梁鐘帥 唐汶濾 馮清媚 祁新梅 林彩星 石展英 丁華榮

(1 柳州市工人醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,廣西柳州市 545007; 2 廣西醫(yī)科大學研究生院,廣西南寧市 530021; 3 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科,廣西南寧市 530021 )

深 Ⅱ 度燒傷是臨床上常見的燒傷類型,損傷可達真皮層,但殘余真皮及皮膚附件殘留,因而具有較大的可轉化性[1]。目前深 Ⅱ 度燒傷常用的治療方案包括燒傷敷料覆蓋、局部應用銀離子抗感染、行清創(chuàng)術清理壞死組織、皮膚移植及外源性生長因子促進愈合等[2]。但上述方案均存在一定的局限性,例如銀離子殘留具有細胞毒性、清創(chuàng)術可破壞殘留的真皮及皮膚附件、自體皮源缺乏等,因此治療效果均不理想,導致創(chuàng)面愈合時間仍較長[3]?；前粪奏ゃy(silver sulfadiazine,SSD)是臨床上常用的一種局部抗菌制劑,其通過磺胺嘧啶和銀離子的抗菌作用來防止燒傷創(chuàng)面感染,進而促進創(chuàng)面愈合,因此常作為治療燒傷的外用藥物[4-5]。但是,SSD也會造成正常組織和細胞的損傷,延緩燒傷傷口的愈合,同時銀離子還會被人體吸收,存在引發(fā)肝腎功能損害的風險[6]。因此,對于是否使用SSD治療燒傷創(chuàng)面,目前仍存在一定的爭議。當皮膚被燒傷后,表皮壞死,深層的微血管也受到熱損傷,出現(xiàn)微血管功能異常及微血流的改變,同時血管內(nèi)皮細胞釋放相關凝血因子,在微循環(huán)中形成微血栓,嚴重時還會出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)[7]。目前,如何改善殘余創(chuàng)面的微環(huán)境,幫助創(chuàng)面基底部殘余皮膚附件的細胞增長并加速創(chuàng)面愈合,是該領域的研究熱點之一[8-10]。水蛭素是目前已知的強抗凝藥,可與凝血酶直接作用發(fā)揮抗凝血作用,抑制血栓形成,其所含的抗炎酶還具有抗炎作用[11-12]。此外,水蛭素能抗血小板聚集,促進血管內(nèi)皮生長因子表達,在皮瓣移植和斷指再植中有明顯療效[13-14]。然而,水蛭素能否抑制燒傷引起的局部微血栓形成、燒傷所引起的炎癥反應及凝血酶的激活,促進燒傷傷口的愈合,目前的研究報告仍較少。本研究通過建立深Ⅱ度燒傷大鼠模型,應用SSD單獨或聯(lián)合水蛭素進行治療,進一步驗證單純使用SSD是否可導致燒傷創(chuàng)面延遲愈合,同時初步了解SSD聯(lián)合水蛭素治療是否可減輕SSD的副作用而獲得更好的治療效果,從而為深Ⅱ度燒傷的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只SD雄性大鼠由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(桂)2009-0002,動物使用許可證號為SCXK(桂)2009-0004],4月齡,體重為170～200 g。將大鼠飼養(yǎng)于符合醫(yī)學實驗動物環(huán)境設施要求的飼養(yǎng)環(huán)境,室溫18 ℃～25 ℃,相對濕度40%～70%,噪音<65分貝。本實驗遵循廣西醫(yī)科大學動物倫理委員會的有關規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器 5 ATU/mL的天然水蛭素(廣西南寧知博賽爾生物技術有限公司,生產(chǎn)批號:2016CC4521),凡士林(河南亞都實業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號:2011CC3635),SSD乳膏(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院制,桂藥制字H01060297),林格氏液(安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司,國藥準字H20033736), 水浴箱[上海赫田科學儀器有限公司,型號:HH-US-A(20L)]。

1.3 造模方法 參照相關文獻[4,15]的建模方法進行預實驗,發(fā)現(xiàn)大鼠的燒傷創(chuàng)面與正常組織的分界清楚,創(chuàng)面高出正常皮膚,創(chuàng)面潮濕、質(zhì)感較硬,隨著時間的延長,創(chuàng)面色澤變暗,顏色由白轉為灰白,為深Ⅱ度燒傷表現(xiàn),因此本實驗以該法建模。將30只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后,用7%水合氯醛(0.5 mL/100 g)進行腹腔注射,麻醉起效后,剪去腹部長毛,用配制好的8%硫化鈉褪毛,60 s后用溫水沖洗涂擦部位,擦除皮膚上的脫毛劑,分籠喂養(yǎng),自由進食進水。24 h后將大鼠再次麻醉,固定在燙傷模具上,腹部透過模具空洞行熱水浴(水溫為90 ℃,持續(xù)10 s),致傷后立即用無菌干紗布拭干,從而得到腹部直徑約2.7 cm的圓形深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面。致傷后立即給予各組大鼠腹腔內(nèi)注射林格氏液3 mL抗休克。最終觀察到與預實驗相似的皮膚表現(xiàn),即造模成功,共25只大鼠造模成功(另5只大鼠因麻醉死亡)。

1.4 分組及治療方法 致傷后將大鼠按隨機數(shù)字表法分成A組(8只)、B組(9只)、C組(8只)。在燒傷治療中凡士林是主要用于保護創(chuàng)面,故僅使用凡士林均勻涂抹A組大鼠創(chuàng)面,不給予其他干預;使用SSD乳膏均勻涂抹B 組和C組大鼠創(chuàng)面,并在C組大鼠腹部近頭端和腹部兩側,距離創(chuàng)面中心4.0 cm的部位注射水蛭素5ATU。每天給予各組大鼠常規(guī)換藥并涂藥治療,1次/d,同時每3 d用手機拍照記錄傷口情況,大鼠創(chuàng)面愈合后停止涂藥。給予C組大鼠每3 d注射1次水蛭素,共注射5次,于致傷后第15天停止注射。

1.5 觀察指標 觀察各組大鼠的一般情況及創(chuàng)面愈合情況,并拍照記錄,根據(jù)已拍攝的照片,使用Adobe PhotoShop CC 2018軟件測量創(chuàng)面面積,計算創(chuàng)面愈合率,創(chuàng)面愈合率=[(原創(chuàng)面總面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原創(chuàng)面總面積]×100%。由于造模當天燒傷組織周圍紅腫,具體的壞死組織范圍不確切,因此本研究待燒傷急性期過后,以壞死組織邊界清楚的第4天作為初始原創(chuàng)面積的評估時間點,以減少誤差。記錄每組大鼠創(chuàng)面愈合所需時間,愈合的標準為痂殼小于原始創(chuàng)面的5%,即愈合率大于原始創(chuàng)面的95%。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠一般情況的比較 A組部分大鼠在致傷后第3天開始出現(xiàn)打噴嚏、呼吸不暢現(xiàn)象,在致傷后第9天有2只大鼠出現(xiàn)明顯的活動能力減弱,進食和飲水有所減少,并有痰鳴音、寒戰(zhàn)表現(xiàn),懷疑肺部感染,其中1只在出現(xiàn)癥狀當天死亡,另1只逐漸自行好轉。B組大鼠在致傷后第3天開始出現(xiàn)密集打噴嚏、呼吸不暢,有痰鳴音、張口呼吸現(xiàn)象,感染較嚴重,其中1只大鼠在出現(xiàn)癥狀當天死亡。而C組僅有2只大鼠在致傷后第3天出現(xiàn)輕度打噴嚏現(xiàn)象,并未出現(xiàn)死亡。

2.2 3組大鼠創(chuàng)面愈合情況的比較 致傷后當天,3組大鼠創(chuàng)面顏色、大小、范圍、深度大致相同。致傷后第4天,3組大鼠創(chuàng)面干燥結痂,壞死組織邊界清晰,A組和C組大鼠創(chuàng)面底部淤血較少,B組大鼠創(chuàng)面可見明顯的淤血。致傷后第7天,3組大鼠創(chuàng)面干燥結痂,基底部肉芽組織增多,外周壞死組織逐漸愈合,但A組和B組大鼠創(chuàng)面基底部可見較多淤血,微血栓較多,而C組大鼠創(chuàng)面微血栓較少。致傷后第13天,A組和C組大鼠創(chuàng)面痂皮脫落,組織趨向愈合,并且C組愈合效果更好;B組大鼠創(chuàng)面仍有痂皮覆蓋,燒傷創(chuàng)面仍較大,淤血較多,創(chuàng)面深度仍較深。致傷后第15天,B組大鼠創(chuàng)面痂皮脫落,而A組及C組大鼠創(chuàng)面愈合情況良好,且疤痕組織不明顯。致傷后第18天,A組及C組創(chuàng)面較前明顯縮小,無明顯滲出,部分大鼠創(chuàng)面已愈合。見圖 1。

圖1 各時間點 3組大鼠創(chuàng)面的愈合情況

2.3 3組大鼠創(chuàng)面愈合時間的比較 剔除死亡大鼠后,A組、B組、C組最終分別納入7只、8只、8只大鼠進行統(tǒng)計,其愈合時間分別為(18.29±0.48)d、(19.50±1.06)d、(18.75±1.03)d,3組間差異無統(tǒng)計學意義(F=3.079,P=0.068)。但A組在致傷后第18天已有部分大鼠的創(chuàng)面愈合,在致傷后第19天所有大鼠的創(chuàng)面均愈合;B組在致傷后第7天仍有大鼠出現(xiàn)傷口面積較前擴大的情況,在致傷后第18天有部分大鼠的創(chuàng)面已愈合,在致傷后第21天仍有1只大鼠的創(chuàng)面仍未愈合;C組在致傷后第16天有部分大鼠的創(chuàng)面已愈合,在致傷后第19天僅有1只大鼠的創(chuàng)面未完全愈合,但在第20天達到愈合。

2.4 3組大鼠創(chuàng)面愈合率的比較 與B組相比,A組大鼠在致傷后第10天、第18天和19天的愈合率均更高,C組大鼠在致傷后第10天、第13天、第18天和第19天的愈合率均更高(均P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠不同時間點愈合率的比較(x±s,%)

3 討 論

3.1 SSD導致燒傷創(chuàng)面延遲愈合 SSD通過緩慢持續(xù)地釋放磺胺嘧啶和銀離子,達到持續(xù)抗菌的目的。研究表明,SSD能有效抑制包括銅綠假單胞菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多重耐藥菌感染[16]。Ulkür等[17]通過比較SSD與其他抗菌敷料對大鼠全皮膚銅綠假單胞菌污染的燒傷創(chuàng)面的局部抗菌作用,發(fā)現(xiàn)SSD的抗菌效果優(yōu)于其他抗菌敷料。柴勝武等[18]將SSD應用于162例燒傷患者創(chuàng)面,發(fā)現(xiàn)患者感染率低,治療效果滿意。然而,近年來越來越多的研究表明SSD在預防感染和促進愈合方面的效果欠佳。例如,Storm-Versloot等[19]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn),沒有足夠的證據(jù)表明含銀離子的敷料能夠促進傷口愈合或預防傷口感染。另外,Genuino等[20]通過隨機對照試驗發(fā)現(xiàn),與SSD相比,凡士林敷料在促進組織上皮化方面的效果更佳,且更換敷料更方便。Lee等[21]發(fā)現(xiàn)SSD雖能控制感染,但延緩了傷口的愈合,其原因主要是SSD對真皮細胞的細胞毒性作用導致真皮再生障礙和真皮組織機械強度降低。本研究結果顯示,與A組大鼠相比,B組大鼠創(chuàng)面淤血持續(xù)時間更長,痂皮脫落更慢,部分時間點的愈合率更低,所有大鼠創(chuàng)面均愈合所需時間更長。由此可見,單純使用SSD可導致深Ⅱ度燒傷大鼠模型的創(chuàng)面愈合延遲,與上述研究結果相似。而創(chuàng)面愈合不佳又可增加感染的風險,減弱SSD的抗菌效果,因此本研究中A組和B組的部分大鼠一般情況較差,有肺部感染征象,且出現(xiàn)死亡的情況。

3.2 SSD聯(lián)合使用水蛭素可促進燒傷創(chuàng)面愈合 在深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面中,存在3個病理區(qū)域帶,分別是凝固壞死帶(位于最中心)、充血水腫帶(位于外周)、淤滯帶(位于中間部分)。其中,淤滯帶屬于間生態(tài)組織,為危險區(qū)域,淤滯帶的微循環(huán)血流部分受阻,這導致微靜脈擴張和微靜脈內(nèi)血流停滯,從而使血小板、紅細胞和白細胞附著于血管壁,并逐漸阻塞管腔[7,22-23]。如果在燒傷后48 h內(nèi)未能恢復燒傷創(chuàng)面的微循環(huán),會導致間生態(tài)組織血流灌注減少、微血栓形成及間生態(tài)組織壞死,進而加重創(chuàng)面損傷,甚至發(fā)展為Ⅲ度燒傷創(chuàng)面[24]。研究表明,盡早恢復淤滯帶的血流,間生態(tài)組織即有機會轉變?yōu)榫哂谢盍Φ慕M織,從而促使創(chuàng)面愈合[25- 26]。由此可見,深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的愈合與局部微循環(huán)狀態(tài)密切相關。因此,抗凝血劑和抗炎劑已被用于挽救瘀滯帶,且取得良好的效果[27-28]。水蛭素是目前已知的強抗凝藥,本研究采用SSD聯(lián)合水蛭素治療燒傷創(chuàng)面,觀察其干預效果。結果顯示,與A組、B組大鼠相比,C組大鼠的整體狀況較佳,僅個別大鼠存在輕微的感染癥狀,且無大鼠死亡;與B組大鼠相比,C組大鼠的創(chuàng)面淤血情況和微血栓程度更輕,在致傷后第16天已有部分大鼠的創(chuàng)面愈合,部分時間點的愈合率更高。這說明SSD聯(lián)合水蛭素能夠促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合,同時可降低感染風險。研究表明,低分子肝素通過改善微循環(huán)來實現(xiàn)毛細血管再通和淤滯帶再灌注,同時能夠通過調(diào)節(jié)相關炎癥因子來增強機體細胞免疫功能和吞噬細胞的吞噬能力,從而促進燒傷創(chuàng)面的愈合[29-30]。因此,我們推測水蛭素可能通過減輕微循環(huán)中的淤血和減少微血栓形成,來改善淤滯帶的缺血情況,以挽救間生態(tài)組織,促進創(chuàng)面愈合,從而減輕SSD導致的創(chuàng)面延遲愈合的副作用,同時不影響SSD的抗菌效果。但水蛭素對燒傷創(chuàng)面中的炎癥因子和血管內(nèi)皮生長因子是否有影響,仍需要進一步研究探討。

3.3 本研究的局限性 (1)由于實驗條件有限,本研究未對大鼠模型進行病理驗證,僅參考相關文獻來確定深Ⅱ度燒傷模型的建模情況。(2)水蛭素需要通過注射給藥的方式使用,可能對周圍的肉芽組織造成再次損傷,而其他兩組未接受注射,因此實驗設計上存在一定的不足之處。(3)部分結果無統(tǒng)計學意義,可能與樣本量較小有關。(4)由于實驗動物數(shù)量有限,未設置單純的水蛭素治療組,未能進一步分析水蛭素與SSD的相互影響。

3.4 小結 綜上所述,單純使用SSD可能會導致深Ⅱ度燒傷大鼠模型的創(chuàng)面愈合延遲,而SSD聯(lián)合水蛭素可以通過改善微循環(huán)來促進深Ⅱ度燒傷大鼠的創(chuàng)面愈合,且可降低感染風險。