李希尤　黃蓉萍　顧笑遠　韓紹聰　王葳　李維熙

摘 要：雞胚模型是研究早期胚胎發(fā)育、毒理學(xué)、藥理學(xué)以及免疫學(xué)的常用模型。與傳統(tǒng)動物模型比較，雞胚在母體外發(fā)育易于操作、成本低，可以同時獲得大量實驗所需樣本。此外，雞胚在孵育過程中隨孵育時間發(fā)生的組織形態(tài)變化及血管分布情況可用照明燈直接觀察。本文對雞胚模型的主要應(yīng)用現(xiàn)狀進行了總結(jié)闡述，旨在為拓展該實驗?zāi)Ｐ偷膽?yīng)用提供有益的參考。

關(guān)鍵詞：雞胚模型；神經(jīng)管畸形；心臟畸形；表觀遺傳學(xué)；免疫學(xué)

中圖分類號：Q95-33? ? 文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1673-1085（2023）07-0058-12

動物模型是模仿人類疾病來探究發(fā)病機制、藥物篩選、毒性評價以及研究生物發(fā)育的重要手段。目前，常用的實驗動物有以嚙齒類動物為主的哺乳動物、斑馬魚、線蟲以及雞胚等。其中，雞胚通常指受精種蛋從孵化第一天至雛雞破殼前的階段，是體內(nèi)研究的常用模型。雞胚的應(yīng)用有悠久的歷史，早在上千年前，人們就利用雞胚來觀察胚胎發(fā)育過程。雞胚的發(fā)育過程與人類相似，且在孵育期間可以通過觀察不同時間段的雞胚形態(tài)來掌握雞胚的發(fā)育信息。與其他實驗動物相比，雞胚具有來源廣、樣本量大、孵育可控、周期短、操作簡便、胚胎發(fā)育狀況易于觀察且不受倫理學(xué)問題限制等優(yōu)勢。雞胚模型與其他模式動物的特點見表1。目前，雞胚模型已被廣泛用于藥理毒理評價、表觀遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)以及疾病機制研究等重要領(lǐng)域（表2）。本文綜述了雞胚模型在疾病研究、藥物作用等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀，為拓展雞胚模型的研究和應(yīng)用提供參考。

1 雞胚的培養(yǎng)及給藥方式

雞胚模型的培養(yǎng)方式有無殼培養(yǎng)和蛋殼內(nèi)培養(yǎng)兩種模式。與蛋殼內(nèi)培養(yǎng)相比，無殼培養(yǎng)的雞胚更容易觀察。Tahara等[16]用聚甲基戊烯薄膜作為培養(yǎng)容器，通過補充乳酸鈣和蒸餾水，90%以上的胚胎能存活到第17天，建立了一種簡單、孵化率高的雞胚培養(yǎng)方法。但杜金娥等[17]對雞胚無殼孵化的存活率進行了研究，發(fā)現(xiàn)雞胚死亡率從第1天到第8天逐漸升高，孵育至第18天時雞胚的死亡率接近100%，其中第10天雞胚死亡率最高。這可能是因為脫蛋殼培養(yǎng)的雞胚失去了蛋殼的保護，極易被外界微生物侵入，污染早期胚胎，導(dǎo)致胚胎死亡，因此脫蛋殼方式不適合長期培養(yǎng)。而蛋殼內(nèi)培養(yǎng)使雞胚在理想的生理環(huán)境中發(fā)育，具有較高的生存能力。因此，蛋殼內(nèi)培養(yǎng)仍然是雞胚模型培養(yǎng)的主要模式。雞胚常見給藥方式有氣室注射、卵黃注射、卵清注射和胚胎暴露四種方式。氣室注射法給藥時，先將新鮮受精蛋置16 ℃保存，待出現(xiàn)明顯氣室，在無菌環(huán)境下用鑷子和剪刀在氣室端開一個約1 cm小孔，用微量進樣器向氣室注入藥液[18]；卵黃注射法、卵清注射法和胚胎暴露法的操作比較類似，在蛋殼開孔后用微量進樣器分別向雞胚下方的卵黃、卵清或胚胎注入藥液[19-22]。最后再用封口膜將蛋殼開孔封閉，然后將受精蛋置于溫度為37 ℃，濕度為70%的孵化器中孵育。

2 雞胚模型的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 雞胚模型在研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育畸形方面的應(yīng)用

神經(jīng)系統(tǒng)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）、周圍神經(jīng)系統(tǒng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)。

神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程包括細胞增殖、遷移、分化及軸通路的建立和突觸聯(lián)系，進而產(chǎn)生生理功能[23]。其中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育包括神經(jīng)管的形成、前腦發(fā)育、神經(jīng)母細胞增殖和遷移、皮質(zhì)組織和髓鞘形成[24]。在受孕后第28天左右，胚胎由于神經(jīng)發(fā)育不全及神經(jīng)組織形態(tài)發(fā)生改變而容易出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺陷[25]。臨床研究表明，每10 000例新生兒中約有14例出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形，若包括遲發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，真實發(fā)病率可能高達1%[26]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形是最常見的胎兒畸形之一，常見無腦兒、腦室擴張、小頭畸形、Dandy-Walker畸形、脊柱裂等癥狀。其中99%的畸形形成于胚胎期（孕3～8周），75%CNS畸形兒死于胎兒期（圍產(chǎn)期），活產(chǎn)兒發(fā)生率約0.1%～0.2%，僅次于心臟畸形[27]。自發(fā)性流產(chǎn)的病例中，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形發(fā)生率約3%～6%，約1/3全身畸形病例伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形中，由胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)管閉合失敗引起的神經(jīng)管缺陷（Neural Tube Defects，NTD）是最常見且最嚴(yán)重的先天性缺陷，發(fā)病率為6/10 000，影響0.5%～2%的妊娠[28]。胎兒NTD主要表現(xiàn)為無腦畸形、腦膨出、腦脊髓膜膨出、脊柱裂/隱性脊柱裂等，其中，又以脊柱裂為最常見的類型。NTD對胎兒將來生長發(fā)育和肢體運動功能會造成明顯的影響。據(jù)統(tǒng)計，中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形的病因中，單基因遺傳病約占7.5%，染色體異常（13號染色體的ZIC2基因相同位點突變[29]）約6%，環(huán)境因素（如母親感染、糖尿病、藥物、葉酸缺乏、放射線等）約占3.5%，遺傳（包括基因突變、特異性遺傳和染色體畸形）和環(huán)境相互作用占20%，不明原因占60%。

雞胚模型是研究神經(jīng)發(fā)育的重要動物模型，在發(fā)育早期，特別是最初的48 h，與人類胚胎第一個月的脊椎發(fā)育相似[30]。而且在早期發(fā)育階段，小雞胚胎平面化，更容易觀察體細胞形態(tài)和分化。因此，雞胚模型常被用于研究神經(jīng)管畸形的毒性和保護作用，是研究早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段的主要模式動物之一。

妊娠期糖尿?。℅estational diabetes mellitus，GDM）是造成胎兒NTD最常見的疾病原因之一。研究表明，妊娠早期糖尿病可通過干擾蛋白質(zhì)活性、引起細胞應(yīng)激和增加神經(jīng)形成所需組織中的程序性細胞死亡（凋亡）而導(dǎo)致胚胎神經(jīng)管缺陷。目前，在GDM致神經(jīng)管畸形的研究模型中使用較多且成熟的為糖尿病妊娠小鼠模式。糖尿病妊娠小鼠通常用鏈脲佐菌素造成母鼠糖尿病，再合籠交配，該方法存在實驗所需時間長、造模死亡率高、妊娠率不穩(wěn)定等問題。譚蕊蓉等[31]在第一胎齡日（EDD1）給予雞胚0.4 mmol/蛋的葡萄糖，發(fā)現(xiàn)高糖導(dǎo)致雞胚出現(xiàn)無腦、小腦或腦膨出等不同程度的NTD，表明成功建立了妊娠糖尿病雞胚NTD模型。關(guān)于高糖誘導(dǎo)胚胎NTD的內(nèi)在機制，Tan等[32]認為高糖使雞胚血漿和腦組織葡萄糖含量升高，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（Glucose transporter1，GLUT1）的表達下調(diào)，神經(jīng)管發(fā)育關(guān)鍵基因配對盒基因3（Pax3）蛋白的O-糖基化（O-Glycosylation，O-GlcNAc）修飾異常增加，抑制Pax3的轉(zhuǎn)錄功能，阻礙下游因子正常表達，最后導(dǎo)致胚胎神經(jīng)管閉合失敗。而在EDD0給予不同劑量內(nèi)源性小分子活性肽肌肽（0.1、0.5、1、5、10 nmol/蛋）均可有效降低高糖導(dǎo)致的胚胎死亡率、NTD發(fā)生率以及發(fā)育遲緩；而常用防治NTD藥物葉酸僅在5 nmol/蛋的劑量時可降低胚胎的死亡率、發(fā)育遲緩及NTD率，且效果明顯不及肌肽。類似地，Yan等[33]用高糖雞胚模型評價了玉米肽（Leu-Pro-Phe，LPF）在高糖條件下對胚胎NTD的保護作用，發(fā)現(xiàn)LPF可降低暴露于高糖條件下雞胚的NTD發(fā)生率，減輕高糖條件下細胞蛋白質(zhì)的總O-GlcNAc修飾化，恢復(fù)Pax3蛋白水平，再次證實妊娠高血糖誘導(dǎo)胚胎NTD可能與胚胎中己糖胺生物合成途徑及蛋白質(zhì)異常O-GlcNAc修飾有關(guān)。己糖胺生物合成途徑可能是防治GDM后代神經(jīng)管畸形的重要靶點，天然小分子活性肽對GDM子代NTD的發(fā)生有一定的干預(yù)作用。

除了母體疾病，化學(xué)物質(zhì)和物理環(huán)境對胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育也會造成不同程度的影響。利用雞胚模型，人們對多種化學(xué)和物理致畸因素進行了評價。鹽酸哌替啶是臨床常用的中樞性止疼藥，Rak?p等[34]給予EDD2的雞胚1、2.5、5、7.5 mg/kg 四個不同劑量的鹽酸哌替啶，每組15個雞蛋，持續(xù)孵育至48 h取出。結(jié)果表明1 mg/kg劑量的鹽酸哌替啶即可導(dǎo)致EDD2雞胚的神經(jīng)管閉合缺陷，且呈劑量依賴性。雙酚A（Bisphenol A，BPA）是合成聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂的常用原料，曾廣泛用于水瓶、嬰幼兒奶瓶、水杯以及食品和奶粉罐涂層。近年來研究發(fā)現(xiàn)，BPA具有類激素性質(zhì)以及致癌作用，大多數(shù)國家已禁止用于制造嬰幼兒奶瓶。利用雞胚模型，Atay等[35]評價了BPA對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。在孵育28 h時，給予雞胚1 ?M/蛋和10 ?M/蛋的BPA，孵育至48 h，結(jié)果表明20 pmol/蛋的雙酚A 能延遲中線閉合，對早期雞胚的神經(jīng)管發(fā)育產(chǎn)生不利影響。Ge等[36]探究了亞砷酸鈉（Sodium arsenite，SA）致雞胚NTD的作用及機制，并評價了膽堿（Choline，CHO）的改善效果。試驗結(jié)果表明，在Hamburger–Hamilton（HH）6階段給予100 nM SA并孵育72 h會使雞胚出現(xiàn)NTD，在HH6、8、12時給予25 ?g/mL CHO，結(jié)果表明給予SA導(dǎo)致胚胎存活率、胚胎體重和胚胎外血管面積的減少，同時伴隨著神經(jīng)管尾端閉合失敗的發(fā)生率顯著增加，而CHO對SA誘導(dǎo)的雞胚NTD具有保護作用：CHO在低劑量（25μg/μL）時逆轉(zhuǎn)了SA誘導(dǎo)的胚胎存活率下降和神經(jīng)管尾端閉合失敗的增加。此外，CHO不僅通過上調(diào)Bcl-2水平抑制SA誘導(dǎo)的細胞凋亡，而且通過增加DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3a的表達抑制DNA整體甲基化。Zhong等[37]還發(fā)現(xiàn)砷會導(dǎo)致雞胚細胞內(nèi)氧化物質(zhì)的增加及超氧化物歧化酶的活性降低。因此，SA致NTD的機制可能與擾亂甲基代謝及誘發(fā)氧化應(yīng)激有關(guān)。岡田酸（Okadaic acid，OA）是腹瀉性貝類毒素（Diarrheal shellfish poision，DSP）的主要成分，由海洋中渦鞭毛植物合成，通過貝類向人類傳遞。OA是海洋中分布最廣，致病率最高的毒素，但對其致畸作用的研究還較少。通過向孵育18 h的雞胚中給予100 ?L不同濃度的OA（20、50、100、200和500 nM），在EDD4.5的雞胚中觀察到包括顱骨異常、軀干異常等NTD，當(dāng)胚胎暴露于200 nM或500 nM的OA時胚胎死亡率最高約85%，而20 nM或50 nM的OA治療的死亡率約為30%，當(dāng)胚胎暴露于100 nM的OA時，頭部和軀干異常率約為40%。其機制可能是OA導(dǎo)致早期雞胚的氧化應(yīng)激，進而引發(fā)NTD的發(fā)生并抑制神經(jīng)元的分化[38]。咖啡因是一種黃嘌呤生物堿化合物，具有中樞興奮活性，不僅是藥品，也是廣泛應(yīng)用的食品添加劑。覃楊[39]給予EDD1.5的雞胚0.5、1.0、1.5 mg三個不同劑量的咖啡因（氣室注射），繼續(xù)孵育36 h取胚?？t染色結(jié)果顯示，咖啡因組雞胚均出現(xiàn)神經(jīng)管閉合缺陷，且可見組織結(jié)構(gòu)變形，細胞排列不規(guī)則等現(xiàn)象；免疫組化結(jié)果顯示0.5 mg咖啡因可致雞胚神經(jīng)發(fā)育缺陷，且更高劑量還影響神經(jīng)嵴細胞的分布與遷移，1.0 mg咖啡因可致神經(jīng)嵴細胞分布不均，1.5 mg咖啡因可抑制神經(jīng)嵴細胞的遷移。此外，有害金屬鎘也會透過胎盤屏障進入胚胎并危害早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。朱士勇[22]向孵育至HH4階段的受精蛋卵黃中分別注射5、10、50 ?M醋酸鎘溶液，繼續(xù)孵育至HH12取出。結(jié)果表明雞胚死亡率和畸形率均與鎘濃度呈劑量依賴性，5 ?M和10 ?M組的雞胚神經(jīng)管閉合完整，50 ?M組的雞胚明顯出現(xiàn)神經(jīng)管畸形（神經(jīng)管背側(cè)部分未閉合）。眾所周知，長效尼古丁幾乎對所有組織都有病理影響，包括小腦皮質(zhì)。Abd等[40]研究了尼古丁對孵化期雞胚小腦皮質(zhì)發(fā)育的影響，結(jié)果表明在孵化期內(nèi)，尼古丁對雞胚小腦皮質(zhì)的組織形成有明顯影響。在孵化第8天，尼古丁對小腦突起的分化有延遲作用，尤其是外顆粒層和內(nèi)皮質(zhì)層；在孵化第12天，小腦的葉狀結(jié)構(gòu)不規(guī)則，浦肯野細胞未被識別；在孵育第16天，小腦葉變得不規(guī)則，小腦皮質(zhì)中斷，浦肯野細胞排列不規(guī)則。

除上述化學(xué)因素外，物理因素也是常見的致畸因素。Kantarcioglu等[41]先將新鮮受精蛋孵育24 h后，再將雞胚胎暴露在不同的磁場（1-T、1.5-T、3-T）中10 min，繼續(xù)再孵育48 h后在體視鏡下觀察胚胎形狀，結(jié)果顯示與未暴露于磁場的胚胎相比暴露于磁場的胚胎的神經(jīng)管閉合缺陷和生長遲緩的發(fā)生率高，但1.5-T組的缺陷率高于3-T組。目前對神經(jīng)管畸形的研究，大部分還不夠深入，致畸機制尚不清楚。因此，后續(xù)需要開展更多的動物試驗和大規(guī)模的前瞻性臨床研究來進一步深入探索。

2.2 雞胚在心血管疾病研究中的應(yīng)用

心血管疾?。–ardiovascular disease，CVD）是心臟、血管和大腦血管系統(tǒng)疾病的統(tǒng)稱，包括心臟和腦部的全身性血管病變或系統(tǒng)性血管病變，CVD導(dǎo)致的死亡占全球死亡人數(shù)的近三分之一[42] 。除了遺傳和不良生活方式，CVD的發(fā)病還與胚胎期的發(fā)育情況有關(guān)[43]。雞胚是心血管發(fā)育的常用研究手段。雞胚心臟形成的關(guān)鍵點為EDD2、4.5和14。在EDD2，即HH10階段，雞胚融合形成原始的C形心管；在EDD4.5時心臟循環(huán)過程完成，發(fā)育形成四腔心；至EDD14時，心室壁的擴張和生長結(jié)束，形成成熟的心臟。

臨床和動物實驗研究均已證實慢性胎兒宮內(nèi)缺氧可引發(fā)胎兒心臟功能障礙，增加晚年患心血管疾病的風(fēng)險[44-45]。Itani等[46]采用缺氧條件下孵育的雞胚模擬胎兒宮內(nèi)缺氧，在常氧（21% O2）或缺氧（14%±0.5% O2）條件下，孵育至EDD18。結(jié)果顯示，與常氧胚胎比較，缺氧胚胎的血細胞比容及體重均減少，胚胎心臟3-硝基酪氨酸（3-Nitrotryrosine，3-NT）和4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenylaldehyde，4-HNE）的水平上升，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性顯著受損，心臟處于明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)。自EDD13給予1 mg/kg褪黑素，可降低缺氧雞胚心臟3-NT和4-HNE水平并恢復(fù)心臟的NOx水平，提高心臟過氧化氫酶活性，但不影響心臟超氧化物歧化酶表達，提示褪黑素可明顯減少雞胚的氧化應(yīng)激，提高內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)水平和恢復(fù)血管內(nèi)皮細胞生長因子（Vascular endothelial cell growth factor，VEGF）表達以及NO生物利用度，進而緩解了雞胚心臟的收縮和舒張能力以及外周循環(huán)中的內(nèi)皮功能障礙。為研究GDM引起的高血糖與胚胎血管發(fā)育之間的關(guān)系，Jin等[47]用雞胚卵黃囊膜（Yolk sac membrane，YSM）和雞胚絨毛尿囊膜（Chorioallantoic membrane，CAM）研究了高糖對雞胚血管生成的影響。具體實驗方法為：將38 ℃和70%濕度下孵育2.5 d的受精蛋的蛋殼去除，內(nèi)容物放進一個無菌玻璃器皿中，上面覆蓋一個水晶盤繼續(xù)孵育1h以使胚胎適應(yīng)其新環(huán)境。然后將胚胎定位在中心，把硅環(huán)放置YSM的前緣上，向含有胚胎的皿中加入50 ?L甘露醇（對照）或葡萄糖（25、50、100 mM）。在孵育12、24、36、48 h后分別測定并拍攝血管生成的圖像。由于高糖導(dǎo)致的滲透壓變化，使得胚胎血管叢的生長和擴展在高糖作用下受到阻礙，血管叢的密度與葡萄糖濃度呈負相關(guān)。Wang等[48]在雞胚HH3階段時給予雞胚50 mM葡萄糖，孵育到HH11階段時，高糖環(huán)境孵育中的雞胚表現(xiàn)出3種類型的心臟畸形：心室肥厚，右心室肥厚 ，心臟管的融合異常。Tan等[49]發(fā)現(xiàn)在EDD0給予胚胎葡萄糖，胚胎發(fā)育遲緩，卵黃囊血管發(fā)育會受損，給予抗氧化劑白藜蘆醇預(yù)保護，可降低雞胚死亡率，緩解發(fā)育遲緩及血管損傷。

除缺氧及高糖環(huán)境對胚胎心血管發(fā)育不利外，高鹽和農(nóng)藥等也是影響心臟發(fā)育的常見因素。利用雞胚模型，人們證實了高鹽對胚胎心血管發(fā)育有致畸作用。Wang等[50]向孵育36 h的受精雞蛋，分別給予500 ?L的0.7% NaCl（蛋的最終滲透壓為240 mosm/L，對照組）、16.85% NaCl（蛋的最終滲透壓為300 mosm/L）和維生素C（0.5 mg/蛋），繼續(xù)孵育72 h取出雞胚。試驗結(jié)果表明，高鹽組胚胎死亡率為67%，并出現(xiàn)異常心管循環(huán)和心腔充血兩種異常的心臟發(fā)育表型，細胞周期蛋白D1及G1期其他蛋白表達上調(diào)，心肌細胞出現(xiàn)異常增殖和凋亡，導(dǎo)致心肌肥大。與正常雞胚的YSM中相同位置的血管叢比較，高鹽雞胚的血管叢密度降低，說明高鹽抑制YSM中的血管生成。此外，高鹽過量導(dǎo)致ROS生成可能干擾心臟發(fā)育相關(guān)基因特異性同源盒轉(zhuǎn)錄因子（Nkx2.5）和人心肌轉(zhuǎn)錄因子4（GATA4）以及血管生成基因缺氧誘導(dǎo)因子（HIF2）和成纖維細胞生長因子2（FGF2）的表達。

吡蟲啉是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的殺蟲劑，人群易于直接或間接接觸。Gao等[51] 向EDD0的受精種蛋注入500 μM（127.8 mg/L）吡蟲啉，到HH4階段再次注射吡蟲啉，然后繼續(xù)孵育至EDD4.5和EDD14。與對照組相比，給予吡蟲啉后，無論是EDD4.5還是EDD14的胚胎，心室壁的厚度和小梁肌均減少，心臟更小且重量更低。同時發(fā)現(xiàn)吡蟲啉處理21 h的胚胎比對照組雞胚生長的快，但至給藥48 h，發(fā)育較正常雞胚稍有延遲。結(jié)果表明吡蟲啉影響了胚胎心臟血管形成過程中的細胞遷移和細胞分化。綜上，目前雞胚模型越來越被廣泛用于心血管疾病的研究，但大多數(shù)研究并未深入探討其作用機制。

2.3 雞胚在表觀遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用

表觀遺傳學(xué)指研究由潛在DNA序列改變以外的機制引起的基因表達或細胞表型的變化，基因表達的表觀遺傳調(diào)控是通過外部環(huán)境與核酸編碼信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯相互作用實現(xiàn)的。常見的表觀修飾有：甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等。溫度、營養(yǎng)、衛(wèi)生條件、壓力等各種外部因素均會導(dǎo)致表觀遺傳變化，可能會影響個體的表型特征[10]。由于雞胚在母體外發(fā)育，在體內(nèi)和體外都較容易操作，而且可以嚴(yán)格控制孵化溫度和濕度等環(huán)境因素，使個體間的環(huán)境變異性實現(xiàn)最小化[52]。因此，雞胚模型是進行表觀遺傳學(xué)研究的常用模型。

班謙等[53]檢測了家雞雞胚在發(fā)育3、7、12、15日齡時的DNA甲基化水平，提取基因組DNA并采用甲基敏感擴增片段多態(tài)性（Methylation sensitive amplified polymorphism， MSAP）技術(shù)對其甲基化水平進行了初步檢測，發(fā)現(xiàn)在880個CCGG位點中，單鏈外側(cè)的胞嘧啶甲基化位點比例為20.48%，雙鏈CCGG位點的內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化為19.30％，兩者總比例為39.78%，說明雞胚發(fā)育過程中DNA甲基化水平呈升高趨勢，即DNA甲基化基因組印記等表觀遺傳現(xiàn)象在胚胎發(fā)育中都有著相應(yīng)的體現(xiàn)。同時，該研究還表明當(dāng)減少3倍的甲基胞嘧啶，在胚胎干細胞的增殖或生命力中沒有出現(xiàn)可檢測的影響；但減少相同量的胚胎DNA甲基化則會導(dǎo)致異常的生長發(fā)育和胚胎的致死現(xiàn)象。因此證明了這種甲基化水平遞升的結(jié)果和表觀遺傳觀點是符合的。李世召[54]以維生素C為營養(yǎng)素，以雞胚給養(yǎng)為手段，在獲取雞胚DNA甲基化模式的基礎(chǔ)上，在胚胎EDD2～4、EDD5～13、EDD14～19不同時間給予維生素C，初步探究了胚胎期補充維生素C調(diào)控肉雞生長和免疫的機理。實驗結(jié)果表明，胚胎發(fā)育后期肝臟的DNA甲基化水平顯著高于心臟和肌肉。在胚胎期第11天和第15天給予3 mg維生素C能提高種蛋的孵化率并在一定程度上改善了肉雞的生產(chǎn)性能、抗氧化能力、免疫功能和腸道形態(tài)均有所提升。免疫功能的提高可能與DNA甲基化和組蛋白乙?；降奶岣哂嘘P(guān)。還有研究將不同胚胎發(fā)育點（EDD7、EDD11、EDD17）雞胚的肌肉組織全基因組DNA甲基化圖譜和轉(zhuǎn)錄本分別用于全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）和RNA測序，發(fā)現(xiàn)差異甲基化基因（Differential methylation gene，DMGs）與胚胎肌肉器官發(fā)育、骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖調(diào)控和肌動蛋白細絲解聚顯著相關(guān)。胚胎發(fā)育中的重要轉(zhuǎn)錄因子TBX1、MEF2D、SpeG、CFL2和TWF2與甲基化引起的表達轉(zhuǎn)換密切相關(guān)[55]。Li等[56]通過高效液相色譜檢測了雞胚發(fā)生過程中基因組DNA甲基化的變化，用亞硫酸氫鹽測序聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法鑒定兩個特定基因（IGF2和腫瘤壞死因子-α）所涉及的啟動子和基因體的甲基化程度及檢測了IGF2、腫瘤壞死因子-α和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1、3a和3b的表達水平。結(jié)果表明，胚胎發(fā)育過程中肝臟、心臟和肌肉的基因組DNA甲基化水平顯著升高，肝臟的甲基化水平在胚胎發(fā)育中后期顯著升高。在肌肉和肝臟中，腫瘤壞死因子-α的啟動子甲基化水平先升高后降低，而基因體甲基化水平在胚胎EDD8、EDD11和EDD14時保持較低水平，在EDD17時顯著升高。IGF2啟動子甲基化水平持續(xù)下降，而基因體甲基化水平持續(xù)上升。腫瘤壞死因子-α的表達在胎齡EDD8、EDD11和EDD14三個胎齡間無明顯差異，但在EDD17有顯著升高。IGF2的表達水平在受檢的胚胎階段呈上升趨勢。盡管人類與雞胚組織間存在一定的差異，但是已經(jīng)有許多研究確證了表觀遺傳修飾水平的改變對發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控是廣泛存在的[57-58]。

2.4? ?雞胚模型在免疫學(xué)及抗病毒、微生物感染研究中的應(yīng)用

免疫系統(tǒng)失調(diào)與許多疾病有關(guān)，包括心血管疾病、糖尿病和癌癥等，與其他經(jīng)典模型相比，雞胚胎及其絨毛尿囊膜具有成本低、省時、操作簡便等優(yōu)點。在雞胚發(fā)育過程中，首先發(fā)育的淋巴器官是胸腺，胸腺原基首先出現(xiàn)在EDD3，在EDD10～11時可以檢測到T細胞，B細胞可以在EDD11～12檢測到，器官在EDD12時完全發(fā)育，免疫球蛋白基因僅在卵黃囊中約EDD10時可以檢測到[12]。因此，雞胚模型用于免疫學(xué)研究時至少在胚胎發(fā)育10d后才能檢測。最近的一項研究表明，雞脾臟中的幾個不同巨噬細胞亞群可能在抗原提呈和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[59]。除了免疫學(xué)研究外，Khan等[60]用雞胚模型評估黃芪根水提取物和甲醇提取物對禽流感H9病毒的抗病毒活性，將不同濃度（400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.12 ?g/mL）的黃芪根水和甲醇提取物與標(biāo)準(zhǔn)病毒接種劑混合，并在37 ℃下孵育30 min，再將其注入雞胚。在接種72 h后收集絨毛尿囊液，用血凝試驗評估病毒的生長。結(jié)果表明，黃芪根水提物和甲醇提取物均具有一定的抗病毒活性。Quereda等[61]在尿囊腔感染的雞胚中評估了流行譜系I單增李斯特菌菌株的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C、廣泛磷脂酶C、李斯特菌溶血素O和李斯特菌溶血素S這四種外毒素的毒力影響，先將受精蛋孵育9 d，再接種100 μL細菌懸浮液，繼續(xù)孵育48 h。結(jié)果表明磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C在單增李斯特菌的感染生命周期中可能發(fā)揮著重要作用?？傊?，雞胚模型已經(jīng)為我們理解免疫學(xué)做出了有價值的貢獻，是公認的研究免疫的極佳模型[62]。

2.5 雞胚在發(fā)育毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

由于雞胚生長快速，且不受母體代謝影響，因而雞胚在用于毒性發(fā)育研究的動物模型中占有特殊地位，為研究發(fā)生在早期階段的藥物或其他物質(zhì)對器官發(fā)育、體重和氧化應(yīng)激的毒性作用提供了敏感模型。除前述用于評價對神經(jīng)系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響外，雞胚也廣泛應(yīng)用于其它器官的毒理學(xué)研究，Nguyen等[63]利用雞胚模型評價叔丁基苯基磷酸鹽和異丙基苯基磷酸鹽對不同發(fā)育階段雞胚的發(fā)育毒性及肝臟基因表達的影響，結(jié)果表明兩種化合物在肝臟基因表達上有顯著差異，最顯著的轉(zhuǎn)錄組效應(yīng)發(fā)生在孵化中期，與外源代謝、膽汁酸/膽固醇調(diào)節(jié)和氧化應(yīng)激相關(guān)的基因明顯失調(diào)。Samak等[15]詳細評估了在雞胚模型中胚胎開始發(fā)育時給予各種類型的炭黑納米材料的毒性?，F(xiàn)在，雞胚絨毛尿囊膜（CAM）試驗已是評估納米毒性和納米顆粒在體內(nèi)累積分布的一種常規(guī)試驗[64]。綜上所述，這些研究及發(fā)現(xiàn)可能為未來發(fā)育毒理學(xué)在雞胚模型上的應(yīng)用提供有益的參照并使創(chuàng)新納米療法的風(fēng)險評估方法合格。

2.6? ?雞胚在其他研究中的應(yīng)用

雞胚在病毒學(xué)、免疫學(xué)、毒理學(xué)和胚胎學(xué)等多個研究領(lǐng)域已被用作替代實驗動物，除以上研究領(lǐng)域外，還可以作為藥效和療法評價的體內(nèi)模型。向攜帶腫瘤的15日齡雞胚中給予依他硝唑和X射線照射3 d，發(fā)現(xiàn)8GyX射線照射和1.0 mg依他硝唑的聯(lián)合治療能顯著抑制35%的腫瘤生長，成功評價了依他硝唑的體內(nèi)放射增敏活性[65]。該研究表明使用攜帶腫瘤的雞胚模型可能是評估放射增敏活性的一種有前途的一部分。目前，雞胚廣泛應(yīng)用于多種癌癥的研究，包括胰腺癌[66]、腎細胞癌[67]、婦科癌癥和尿路上皮癌[68]。由于雞胚來源方便，數(shù)量大，方便操作，可作為候選藥物的前期篩選。Song等[69]利用雞胚和斑馬魚評價8-羥基喹啉衍生物PH151和PH153的抗真菌活性和毒理學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明PH151和PH153具有治療系統(tǒng)性念珠菌病的潛力，并證明它們是利用哺乳動物模型進行進一步研究的合適候選藥物。

3 總結(jié)與展望

雞胚模型因在母體外發(fā)育，易操作且血管豐富，組織結(jié)構(gòu)和血管可以通過照明燈直接觀察胚胎發(fā)育過程。由于雞胚所需設(shè)備及孵育條件簡易、發(fā)育周期短、成本低廉，來源廣，且發(fā)育過程與哺乳動物相似，也被用于發(fā)育學(xué)、毒理學(xué)、免疫學(xué)、藥物評價以及疫苗生產(chǎn)。近年來，雞胚模型除了應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，還逐漸被用于化妝品對皮膚、眼部的刺激及毒性研究。然而，雞胚模型也存在一定的局限性，例如抗體的種類有限、采血困難等，相信隨著實驗技術(shù)的發(fā)展，這些問題可得到解決。在未來雞胚模型會在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大作用，受到越來越多研究者們的關(guān)注和喜愛。

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Applied Research on Chicken Embryo Model

LI Xiyou， HUANG Rongping， GU Xiaoyuan， HAN Shaocong， WANG Wei， LI Weixi

（College of Traditional Chinese Medicine， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming? 650500， Yunnan， China）

Abstract：? Chicken embryos are used as a model system for study of embryonic development， toxicology， pharmacology and immunology. Comparing with mammalian animals， chicken embryos have several important advantages： embryo maturation ex utero until hatching， simplicity of direct manipulation， low-cost， and abundant supply. Moreover， the developmental morphological change and angiogenesis can be easily observed. This review summarized the current application of the chick embryo model， and provided the beneficial reference for the future application.

Keywords：? Chicken embryo model; Neural tube malformation; Cardiac malformation; Epigenetics; Immunology

*基金項目：國家自然科學(xué)基金（81960780）；云南省基礎(chǔ)研究中醫(yī)聯(lián)合專項[2019FF002（-007）]；云南省教育廳科學(xué)研究基金項目（2023J0543）。

第一作者簡介：李希尤（1997—），女，碩士研究生，研究方向：中藥活性成分研究，E-mail：18468295405@163.com。

**通信作者簡介：李維熙（1982—），女，博士，副教授，研究方向：中藥活性及物質(zhì)基礎(chǔ)研究，E-mail：liweixi1001@163.com。