周振超 鄭吉 帥馨怡 林澤俊 陳紅

（1.浙江大學環(huán)境與資源學院環(huán)境技術研究所，杭州 310058; 2.寧波市生態(tài)環(huán)境科學研究院 寧波 315012）

抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes,ARGs）被認為是一種新污染物已經(jīng)在環(huán)境中被廣泛發(fā)現(xiàn)［1］。研究已經(jīng)在城市飲用水［2-4］、污水處理系統(tǒng)［5-7］和地表水［8-10］都中發(fā)現(xiàn)了豐富的ARGs，并且在人類微生物組中也發(fā)現(xiàn)了豐富的ARGs分布，例如腸道和皮膚微生物組中［11-14］。一部分ARGs可以被飲用水處理系統(tǒng)和污水處理系統(tǒng)等去除［3-5,7,15］，甚至在環(huán)境中自然降解［8,16］，但是存在一些ARGs難以被處理系統(tǒng)完全去除并且可以在環(huán)境中持續(xù)傳播［17-19］。在不同環(huán)境中持續(xù)被檢出的ARGs被認為是共享ARGs（shared ARGs）［20-22］。共享ARGs在不同環(huán)境樣品中的豐度較高且能持續(xù)傳播擴散，研究報道了在116個污水樣本中共檢測出381個不同的ARGs，其中發(fā)現(xiàn)了31個共享ARGs占檢測到的總ARGs豐度的57.7%（范圍29.4%-84.3%）［20］。已有研究也報道了河流生態(tài)系統(tǒng)中大約43.3%的ARGs在4個季節(jié)之間共享［21］，而且水環(huán)境和魚體中也存在共享ARGs［22］。ARGs可以通過細菌、可移動遺傳元件（mobile genetic elements，MGEs）甚至游離態(tài)DNA進行轉移和傳播［23］。已有研究發(fā)現(xiàn)ARGs（例如macA-macB和tetA-tetR）在雞、豬和人類糞便中共享［24］，環(huán)境與人體中的共享ARGs可能會存在較大的傳播和健康風險。環(huán)境和人類之間共享ARGs是否會影響臨床抗生素耐藥，共享ARGs是否僅限于特定機制的基因或適用于具有不同抗性機制的基因仍不清楚。因此，進一步探究環(huán)境中持續(xù)傳播和共享ARGs分布和潛在宿主，可以為識別對公共健康構成較大威脅的ARGs和微生物群提供科學依據(jù)。

城郊區(qū)域存在著豐富的生物化學物質和元素交流及循環(huán)，也被認為是ARGs傳播和擴散的熱點區(qū)域之一［25］。團隊前期研究報道了在城郊流域樣品中檢測到了46-154種不同的ARGs，且ARGs豐度受到季節(jié)和人為活動等因素的影響［16］，且城郊居民糞便、皮膚和生活污水處理系統(tǒng)中的ARGs總豐度比河流樣本中的豐度高約23、2和7倍［26］。但是，對城郊自來水、生活污水處理系統(tǒng)（RDSTS）、河流以及人體糞便和皮膚中的共享ARGs的分布和傳播特征知之甚少。本研究采用高通量熒光定量PCR（highthroughput quantitative polymerase chain reaction, HT-qPCR）和16S rRNA 基因測序探究鑒定城郊區(qū)域水環(huán)境（自來水、污水和地表水）和人體（腸道和皮膚）中的共享ARGs和細菌標志物，探究ARGs的潛在宿主。這項研究有助于揭示城郊區(qū)域中關鍵的共享ARGs和微生物群落，以期為控制抗生素耐藥傳播提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所有樣本均在中國浙江省寧波市的一個城郊區(qū)域采集，連續(xù)3 d收集區(qū)域內的自來水（3個采樣位點）、污水（2個采樣位點）和地表水（2個采樣位點），每個樣品重復3次。在獲得浙江大學醫(yī)學院倫理委員會許可后，招募區(qū)域內10名健康成人（6男4女），采集受試者糞便和皮膚微生物樣本。所有受試者在參與前都提供了書面知情同意書。使用無菌糞便收集器收集糞便樣本。從每個受試者身上選取不同的暴露皮膚部位進行微生物樣品采集，采樣部位為：潮濕（肘前窩）、干燥（手掌和前臂掌側）和皮脂腺（關節(jié)后皺褶），代表不同的生理特征［27］。使用“拭子-刮擦-拭子”方法收集皮膚微生物，用緩沖液（0.15 mol/L氯化鈉 和 0.1% Tween-20）潤濕后的拭子對限定的淺表皮膚區(qū)域（2 cm × 2 cm）擦拭40 s，用無菌一次性玻璃片輕輕刮擦，再次用相同的棉簽擦拭收集，并從玻璃片上收集殘留的刮屑［26,28-29］。將來自暴露皮膚部位的樣品混合到一個皮膚樣品中，以代表暴露的人體皮膚。所有樣本保存在4℃并運送到實驗室，并在24 h內完成DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 水樣經(jīng)真空過濾裝置將樣品富集在0.22 μm孔徑的濾膜上，濾膜用無菌剪刀剪碎后，使用商業(yè)試劑盒（FastDNA SPIN Kit for soil, MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA）提取基因組DNA。所有糞便樣品在-80℃下冷凍干燥后研碎，使用商業(yè)試劑盒進行DNA提取。皮膚樣品由蛋白酶K在55℃下孵育預處理6 h，加入978 μL磷酸鈉緩沖液和122 μL Tween-20緩沖液，樣品渦旋混合3 min，將樣品富集在0.22 μm孔徑的濾膜上，濾膜用無菌剪刀剪碎后使用商業(yè)試劑盒提取DNA。通過分光光度計分析（NanoDrop ND-2000c，Thermo，USA）確定純化DNA的質量和濃度，并在-80℃下儲存直至需要。

1.2.2 高通量熒光定量PCR檢測ARGs 使用296對引物在TaKaRa SmartChip高通量熒光定量PCR系統(tǒng)上檢測ARGs和MGEs［16］。其中285對引物檢測主要抗生素類別的ARGs，包括對氨基糖苷類、β-內酰胺類、氟喹諾酮類/喹諾酮類/氟苯尼考/氯霉素（FCA）、大環(huán)內酯類/林可酰胺/鏈霉素 B（MLSB）、磺胺類、四環(huán)素、萬古霉素和其他類抗性基因，9對引物檢測轉座酶基因，1對引物檢測對I類整合子基因和1對引物檢測16S rRNA基因。所有高通量熒光定量PCR均一式3份進行檢測，過程為:（1）在95℃下初始變性10 min；（2）在95℃下30 s變性；（3）在60℃下退火30 s；進行40個循環(huán)。最后軟件自動生成熔解曲線分析。數(shù)據(jù)質量控制條件為：（1）效率在（90%-110%）范圍內；（2）擴增子無多重熔解曲線；（3）3次重復均在檢測限內（閾值循環(huán)（Ct）為31）?；蛳鄬ωS度計算如下：

1.2.3 細菌16S rRNA 基因測序 使用通用引物515F/907R（GTGCCAGCMGCCGCGG/CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）在Ion Torrent平臺上擴增細菌16S rRNA基因的V4-V5區(qū)域［30］。使用獨特的七核苷酸條形碼標記每個樣品的引物組，以在單次焦磷酸測序運行中識別混合物中的單個樣［31-32］。每個樣本的所有序列都經(jīng)接頭序列過濾、篩選去除低質量讀數(shù)和不明確的序列。使用QIIME生成和分析高質量序列，使用UCLUST以97%的相似性水平將序列聚類為操作分類單元（OTU）。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 基本統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析在Microsoft Excel上進行。使用SPSS V22.0（IBM, USA）分析Spearman 相關系數(shù)，顯著性水平為P＜ 0.05。使用ANOVA比較不同樣品之間的ARGs豐度差異，顯著性水平為P＜ 0.05。使用ANOSIM比較細菌群落間的差異性。使用LEfSe來分析識別在人類糞便、皮膚和水中差異性細菌［33］，基于≥4.0的線性判別分析（LDA）效應大小閾值?；贐ray-Curtis距離的Mantel test和Procrustes分析細菌群落和ARGs間的相關性。使用Gephi平臺和Fruchterman Reingold算法對網(wǎng)絡進行可視化，只有統(tǒng)計上穩(wěn)健的相關性才用于形成最終的網(wǎng)絡圖［13,34-35］。

2 結果

2.1 ARGs分布和共享特征

ARGs檢出數(shù)量從高到低依次為，糞便＞污水＞河水＞皮膚＞自來水，分別檢出了223、176、155、140和128種ARGs（圖1）。ARGs相對豐度平均值從高到低依次為，糞便＞污水＞皮膚＞自來水＞河水，相對豐度為7.88E-03、5.86E-03、1.93E-03、9.19E-04和6.46E-04 copies/16S rRNA 基因。ARGs相對豐度中位值從高到低依次為，皮膚＞污水＞自來水＞糞便＞河水，相對豐度分別為1.14E-03、2.66E-04、2.14E-04、5.09E-05和3.39E-05 copies/16S rRNA基因。人體和水環(huán)境樣品之間共同檢出了70個基因，這些被稱為共享ARGs。熱圖顯示了共享ARGs的相對豐度（圖2）。環(huán)境中共享ARGs未被水處理系統(tǒng)完全去除，且與人體腸道和皮膚中的ARGs存在共享，說明了共享ARGs可以在不同介質中傳播擴散，可能間接反映了區(qū)域內抗生素耐藥風險水平。在共享ARGs中，β-內酰胺、MLSB和四環(huán)素類的ARGs在人類糞便中占主導地位，而氨基糖苷類和其他類的ARGs在自來水、皮膚、污水和河流樣本中占主導地位（圖3）。

圖1 人體和水環(huán)境樣品中抗生素抗性基因相對豐度Fig.1 Relative abundances of ARGs in humans and water samples

圖3 不同環(huán)境中共享 ARGs 的相對豐度（A）和比例（B）Fig.3 Relative abundances（A）and proportions（B）of shared ARGs in different environments

2.2 細菌群落分布和共享

經(jīng)過組裝和質量過濾后，從所有樣本中總共獲得了1 078 819個高質量序列。通過以97% 的不同程度對OTU進行聚類，總共獲得了7 277個OTU。糞便、皮膚和水樣中細菌群落的組成存在顯著不同（ANOSIM test，R= 0.757 9，P＜ 0.001）。LEfSe結果顯示人類糞便、皮膚和水環(huán)境的微生物特征之間存在統(tǒng)計學上的顯著差異（P＜ 0.001）（圖4-A）。擬桿菌門和厚壁菌門是人類糞便中的優(yōu)勢門，占總細菌16S rRNA基因序列的89.5%。放線菌和變形菌是人體皮膚樣本中的主要門（69.3%），而擬桿菌和變形菌在水環(huán)境中占優(yōu)勢（70.2%-86.1%）（圖4-B）。在科水平上，來自4個門（放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門）的20個分類群在科類別之間存在差異（α ＜ 0.05，LDA ≥ 4.0；圖4-C）。人類糞便中的微生物群落在4個不同科中的比例顯著較高，包括擬桿菌科、瘤胃球菌科、毛螺菌科和韋榮菌科（圖4-C）。人體和水環(huán)境樣品之間在屬水平上共同檢出了58個細菌，這些細菌被稱為共享細菌。熱圖顯示了共享細菌的相對豐度（圖5）。共享細菌的總豐度大小依次為糞便＞皮膚＞河流＞自來水＞污水，分別占總細菌的78.0%、64.0%、33.8%、33.3%和29.0%。共享細菌的平均相對豐度大小依次為糞便＞皮膚＞河流＞自來水＞污水，分別占總細菌的1.3%、1.1%、0.6%、0.6%和0.5%。共享細菌的中位值相對豐度大小依次為自來水＞皮膚＞河流＞污水＞糞便，分別占總細菌的0.16%、0.07%、0.06%、0.05%和0.01%。在共享細菌門水平上中，擬桿菌門在人類糞便中占主導地位，放線菌門和變形菌門在人體皮膚中占主導地位，厚壁菌門和變形菌門在自來水中占主導地位，變形菌門和擬桿菌門在污水和河流樣品中占主導。在共享細菌屬水平上，人體糞便中豐度最高的是擬桿菌門的Bacteroides，人體皮膚中豐度最高的是放線菌門的Propionibacterium，自來水中豐度最高的是厚壁菌門的Ruminococcus，污水中豐度最高的是變形菌門的Zoogloea，河流中豐度最高的是擬桿菌門的Flavobacterium。共享的細菌可以在不同環(huán)境中擴散和定植，可能具有較大的生態(tài)位優(yōu)勢。Procrustes 分析中共享ARGs和共享細菌群落間存在顯著相關性（Bray-Curtis，R= 0.894 6,P＜ 0.001,number of permutations = 9 999）.Mantel test中共享ARGs和共享細菌群落間也存在顯著相關性（Bray-Curtis,R= 0.353 3,P= 0.001 8, number of permutations= 9 999）。

圖4 基于LEfSe區(qū)分人類糞便、皮膚和水環(huán)境中差異特征微生物分類群Fig.4 Taxa discriminates among human feces, skin and water microbiota as determined by LEfSe

圖5 共享細菌豐度熱圖Fig.5 Heatmap of shared bacteria abundances

2.3 共享ARGs、MGEs和細菌的共出現(xiàn)網(wǎng)絡分析

基于強（Spearman 相關系數(shù)R＞ 0.7）和顯著（P＜ 0.01）相關性，通過網(wǎng)絡分析分別探索了所有ARGs、MGEs和細菌的共現(xiàn)模式，稱為整體網(wǎng)絡（圖6-A），和70個共享ARGs、7個共享MGEs和59個細菌的共現(xiàn)模式，稱為共享網(wǎng)絡（圖6-B）。整體網(wǎng)絡的可視化包括312個節(jié)點（每個節(jié)點代表一個ARGs、MGEs或細菌子類型）和2 054條邊，平均度為13.167，平均加權度為22.336，網(wǎng)絡直徑為8，圖密度為0.042，模塊化系數(shù)為0.453，平均聚類系數(shù)為0.284，平均路徑長度為3.045。共享網(wǎng)絡的可視化包括132個節(jié)點（每個節(jié)點代表一個共享的ARGs、MGEs或細菌子類型）和1 053條邊，平均度為16.076，平均加權度為26.543，網(wǎng)絡直徑為6，密度為0.124，模塊化系數(shù)為0.377，平均聚類系數(shù)為0.554，平均路徑長度為2.64。共享網(wǎng)絡的平均度、平均加權度、圖密度高于整體網(wǎng)絡，說明了共享ARGs、MGEs和細菌間的交流傳遞比較高效。整體網(wǎng)絡的平均聚類系數(shù)低于共享網(wǎng)絡，而平均路徑長度大于共享網(wǎng)絡，說明了整體網(wǎng)絡更具有小世界性。共享網(wǎng)絡可以清楚地分為4個模塊，其中兩個最大的模塊（模塊 I 和 II）占據(jù)了132 個節(jié)點中的73個。同一模塊中的共享基因和細菌可能比其他模塊中的更頻繁地相互作用和交流，并在人類和水環(huán)境中表現(xiàn)出相似的命運。網(wǎng)絡分析中，每個節(jié)點的大小與連接數(shù)成正比，每個模塊中連接最密集的節(jié)點被定義為“hub”。共享網(wǎng)絡中，氨基糖苷類抗性基因aacA4-01是模塊I的hub，外排泵介導的多重抗性基因mtrC-02和tolC-02是模塊II和模塊IV的hub，I類整合酶基因intI是模塊 III 的hub（圖3）。這些hub類基因在模塊中與其他基因和細菌間的連接更加緊密，可以作為典型ARGs和MGEs進行主要關注。

圖6 所有檢測到的 ARGs、MGEs和細菌的網(wǎng)絡分析（A）和共享 ARGs、MGEs和細菌的網(wǎng)絡分析（B）Fig.6 Network analysis of all detected ARGs, MGEs and bacteria（A）and shared ARGs, MGEs and bacteria（B）

3 討論

污水中ARGs在數(shù)量和豐度上都較高，之前的研究也表明常規(guī)污水處理工藝不能完全去除ARGs且可能導致污水中ARGs的豐度上升，說明了污水可能是ARGs在城郊環(huán)境中增殖的主要場所和傳播的主要渠道［5,36］。以“人體-污水-地表水-飲用水-人體”這一路徑思考，人體腸道和皮膚上的ARGs經(jīng)生活污水進入污水處理系統(tǒng)。污水系統(tǒng)內接收了大量的生活污水，且未能被污水處理系統(tǒng)去除的ARGs將被釋放到地表水中，已有研究也發(fā)現(xiàn)了污水處理系統(tǒng)出水排放至河流中將導致河流中ARGs變化［5,36］。河流從人類活動中接收到多種污染物，而且地表水中共享ARGs可能會傳播至飲用水水源，例如下游地表水與魚類間存在共享ARGs［22］，而魚類可以在河流和水庫等在不同水域棲息，可能會造成ARGs傳播至飲用水水源。已有研究也報道了飲用水處理系統(tǒng)也不能完全去除ARGs［2-4］，而且自來水中存在ARGs可能受余氯［2］和輸送管道中的生物膜影響［17］，自來水對人體的暴露量比污水和地表水更高，其中共享ARGs可能會更容易傳播至人體帶來潛在的健康風險［37］。β-內酰胺抗性基因在人類和水環(huán)境中共享存在，β-內酰胺是全球消耗量最大的三大抗生素之一［38］，這類ARGs的廣泛傳播可能會對治療細菌感染造成較大的影響。人類糞便中β-內酰胺類、MLSB和四環(huán)素類ARGs的富集可能與消耗大量抗生素和殺菌劑有關。細菌攜帶的這些ARGs可能在多種環(huán)境中對細菌的生存具有重要作用，人體內的細菌可能會受到較高的抗生素壓力，而這些攜帶ARGs的細菌比不耐藥的細菌具有競爭優(yōu)勢，更易在人體中的生存和定植。此外，據(jù)報道MLSB、β-內酰胺類和四環(huán)素類是養(yǎng)殖行業(yè)主要使用的抗生素［39］，人類糞便中這些ARGs的富集也可能是由于自牲畜消費過程中的抗生素、ARGs或者耐藥細菌傳播至人體。污水中具有豐富的共享ARG可能是因為抗生素、天然抗生素和復雜污染物的殘留可能會影響細菌群落和ARGs，細菌攜帶的ARGs可能會賦予細菌應對不同環(huán)境壓力的能力，而且污水也可能會促進ARGs在細菌間的水平轉移［40］。人類皮膚和水樣中豐度高的3個科是Comamonadaceae、Moraxellaceae和Sphingomonadaceae，與糞便有顯著差異。這些顯著差異分類群可以作為Biomarkers［33,41-42］代表人類和水環(huán)境中的不同微生物群落。細菌群落的變化可能會影響ARGs的變化，已有研究也報道了水環(huán)境中細菌群落改變可能會對ARGs結構具有一定影響，影響程度在19.65%-68.44%［16,35,43］。整體網(wǎng)絡的模塊化系數(shù)值大于0.4，表明整體網(wǎng)絡具有顯著的模塊化結構，而共享網(wǎng)絡不具備模塊化結構間接說明了共享網(wǎng)絡節(jié)點間的聯(lián)系可能更加緊密［44］。網(wǎng)絡分析也可以揭示潛在的共享ARGs宿主，例如，模塊III中的Pseudomonas與本模塊內的intI-1和blaCMY2-02，與模塊I中的aacA4-03、qacH-02、catB3、aadA5-02、blaMOX_blaCMY，與模塊II中的mtrC-02存在顯著相關性（R= 0.75-0.91，P＜ 0.01），說明了Pseudomonas可能是這些基因的潛在宿主。Pseudomonas是常見的條件致病菌并且廣泛分布在環(huán)境和人體微生物群落中，而blaCMY2-02編碼的β-內酰胺酶可以使細菌對廣譜頭孢菌素等β-內酰胺抗生素產生抗性，更為重要的是水平基因轉移元件intI與Pseudomonas和blaCMY2-02存在顯著相關性并在同一個模塊中出現(xiàn)，說明了intI可能會促進這類ARGs在細菌間的轉移和擴散。世界衛(wèi)生組織也報道了對碳青霉烯等β-內酰胺抗生素具有抗性的Pseudomonas aeruginosa是威脅人類健康的最關鍵的臨床抗生素抗性細菌（Priority 1：Critical）［45］。之前的研究也使用網(wǎng)絡分析鑒定了地表水和污水處理系統(tǒng)中ARGs的潛在微生物宿主［26,46］，確定人體和水環(huán)境之間共享ARGs、MGEs和細菌的共出現(xiàn)網(wǎng)絡可能有助于識別和控制關鍵的ARGs亞型在城郊區(qū)域傳播。

4 結論

抗生素抗性基因越來越需要依據(jù)“One Health（大健康）”框架，在人與自然的不同介質中進行綜合地表征和定量。本文通過高通量qPCR技術揭示了環(huán)境與人體中抗生素抗性基因分布特征和潛在宿主。在人體和水環(huán)境中的共享ARGs表現(xiàn)出多樣的抗生素抗性類別和較高的基因豐度，而且ARGs的分布與微生物群落存在顯著的相關性。ARGs和細菌的網(wǎng)絡分析揭示了共享ARGs、MGEs與細菌的共出現(xiàn)和傳播，揭示了共享ARGs的潛在細菌宿主。結果為鑒定和識別環(huán)境中潛在高風險的ARGs提供了一定的科學依據(jù)。