性,miR-150作為綿羊前體脂肪細(xì)胞分化的抑制劑,通過靶向下游靶基因AOC3的3′-UTR抑制脂肪分化,減少脂滴生成,從而影響綿羊脂肪細(xì)胞的分化,為綿羊尾脂在工業(yè)、醫(yī)藥和飲食方面的重要作用提供更好的科學(xué)理論依據(jù)。