馮麗旋 郭學軍 張永斌 陳 苑

(廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心,廣東省廣州市 510405)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,可引起一系列的神經(jīng)病變,導致記憶、認知、行為異常,甚至引發(fā)癡呆[1-2]。谷氨酸作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì),細胞外谷氨酸水平過高可導致神經(jīng)元死亡和神經(jīng)退行性疾病。谷氨酸誘導的興奮性毒性一方面可通過釋放大量的谷氨酸和Ca2+內(nèi)流實現(xiàn),另一方面也可通過氧化應激介導[3]。細胞外過量的谷氨酸受體可增加細胞內(nèi)Ca2+濃度,高濃度的細胞內(nèi)Ca2+可誘導活性氧簇大量產(chǎn)生,導致線粒體凋亡[4-6]。此外,胱氨酸是谷胱甘肽的前體,而細胞外的谷氨酸鹽可通過抑制細胞對胱氨酸的吸收,導致細胞內(nèi)谷胱甘肽水平下降,誘導細胞發(fā)生氧化應激并導致細胞死亡[3,7]。因此本研究推測氧化應激是谷氨酸誘導細胞凋亡的主要原因。

隨著傳統(tǒng)中醫(yī)藥在頑固性疾病治療中的應用日益增多[8-10],中醫(yī)藥治療AD的研究也得到快速發(fā)展,其中由當歸和川芎組成的佛手散已被廣泛應用于神經(jīng)退行性疾病的治療[11-14]。體外實驗顯示,佛手散中的當歸、川芎可通過協(xié)同作用發(fā)揮防治帕金森病的作用[15]。佛手散水煎劑可改善實驗性腦缺血所致的大鼠神經(jīng)行為學障礙、腦水腫程度及腦梗死體積[16]。此外,佛手散可通過調(diào)節(jié)腸-肝-腦軸來改善表達嵌合小鼠/人淀粉樣蛋白前體蛋白和突變的人早老素1的雙轉(zhuǎn)基因小鼠腸道微生物群失調(diào),調(diào)節(jié)堿性磷酸酶活性、脂多糖和丙二醛水平,從而改善AD小鼠的認知功能[17]。而本課題組早期也通過系統(tǒng)藥理學研究和初步的細胞實驗驗證了佛手散治療AD的分子機制與其抑制細胞外Ca2+內(nèi)流、減少細胞內(nèi)一氧化氮含量有關(guān)[18]。然而,佛手散治療AD的抗氧化和抗細胞凋亡機制還需要進一步研究。因此,本研究探討佛手散改善谷氨酸鈉誘導PC12 細胞氧化應激損傷的作用機制,為佛手散的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器:SW-CJ-1FD超凈工作臺購自蘇州凈化設備公司,Multiskan MK3酶標儀購自Thermo Fisher Scientific公司, FACSCalibur型流式細胞儀購自Becton,Dickinson and company公司,INC108型細胞培養(yǎng)箱購自Memmert公司。

1.1.2 實驗藥品與試劑:當歸飲片(批號:161101)和川芎飲片(批號:170401)均購自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學喻良文副教授鑒定分別為傘形科植物當歸的干燥根和傘形科植物川芎的干燥根莖。

谷氨酸鈉購自上海麥克林生化科技股份有限公司(CAS編號:142-47-2;批號:L810495-100g);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽檢測試劑盒、丙二醛檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號:A001-3-1、A003-1-1、A006-2-1);活性氧簇檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號:S0033S);Caspase-3抗體和B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)抗體購自武漢博士德生物工程有限公司(批號:BA2142、BA0412);Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體購自Abcam公司(批號:Ab32503);胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific公司(批號:10099-141);RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司(批號:SH30809.01B);胰蛋白酶購自GENVIEW公司(批號:9002-07-7);RIPA裂解液、脫脂奶粉、TWEEN?20、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠、ECL液購自武漢賽維爾生物科技有限公司(批號:G2002、G5002、WGT8220、GB12002、GB23303、GB23301、G2014);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司(批號:23227);其他試劑均為分析純,水為蒸餾水。

1.1.3 實驗細胞:PC12細胞購自美國菌種保藏中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 佛手散的制備:按照2010年版《中華人民共和國藥典》[19]配制佛手散。具體煎煮方法:當歸、川芎按3 ∶2的質(zhì)量比稱重,加入8倍體積的水煎煮2 h,收集藥液,再加入6倍體積的水繼續(xù)煎煮2 h,收集藥液,混合兩次藥液,60 ℃濃縮藥液至最終濃度為0.64 g/mL,-20 ℃保存?zhèn)溆??；谝延械难芯糠椒╗16],使用前再將濃縮藥液從冰箱中取出,解凍后用蒸餾水稀釋至所需濃度。

1.2.2 分組及細胞造模:PC12細胞用含有10%胎牛血清和1%雙抗(鏈霉素+青霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2、相對飽和濕度的條件下培養(yǎng),每2～3 d更換一次培養(yǎng)基。當細胞長至融合度為80%時,用胰酶消化后制備成單細胞懸液。將細胞接種到6孔板,密度調(diào)整為每孔2×105個,置于37 ℃、5% CO2、相對飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并將細胞隨機分為對照組、模型組、佛手散低劑量組、佛手散中劑量組、佛手散高劑量組,每組設置3個復孔。根據(jù)本課題組的前期研究結(jié)果[20],以及有關(guān)細胞活性和凋亡的研究結(jié)果[18],將佛手散低、中、高劑量分別設定為32 mg/mL、64 mg/mL和128 mg/mL。

在佛手散低劑量、中劑量、高劑量組細胞中分別加入500 μL終濃度分別為32 mg/mL、64 mg/mL和128 mg/mL的佛手散預處理1 h,對照組和模型組用等體積PBS預處理1 h,除對照組外,其余各組均加入80 μL終濃度為 40 mmol/L谷氨酸鈉孵育24 h,構(gòu)建PC12細胞氧化應激損傷模型,用于后續(xù)實驗。

1.2.3 SOD、丙二醛、谷胱甘肽和活性氧簇含量的檢測:收集各組細胞,根據(jù)檢測試劑盒說明書的操作方法測定各組PC12細胞SOD、丙二醛、谷胱甘肽和活性氧簇含量。

1.2.4 Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達水平的檢測:收集各組細胞,用PBS反復沖洗,采用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)在冰上裂解細胞30 min,隨后4 ℃下以12 000 r/min離心10 min,收集上清液,即為細胞的總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品煮沸變性后采用SDS-PAGE分離蛋白,然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉- TWEEN?20在室溫下封閉PVDF膜1 h。使用TBST洗膜3次,5 min/次。然后分別加入3 mL稀釋后的Caspase-3抗體(1 ∶1 000)、Bax抗體(1 ∶1 000)、Bcl-2抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。使用TBST洗膜3次,5 min/次。然后加入3 mL稀釋后的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體(1 ∶5 000),在室溫下孵育40 min,使用TBST洗膜3次,7 min/次。以GAPDH(1 ∶5 000)為內(nèi)參,用ECL顯色,暗室曝光顯影,采用凝膠圖像分析系統(tǒng)測定目的蛋白條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,方差齊時兩兩比較采用 LSD-t檢驗,方差不齊時兩兩比較采用Dunnett′s T3檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 5組PC12細胞SOD、丙二醛、谷胱甘肽和活性氧簇含量的比較 模型組PC12細胞的SOD、谷胱甘肽含量低于對照組,丙二醛和活性氧簇含量高于對照組(均P<0.05)。佛手散低劑量組、佛手散中劑量組、佛手散高劑量組PC12細胞的SOD和谷胱甘肽含量高于模型組,丙二醛和活性氧簇含量低于模型組,且上述指標的變化呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表1。

表1 5組PC12細胞SOD、丙二醛、谷胱甘肽和活性氧簇含量的比較(x±s)

2.2 5組PC12細胞凋亡蛋白表達水平的比較 模型組PC12細胞的Caspase-3和Bax表達水平高于對照組,Bcl-2蛋白表達水平低于對照組(均P<0.05)。佛手散低劑量組、佛手散中劑量組、佛手散高劑量組PC12細胞的Caspase-3和Bax表達水平低于模型組,Bcl-2蛋白表達水平高于模型組(均P<0.05),其中Caspase-3和Bax蛋白表達水平的變化呈劑量依賴性(均P<0.05),Bcl-2蛋白表達水平總體上隨佛手散濃度的升高而升高。見表2和圖1。

圖1 5組PC12細胞中細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的電泳圖

表2 5組PC12細胞凋亡蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

研究顯示,當歸和川芎的主要成分對受損PC12細胞有保護作用[21-22],因此推測由當歸和川芎組成的佛手散也可能對谷氨酸誘導的PC12細胞氧化應激損傷具有改善作用。本課題組前期的系統(tǒng)藥理學研究結(jié)果顯示,佛手散可通過抗氧化途徑治療AD[18],而且動物實驗表明佛手散具有抗氧化作用[17],細胞實驗也表明佛手散可通過抗氧化途徑調(diào)節(jié)受損PC12細胞內(nèi)的Ca2+和一氧化氮的濃度以起到細胞保護作用[18]。本研究進一步探討佛手散改善谷氨酸鈉誘導PC12 細胞氧化應激損傷的作用機制。

多項研究表明,AD患者大腦β淀粉樣蛋白(amyloid beta-protein,Aβ)異常積累和神經(jīng)纖維纏結(jié)沉積與氧化應激損傷有關(guān)[23-26]。Aβ的產(chǎn)生與氧化應激反應呈正相關(guān),當大腦發(fā)生氧化應激損傷后,Aβ前體蛋白過表達,導致Aβ的形成和積累,同時伴隨大量活性氧簇的產(chǎn)生,因此活性氧簇是AD發(fā)病的誘因之一[27],也是導致細胞結(jié)構(gòu)受損、各種疾病狀態(tài)和衰老的重要原因之一[28]。活性氧簇水平過高可能會導致自由基介導的連鎖反應,如破壞細胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖甚至DNA[28]。活性氧簇誘發(fā)的氧化應激損傷使丙二醛水平升高,SOD和谷胱甘肽水平下降[29]。提高SOD和谷胱甘肽水平后,其可通過分解活性氧簇來降低細胞中活性氧簇的含量,抑制活性氧過量形成,減輕氧化應激損傷,同時抑制丙二醛的產(chǎn)生。因此,可通過檢測這三種氧化應激副產(chǎn)物的水平來評價氧化應激損傷的程度[28,30]。本研究結(jié)果顯示,模型組PC12細胞的SOD和谷胱甘肽含量低于對照組,丙二醛和活性氧簇含量高于對照組(均P<0.05)。這提示PC12細胞氧化應激損傷模型構(gòu)建成功。高濃度的谷氨酸鈉可能通過抑制細胞對胱氨酸的攝取,使細胞無法維持一定的谷胱甘肽水平以保護細胞免受氧化損傷,導致細胞產(chǎn)生過多的活性氧簇,從而促使細胞內(nèi)丙二醛水平升高,SOD和谷胱甘肽水平下降[7]。而給予不同濃度佛手散預處理的PC12細胞丙二醛和活性氧簇含量低于模型組,SOD和谷胱甘肽含量高于模型組(均P<0.05),且指標變化呈劑量依賴性,表明佛手散可以減輕谷氨酸鈉誘導的PC12細胞氧化應激損傷,且濃度越高,佛手散的抗氧化作用越顯著,與既往研究[17,31]結(jié)論相似,提示佛手散或可對AD具有很好的抗氧化作用。

氧化應激可引起線粒體功能紊亂,促進細胞凋亡[32]。Bax和Bcl-2是兩種與細胞凋亡相關(guān)的蛋白,二者均屬于Bcl-2家族蛋白,Bcl-2家族蛋白與氧化應激密切相關(guān),在調(diào)控線粒體凋亡通路中發(fā)揮重要作用。促凋亡蛋白Bax與Bak形成寡聚體后作用于線粒體外膜,導致線粒體外膜的通透性降低,使線粒體中的細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中,激活凋亡因子Caspase-3,促進細胞凋亡;抗凋亡蛋白Bcl-2可與Bax競爭結(jié)合于線粒體細胞膜上,形成Bcl-2/Bax二聚體,使線粒體通透性降低,細胞色素C釋放減少,從而抑制細胞凋亡[33-34]。因此,當Bax和Caspase-3表達增加,Bcl-2表達降低時,細胞凋亡增加[35]。研究顯示,在哺乳動物和異體模型中Bax的表達升高可導致活性氧簇的產(chǎn)生和氧化損傷[36],而Bcl-2的表達升高可抑制由地塞米松和生長因子缺失引起的脂質(zhì)過氧化[37]。當谷胱甘肽耗盡時,Bcl-2可通過增加或者改變細胞中谷胱甘肽的分布間接降低細胞中活性氧簇水平[36]。因此,Bcl-2家族蛋白可通過氧化應激通路調(diào)控細胞的氧化損傷。本研究結(jié)果顯示,模型組PC12細胞的Caspase-3和Bax表達水平高于對照組,Bcl-2蛋白表達水平低于對照組(均P<0.05),說明谷氨酸鈉可通過調(diào)控Bax、Caspase-3和Bcl-2的表達來調(diào)控細胞凋亡,這種凋亡可能與谷胱甘肽水平下降引起的氧化應激有關(guān)[7]。而給予不同濃度佛手散預處理的PC12細胞Caspase-3和Bax表達水平低于模型組PC12細胞,Bcl-2蛋白表達水平高于模型組PC12細胞(均P<0.05),其中Caspase-3和Bax表達水平的變化呈劑量依賴性,Bcl-2蛋白表達水平總體上隨佛手散濃度的升高而升高,說明佛手散具有很好的抗凋亡作用,且濃度越高,其抗凋亡作用越顯著。

綜上所述,佛手散可以通過提高細胞的抗氧化能力和減少細胞凋亡,來抑制谷氨酸鈉誘導的PC12細胞氧化應激損傷,從而發(fā)揮保護神經(jīng)的作用。