高崴崴,劉待見,張曉萍,馮青青,劉穎

(鄭州大學第二附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科,河南 鄭州 450000)

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性、進行性、纖維化間質(zhì)性肺炎,其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢,多發(fā)于成年人。但因發(fā)病機制至今仍不明確,目前尚無有效的治療方法。IPF起病隱匿,主要表現(xiàn)為活動性呼吸困難、漸進性加重[1-2]。患者常出現(xiàn)肺泡上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),引發(fā)成纖維細胞過度增殖,間質(zhì)細胞外基質(zhì)明顯沉積,最終出現(xiàn)肺纖維化[3-4]。A549細胞具有Ⅱ型肺泡上皮細胞的形態(tài)和特征,采用轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMT,是目前常用的構(gòu)建肺纖維化細胞模型的方法[5-6]。

造血細胞特異性蛋白1相關(guān)蛋白X-1(hematopoietic cell-specific protein1-associated protein X-1,HAX-1)是一種廣泛表達于人體組織的多功能蛋白[7]。HAX-1主要分布在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜附近的細胞質(zhì)中[8-9]。研究顯示,HAX-1在惡性腫瘤中呈高表達,并促進乳腺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、肝細胞癌等腫瘤細胞的增殖和侵襲[10-13]。文獻表明,HAX-1可通過誘導(dǎo)EMT過程進而促進肝癌細胞的侵襲和遷移[14]。流感病毒感染是導(dǎo)致肺泡上皮細胞EMT及肺纖維化的重要因素[15-16],而HAX-1可以通過與PB1-F2相互作用促進禽流感病毒在肺泡上皮細胞中的復(fù)制,并能抑制細胞凋亡,延長細胞壽命[17]。因此,推測HAX-1可能會促進肺泡上皮細胞的EMT過程。本研究擬探討HAX-1在肺泡上皮細胞EMT過程中的作用及其作用機制,為IPF的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料A549細胞購自美國ATCC公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司; TGF-β1、SIS3(SMAD3特異性抑制劑)購自美國Sigma-Aldrich公司;BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液購自南京建成生物工程研究所;兔抗HAX-1多克隆抗體(ab137613)、兔抗鼠雙微體基因2(murine double minute 2,MDM2)單克隆抗體(ab259265)、兔抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體(ab308347)、兔抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)多克隆抗體(ab5694)、兔抗Ⅰ型膠原α1鏈(collagen type Ⅰ alpha 1 chain,COL1A1)單克隆抗體(ab138492)、兔抗SMAD3多克隆抗體(ab84177)、兔抗p-SMAD3(phospho S423 + S425)多克隆抗體(ab118825)、小鼠抗GAPDH單克隆抗體(ab8245)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(ab6721))、辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG(ab6728)購自英國Abcam公司;三色預(yù)染蛋白分子量marker(8～180 kD,20350ES72)購自翌圣生物科技股份有限公司;HAX-1 siRNA及MDM2過表達質(zhì)粒pcDNA.3.1-MDM2購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;Turbofect購自賽默飛世爾科技公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組A549細胞采用含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 U·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于細胞培養(yǎng)箱(體積分數(shù)5% CO2、37 ℃)培養(yǎng)至細胞融合度80%,以2.5 g·L-1胰蛋白酶消化細胞并傳代。將細胞分為對照組(無處理)、TGF-β1組(用5 μg·L-1的TGF-β1誘導(dǎo)48 h)、NC si組(用陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞,再用5 μg·L-1的TGF-β1誘導(dǎo)48 h)、HAX-1 si組(用HAX-1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞,再用5 μg·L-1的TGF-β1誘導(dǎo)48 h)、HAX-1 si+pcDNA3.1組(用HAX-1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞,再用pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,再用5 μg·L-1的TGF-β1誘導(dǎo)48 h)、HAX-1 si+MDM2組(用HAX-1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞,再用MDM2過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-MDM2轉(zhuǎn)染細胞,再用5 μg·L-1的TGF-β1誘導(dǎo)48 h)、HAX-1 si+MDM2+DMSO組(用HAX-1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞,再用MDM2過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-MDM2轉(zhuǎn)染細胞,向細胞培養(yǎng)液中加入溶劑DMSO處理細胞30 min,再用5 μg·L-1的TGF-β1誘導(dǎo)48 h)、HAX-1 si+MDM2+SIS3組(用HAX-1 siRNA轉(zhuǎn)染細胞,再用MDM2過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-MDM2轉(zhuǎn)染細胞,用終濃度為1 μmol·L-1溶于DMSO的SIS3處理細胞30 min,再用5 μg·L-1的TGF-β1誘導(dǎo)48 h)。各組細胞培養(yǎng)結(jié)束后,采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài);采用Western blot檢測相應(yīng)目的蛋白的表達。

1.3 Western blot檢測目的蛋白的表達收集細胞,采用RIPA裂解液裂解細胞,提取總蛋白,采用BCA蛋白試劑盒(美國Thermo Fisher公司)測定蛋白濃度。取50 μg蛋白,進行凝膠電泳(SDS-PAGE,100 g·L-1)。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF),用50 g·L-1脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h。加入一抗:anti-HAX-1(1∶1 000)、anti-E-cadherin(1∶1 000)、anti-α-SMA(1∶1 000)、anti-COL1A1(1∶1 000)、anti-MDM2(1∶1 000)、anti-SMAD3(1∶1 000)、anti-p-SMAD3(1∶1 000)和anti-GAPDH(1∶2 000),于4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后,加入辣根過氧化物酶標記的相應(yīng)二抗,室溫孵育1 h。用增強化學發(fā)光液ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白的相對表達水平。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1 d將A549細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液,接種于6孔板中,密度為每孔3×105,加入不含抗生素、含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,待細胞生長至40%融合時,將HAX-1 siRNA(0.3 μg)、陰性對照NC siRNA(0.3 μg)、MDM2過表達質(zhì)粒pcDNA.3.1-MDM2(0.3 μg)或空質(zhì)粒pcDNA.3.1(0.3 μg)與0.6 μL Turbofect混勻,而后轉(zhuǎn)染細胞,37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱孵育,24 h后再用TGF-β1誘導(dǎo)。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對A549細胞EMT和HAX-1表達的影響采用TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞48 h,結(jié)果顯示,TGF-β1組細胞形態(tài)由鵝卵石形或多角形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮巍⒓忓N形,細胞間連接變松散,呈現(xiàn)間充質(zhì)細胞形態(tài)(圖1A)。Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,TGF-β1組細胞E-cadherin的蛋白表達降低,α-SMA、COL1A1和HAX-1的蛋白表達升高(P<0.05)(圖1B)。

A為TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞鏡下形態(tài)(200×);B為A549細胞HAX-1蛋白表達,與對照組比較,*P<0.05。圖1 TGF-β1對A549細胞EMT和HAX-1蛋白表達的影響

2.2 HAX-1 siRNA轉(zhuǎn)染對TGF-β1誘導(dǎo)的細胞纖維化的影響與TGF-β1組和NC si組相比,HAX-1 si組中細胞形態(tài)又轉(zhuǎn)變?yōu)轾Z卵石形或多角形(圖2)。Western blot結(jié)果表明,與NC si組比較,HAX-1 si組中HAX-1表達降低,E-cadherin蛋白表達升高,HAX-1、α-SMA和COL1A1的蛋白表達均降低(P<0.05)(圖3)。

圖2 HAX-1 siRNA轉(zhuǎn)染對TGF-β1誘導(dǎo)的細胞形態(tài)變化的影響(200×)

與NC si組比較,*P<0.05。圖3 HAX-1 siRNA轉(zhuǎn)染對TGF-β1誘導(dǎo)的細胞纖維化的影響

2.3 HAX-1 siRNA轉(zhuǎn)染對TGF-β1誘導(dǎo)的MDM2和p-SMAD3表達的影響Western blot結(jié)果表明,與NC si組比較,HAX-1 si組MDM2和p-SMAD3表達均降低(P<0.05)(圖4)。

與NC si組比較,*P<0.05。圖4 HAX-1 siRNA轉(zhuǎn)染對TGF-β1誘導(dǎo)的MDM2和p-SMAD3表達的影響

2.4 HAX-1通過MDM2調(diào)控SMAD3磷酸化Western blot結(jié)果顯示,與HAX-1 si+pcDNA3.1組相比,HAX-1 si+MDM2組MDM2和p-SMAD3蛋白表達均升高(P<0.05)(圖5);同時,E-cadherin蛋白表達降低,α-SMA和COL1A1蛋白表達升高(P<0.05)(圖6)。

與HAX-1 si+pcDNA3.1組比較,*P<0.05。圖5 MDM2過表達對TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞中SMAD3磷酸化的調(diào)控

與HAX-1 si+pcDNA3.1組比較,*P<0.05。圖6 MDM2過表達對TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞EMT的影響

2.5 HAX-1通過調(diào)節(jié)SMAD3磷酸化調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的細胞纖維化為了進一步探究SMAD3在HAX-1調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞纖維化中的作用,采用SIS3(1 μmol·L-1)處理HAX-1敲低且MDM2過表達的A549細胞30 min,再采用TGF-β1誘導(dǎo)48 h,結(jié)果顯示,SIS3處理后細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)轾Z卵石形或多角形(圖7);Western blot結(jié)果顯示,與HAX-1 si+MDM2+DMSO組比較,HAX-1 si+MDM2+SIS3組細胞E-cadherin蛋白表達升高,p-SMAD3、α-SMA和COL1A1的蛋白表達下降(圖8)。

圖7 SIS3對TGF-β1誘導(dǎo)的細胞形態(tài)變化的影響(200×)

與HAX-1 si+MDM2+DMSO組比較,*P<0.05。圖8 SIS3對TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞EMT的影響

3 討論

EMT是肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵過程,主要表現(xiàn)為細胞黏附分子中的E-cadherin表達缺失,上皮細胞標志物下調(diào),間質(zhì)細胞標志物中的α-SMA表達上調(diào),細胞極性消失,形成類似成纖維細胞的形態(tài)[18-19]。COL1A1的表達也是纖維化的標志[20]。A549細胞具有Ⅱ型肺泡上皮細胞的形態(tài)和特征,采用TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMT是目前常用的構(gòu)建肺纖維化細胞模型的方法[5-6]。

以往文獻報道,HAX-1可以促進肝癌[14]、下咽鱗狀細胞癌[21-22]的EMT過程,進而促進腫瘤細胞的惡性程度,并且肝癌中HAX-1水平越高,患者預(yù)后越差。本研究采用TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞制備肺纖維化細胞模型,結(jié)果顯示,TGF-β1誘導(dǎo)后HAX-1蛋白表達上調(diào),而采用siRNA敲低HAX-1可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞EMT過程。這說明HAX-1可以促進肺泡上皮細胞的EMT過程。

MDM2是細胞最主要的凋亡抑制蛋白之一,并且與腫瘤細胞EMT過程有密切關(guān)系[23]。文獻報道顯示,MDM2可以促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞[24]、卵巢癌細胞[25]等多種細胞的EMT過程,進而促進腫瘤耐藥和轉(zhuǎn)移。Deng等[13]研究表明,在膠質(zhì)母細胞瘤細胞中,下調(diào)HAX-1可抑制MDM2表達。本研究結(jié)果也顯示,HAX-1敲低抑制MDM2蛋白表達。TGF-β1/SMAD是EMT過程的經(jīng)典通路[26]。有文獻表明,MDM2通過激活SMAD信號通路促進肺腺癌細胞EMT進程[27]。因此,推測HAX-1可通過MDM2調(diào)節(jié)SMAD3活性,從而調(diào)控A549細胞EMT過程。本結(jié)果顯示,HAX-1敲低可抑制MDM2蛋白表達和SMAD磷酸化水平,同時過表達MDM2可上調(diào)SMAD3磷酸化水平且促進EMT發(fā)生,說明MDM2過表達可有效抵消干擾HAX-1對p-SMAD3表達量和EMT過程的抑制作用。

由于時間和經(jīng)費限制,本研究結(jié)論未能在動物體內(nèi)進行驗證,下一步將采用氣道滴注博來霉素構(gòu)建IPF小鼠模型[28],在動物體內(nèi)研究HAX-1在IPF中的作用及機制。

綜上,本研究證實,HAX-1在TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞中高表達,HAX-1敲低可通過MDM2/SMAD3通路抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡細胞纖維化過程,這為IPF的防治提供新的潛在靶標和理論基礎(chǔ)。