李 芳,陳正君,葛俊李,王春霞,梁建慶,馮翠娟,楊扶德*
黨參經(jīng)PI3K/Akt干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎黏膜細胞鐵死亡-線粒體動力學(xué)失衡的機制研究
李 芳1,陳正君1,葛俊李1,王春霞1,梁建慶2,馮翠娟3,楊扶德1*
1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730300
探究黨參經(jīng)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)調(diào)控Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子E相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)/谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、線粒體動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein1,DRP1)信號通路抑制氧化應(yīng)激干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)腸黏膜細胞鐵死亡-線粒體動力學(xué)失衡的分子機制。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析預(yù)測黨參干預(yù)UC的關(guān)鍵信號通路。SD大鼠采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid,TNBS)-乙醇復(fù)合方法制備UC模型,隨機分為對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶(0.3 g/kg)組、鐵抑制劑Ferrostatin-1(0.8 mg/kg)組和黨參高、中、低劑量(18、9、4.5 g/kg)組,每組12只;給予藥物連續(xù)干預(yù)7 d,收集各組大鼠血清、結(jié)腸組織。采用蘇木素-伊紅(HE)染色進行組織病理觀察及結(jié)腸黏膜組織學(xué)損傷評分(tissue damage index,TDI);ELISA法檢測血清中Fe2+、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-8、GPX4、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、-乳酸含量;生化法檢測血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力及丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,檢測結(jié)腸組織三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量及髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、Ca2+, Mg2+-ATP酶、Na+, K+-ATP酶、ATP酶活力。轉(zhuǎn)錄測序分析對照組、模型組、黨參高劑量組結(jié)腸組織差異表達基因,并進行KEGG通路富集分析獲得黨參干預(yù)UC差異表達信號通路。Western blotting檢測結(jié)腸組織p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Keap1、Nrf2、GPX4、重組人鐵蛋白重鏈(recombinant Human Ferritin heavy chain,F(xiàn)TH1)、DRP1和線粒體轉(zhuǎn)運蛋白(mitochondrial Rho-GTP,MIRO)蛋白表達;qRT-PCR檢測結(jié)腸組織、、、、、mRNA表達。病理觀察及評分結(jié)果顯示黨參有效改善了結(jié)腸組織的炎癥水腫狀態(tài);網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果表明黨參干預(yù)UC關(guān)鍵靶點顯著富集于PI3K/Akt信號通路。ELISA實驗結(jié)果表明黨參可有效降低UC模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、-乳酸、CRP水平(<0.05、0.01、0.001),抑制炎癥;降低血清Fe2+、MDA含量及MPO活力(<0.001),升高血清GPX4、GSH水平及SOD活力(<0.001),抑制氧化應(yīng)激;升高結(jié)腸組織ATP含量及ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶、Na+, K+-ATP酶活力(<0.05、0.01、0.001),提升能量代謝。轉(zhuǎn)錄組學(xué)KEGG通路分析提示對照組模型組差異基因及黨參高劑量組模型組差異基因均顯著富集于PI3K/Akt等信號通路。Western blotting實驗結(jié)果確證黨參可有效下調(diào)結(jié)腸組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Keap1、MIRO和DRP1蛋白表達(<0.05、0.01、0.001),上調(diào)Nrf2、FTH1和GPX4蛋白表達(<0.05、0.01、0.001),發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抑制鐵死亡、調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)作用。qRT-PCR實驗結(jié)果亦表明黨參可有效下調(diào)結(jié)腸組織、、基因表達(<0.05、0.001),上調(diào)、、基因表達(<0.05、0.01、0.001)。黨參是干預(yù)UC的有效藥物,其機制可能與經(jīng)PI3K/Akt干預(yù)Keap1/Nrf2/GPX4、DRP1信號通路抑制腸黏膜細胞線粒體動力學(xué)失衡-鐵死亡氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。
黨參;潰瘍性結(jié)腸炎;PI3K/Akt;氧化應(yīng)激;線粒體動力學(xué)失衡;鐵死亡;黨參炔苷;蒼術(shù)內(nèi)酯III
隨著國民生活水平日益提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變,潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)發(fā)病人群數(shù)量逐年增高,患者以腹痛、腹瀉、黏液膿血便、體質(zhì)量減輕等為主要癥狀,部分患者伴發(fā)腸病性關(guān)節(jié)炎、肝膽管等腸外病[1],病情遷延且復(fù)發(fā)率高,是誘發(fā)結(jié)腸癌的主要危險因素之一[2],己成為我國消化系統(tǒng)常見性難治疾病。UC的治療目前主要依賴藥物控制癥狀,氨基水楊酸類藥物、皮質(zhì)類固醇類激素、免疫抑制劑及抗腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)制劑等是目前治療UC的主要藥物,但腹痛、發(fā)燒、腹瀉、抽筋、皮疹和腎衰竭以及不耐受性的諸多不良反應(yīng)嚴重限制了臨床使用。
近年來,大量研究顯示應(yīng)用中藥對炎癥性腸病具有良好的治療效果。中藥黨參以桔梗科植物黨參(Franch.) Nannf.、素花黨參Nannf. var.(Nannf.) L. T. Shen或川黨參Oliv.的干燥根入藥,具有健脾益肺、養(yǎng)血生津之功的補益類中藥,《本草正義》中指出其效用“與人參不甚相遠”[3],且具有毒性小、補益作用緩和的特點[4]。數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果顯示黨參及其配伍為治療UC的高頻次藥物[5-7]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,黨參含有多糖類、黃酮類、萜類、炔類、苯丙素類、生物堿類等多種化學(xué)成分,課題組前期實驗證明了黨參水煎液對UC模型大鼠具有良好的干預(yù)效應(yīng),其作用機制可能與抑制炎癥及氧化應(yīng)激有關(guān)[8-9],但其機制闡述尚不完全明確,制約了黨參的臨床應(yīng)用。
中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是可以對中藥的分子復(fù)雜性與復(fù)雜疾病間的分子關(guān)聯(lián)進行系統(tǒng)探索的有效方法,轉(zhuǎn)錄組學(xué)所強調(diào)的完整性和系統(tǒng)性與中醫(yī)藥整體辨證觀吻合[10-14],二者的聯(lián)合使用為多成分、多目標的治療作用機制研究提供了新的突破視角。本研究運用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集確證了磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路在黨參干預(yù)UC中的核心作用,并基于PI3K/Akt信號通路進一步探究黨參通過調(diào)控Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子E相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)/ 谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)信號通路及線粒體動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein1,DRP1),從而抑制黏膜細胞鐵死亡,維護線粒體動力學(xué)功能以維持黏膜屏障功能的作用機制,為黨參臨床治療UC提供理論依據(jù)。
SPF級SD雄性大鼠(體質(zhì)量180~220 g)由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供,實驗動物許可證號[SCXK(京)2019-0010],分籠飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,室溫(22±2)℃,相對濕度50%~70%,晝夜自然明暗交替光照,顆粒飼料喂養(yǎng),自由飲水。動物實驗獲得甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(批準號2022-022)。
黨參(甘20160027)購自甘肅康樂藥業(yè)有限責任公司,經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定為桔梗科植物黨參(Franch.) Nannf.的干燥根。
柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine tablets,SASP)腸溶片(0.25 mg/片,批號NO.9210105)購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid,TNBS,批號MB5547-1)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;鐵抑制劑Ferrostatin-1(Fer-1,批號HY-100579)購自美國Med Chem Express公司;水合氯醛(批號20211201)購自天津市大茂化學(xué)試劑廠;大鼠C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)ELISA試劑盒(批號MM-0081R2)、白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)ELISA試劑盒(批號MM-0175R2)、IL-6 ELISA試劑盒(批號MM-0190R1)、IL-1β ELISA試劑盒(批號MM-0047R2)、TNF-α ELISA試劑盒(批號MM-0180R2)、-乳酸ELISA試劑盒(批號MM-21239R2)均購自江蘇菲亞生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒(批號A001-1-1)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(批號A003-1-1)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒(批號A044-1-1)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒(批號A006-2-1)均購自南京建成生物研究所;p-Akt抗體(批號130387)購自美國CST公司;β-actin抗體(批號GTX109639)、Akt抗體(批號GTX121937)、p-PI3K抗體(批號GTX132597)、Keap1抗體(批號GTX54329)、Nrf2抗體(批號GTX103322)、DRP1抗體(批號GTX135364)均購自美國GeneTex公司;PI3K抗體(批號YT6156)購自美國Immunoway公司;重組人鐵蛋白重鏈(recombinant human ferritin heavy chain,F(xiàn)TH1)抗體(批號Ab183781)、GPX4抗體(批號Ab125066)、線粒體轉(zhuǎn)運蛋白(mitochondrial Rho-GTP,MIRO)抗體(批號Ab88029)均購自英國Abcam公司;Hieff?Qpcr SYBR Green Master Mix(批號11202ES08)購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。
Vanquish 超高液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)、NC2000型Nanodrop超微量分光光度計、ST16R型高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司);DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);GelDoc 2000型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);Tissuelyser-48型研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司);PS-60AL型超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司);SpectraMax i3x酶標儀[美谷分子儀器(上海)有限公司]。
取黨參1 kg,加入8倍量的水浸泡1 h后,加熱煮沸,沸騰后文火煎熬1 h,收集藥液。重復(fù)2次,合并藥液,濾過后趁熱抽濾,濃縮藥液至以生藥量計為1.0 g/mL。采用HPLC法測定黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯III質(zhì)量分數(shù)分別為0.261 2、0.019 2 mg/g。除菌,裝瓶,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
84只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機取12只作為對照組,其余72只作為造模組,禁食禁水24 h后采用TNBS-乙醇復(fù)合法制作UC模型。大鼠出現(xiàn)食欲減退、懶動、消瘦、拱背、毛色暗淡毛糙狀態(tài),稀便、黏液便、血便,隱血試驗陽性為造模成功。造模成功大鼠隨機分為模型組、SASP(0.3 g/kg)組、Fer-1(0.8 mg/kg)組和黨參高、中、低劑量(18、9、4.5 g/kg)組,每組12只,分籠飼養(yǎng)。各給藥組ig相應(yīng)藥物(10 mL/kg),對照組和模型組ig等體積生理鹽水,1次/d,連續(xù)7 d。
末次給藥后,各組大鼠禁食不禁水24 h,ip 10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉,腹主動脈取血后室溫靜置30 min,4 ℃、3500 r/min離心10 min,分離血清,?80 ℃冷凍保存。頸椎脫臼處死大鼠,分離大鼠病結(jié)腸病變嚴重部位組織,置于預(yù)冷的生理鹽水中,漂洗后置于加入RNAiso Plus試劑的無酶凍存管中,經(jīng)液氮速凍后,置于?80 ℃冰箱中保存待檢。
將結(jié)腸組織于4%多聚甲醛中固定,按照浸蠟、包埋、切片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片流程制作蘇木素-伊紅(HE)病理切片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察組織病理狀態(tài)并拍照。根據(jù)炎癥程度及潰瘍深度和范圍進行大鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)損傷評分(tissue damage index,TDI)[15]。
利用TCMSP數(shù)據(jù)庫、Perl語言、Uniprot數(shù)據(jù)庫、GeneCard數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫及STRING數(shù)據(jù)庫,挖掘藥物活性成分、疾病靶點,構(gòu)建“黨參活性成分-UC疾病靶點”可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),進行KEGG通路富集及分析。
按照試劑盒說明書提取各組大鼠結(jié)腸組織總RNA,通過Oligo(dT)磁珠富集總RNA中帶有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。樣品進行RNA抽提、純化、建庫,測序生成FASTQ原始數(shù)據(jù)(raw data)。原始數(shù)據(jù)經(jīng)濾過、質(zhì)量評估后比對到參考基因序列,對各樣本在不同表達量區(qū)間內(nèi)的基因的數(shù)目進行統(tǒng)計及差異基因PPI分析,并進行差異基因KEGG信號通路富集分析。
按照ELISA試劑盒說明書測定各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、Fe2+、CRP、GPX4和-乳酸含量。
微板法測定血清GSH含量,設(shè)置空白孔、標準孔、樣品測定孔,各孔加樣,405 nm處測定各孔吸光度()值,計算GSH含量。TBA熒光法測定血清MDA含量,設(shè)置空白管、標準管、樣品測定管、對照管,各管加樣,于532 nm波長處,1 cm光徑,蒸餾水調(diào)零,測定各管值,計算MDA含量。羥胺法測定血清SOD活力,設(shè)置對照管、樣品測定管,各管加樣,于550 nm波長處,1 cm光徑比色杯,蒸餾水調(diào)零,比色,計算SOD活力。比色法測定結(jié)腸組織MPO活力,結(jié)腸組織勻漿,設(shè)定對照孔、樣品測定孔,空白孔,各孔加樣,于460 nm處,1 cm光徑,雙蒸水調(diào)零,測定各孔值,計算MPO活力。考馬斯亮藍法測定各組結(jié)腸組織蛋白濃度。磷鉬酸比色法檢測大鼠結(jié)腸組織ATP含量,設(shè)定空白管、對照管、標準管和樣品測定管,加入工作液,636 nm,光徑0.5 cm,雙蒸水調(diào)零,測定各管值,計算ATP含量。酶促反應(yīng)、定磷反應(yīng)測定結(jié)腸組織Ca2+, Mg2+-ATP酶、Na+, K+-ATP酶、ATP酶活力。
取結(jié)腸組織50 mg,解凍、研磨,加入RIPA蛋白裂解液及苯甲基磺酰氟裂解,BCA法測定蛋白濃度,蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉,洗膜,加入一抗,4 ℃孵育過夜;洗滌,加入二抗,室溫孵育,洗滌,加入顯色劑避光顯影,采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度值。
按照試劑盒說明書提取各組大鼠結(jié)腸組織中總RNA并合成cDNA,進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。
表1 引物序列
如圖1所示,對照組大鼠黏膜層腸上皮結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)結(jié)構(gòu)正常;模型組結(jié)腸組織顯示黏膜下層重度炎癥,伴有淋巴細胞浸潤嚴重水腫,固有層腸腺數(shù)量減少,隱窩和表面上皮細胞缺失。各給藥組不同程度減少了炎性細胞的浸潤,修復(fù)腺體結(jié)構(gòu),改善了結(jié)腸黏膜的充血水腫。與對照組比較,模型組TDI評分明顯升高(<0.01);與模型組比較,各給藥組TDI評分均顯著降低(<0.05、0.01)。
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲得黨參活性成分對應(yīng)的靶點基因109個,有關(guān)UC的靶點基因4852個,得到72個交集靶點基因,見圖2-A。如圖2-B所示,與對照組比較,模型組結(jié)腸組織差異表達的基因4727個(上調(diào)2157個、下調(diào)2570個);與模型組比較,黨參高劑量組差異表達的基因1058個(上調(diào)669個、下調(diào)389個)。采用R語言ggplots2軟件包繪制差異表達基因火山圖,展示對照組模型組(圖2-C)及模型組黨參高劑量組(圖2-D)的基因分布情況,上調(diào)和下調(diào)的差異基因分布大致對稱。
與對照組比較:#P<0.05 ##P<0.01 ###P<0.001;與模型組比較:*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001,下圖同
A-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)黨參-UC交集靶點基因Venn圖 B-轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異基因統(tǒng)計圖 C-轉(zhuǎn)錄組學(xué)對照組vs模型組基因表達火山圖 D-模型組vs黨參高劑量組基因表達火山圖
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將黨參與UC交集基因通過STRING數(shù)據(jù)庫分析交集靶點,并進行PPI分析,獲得AKT1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、IL-6、溶質(zhì)載體家族6A4(solute carrier family 6A4,SLC6A4)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、TNF、TP53、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S-transferase P1,GSTP1)、糖皮質(zhì)激素受體3C1(nuclear receptor subfamily 3 group C,NR3C1)、血管內(nèi)皮生長因子α(vascular endothelial growth factor α,VEGFA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、乙酰膽堿受體亞基α7(nicotine acetylcholine receptors α7,CHRNA7)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin G/H synthase 2,PTGS2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARG)、IL-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystein-asparate protease-3,CASP3)等靶點蛋白,以及木犀草素等黨參主要活性成分(圖3-A、B)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)將差異基因蛋白與蛋白表達量結(jié)合構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3-C、D),圖中的點為基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì),其中紅色表達上調(diào)差異基因,綠色表達下調(diào)差異基因,黃色表達非顯著差異基因,經(jīng)分析獲得了在模型組上調(diào),經(jīng)黨參干預(yù)后下調(diào)基因140個,包括CRP、突觸活性蛋白1(complexin1,Cplx1)、硫氧還蛋白域蛋白15(recombinant human thioredoxin domain containing protein 15,Txndc15)、anoctamin家族1(anoctamin 1,Ano1)、溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運蛋白家族35成員(solute carrier family 35 member F1,SLC35F1)等;在模型組下調(diào),經(jīng)黨參干預(yù)后上調(diào)基因440個,包括低密度脂蛋白受體銜接蛋白1(low-density lipoprotein receptor adapter protein 1,Ldlrap1)、RTKN蛋白2(rhotekin 2,Rtkn2)、阿拉伯半乳糖蛋白(Arabinogalactan proteins,Agps)、p21蛋白激活激酶2(p21-activated protein kinase 2,Pak2)、T-Box1基因(T-box 1,Tbx1)等。
A-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)蛋白互作關(guān)系靶點圖 B-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)黨參-UC靶點PPI網(wǎng)絡(luò) C-轉(zhuǎn)錄組學(xué)模型組vs黨參高劑量組PPI網(wǎng)絡(luò) D-轉(zhuǎn)錄組學(xué)對照組vs模型組PPI網(wǎng)絡(luò)
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)KEGG分析結(jié)果顯示黨參干預(yù)UC排名靠前的信號通路包括PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路等。其中PI3K/Akt信號通路為影響度最高的信號通路,見圖4-A。轉(zhuǎn)錄組學(xué)KEGG分析顯示,黨參高劑量組與模型組的1058個差異表達基因富集于59個KEGG通路,見圖4-B,其中PI3K/Akt信號通路為顯著表達通路;模型組與對照組的4727個差異表達基因富集于145個KEGG通路,見圖4-C,其中PI3K/Akt信號通路亦為顯著表達通路。進一步分析富集在PI3K/Akt信號通路上的差異基因,與對照組比較,在模型組下調(diào)、黨參處理后上調(diào)的顯著差異基因有IV型膠原蛋白(collagen IV a6,Col4a6)、層黏連蛋白α2(Laminin alpha,Lama2)、神經(jīng)生長因子受體(nerve growth factor receptor,Ngfr)、Lamc3、LAMB2、整合素α7(integrinα7,Itga7)、溶血磷脂酸受體3(recombinant lysophosphatidic acid receptor 3,Lpar3)等;與對照組比較,在模型組上調(diào)、黨參處理后明顯下調(diào)逆轉(zhuǎn)明顯的差異基因有3′-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(recombinant phosphoinositide dependent protein kinase 1,Pdpk1)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1,CCND1)等。上述結(jié)果表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測核心通路與轉(zhuǎn)錄組學(xué)富集確證信號通路PI3K/Akt信號通路是黨參干預(yù)UC的關(guān)鍵信號通路。
A-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)黨參干預(yù)UC KEGG通路富集分析 B-模型組vs黨參高劑量組KEGG分析 C-對照組vs模型組KEGG分析
如圖5所示,與對照組比較,模型組血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、-乳酸、CRP水平均顯著升高(<0.001);與模型組比較,各給藥組血清中IL-1β、TNF-α和CRP水平均顯著降低(<0.05、0.01、0.001),SASP組、Fer-1組和黨參高劑量組血清中IL-6、IL-8和-乳酸水平均顯著降低(<0.001)。表明黨參可有效降低UC模型大鼠炎癥因子及炎癥損傷介質(zhì)水平。
如圖6所示,與對照組比較,模型組血清Fe2+、MDA含量明顯升高(<0.001),血清GPX4、GSH水平及SOD活力均顯著降低(<0.001),結(jié)腸組織MPO活力顯著升高(<0.001);與模型組比較,各給藥組血清Fe2+、MDA含量明顯降低(<0.001),血清GPX4水平顯著升高(<0.001);SASP組、Fer-1組和黨參低、高劑量組血清GSH水平顯著升高(<0.001);SASP組、Fer-1組和黨參中、高劑量組結(jié)腸組織MPO活力顯著降低(<0.001);SASP組、Fer-1組和黨參高劑量組血清SOD活力明顯降低(<0.001)。表明黨參可有效干預(yù)UC血清Fe2+堆積狀態(tài),調(diào)控氧化應(yīng)激脂質(zhì)過氧化物含量與過氧化酶活力。
A-對照組 B-模型組 C-SASP組 D-Fer-1組 E-黨參低劑量組 F-黨參中劑量組 G-黨參高劑量組,下圖同
圖6 黨參對UC大鼠氧化應(yīng)激水平的影響(, n = 12)
如圖7所示,與對照組比較,模型組結(jié)腸組織ATP含量及ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶、Na+, K+-ATP酶活力均明顯降低(<0.05、0.001);與模型組比較,各給藥組結(jié)腸組織Na+, K+-ATP酶活力明顯升高(<0.001),SASP組、Fer-1組和黨參中、高劑量組結(jié)腸組織ATP含量及ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活力均顯著升高(<0.05、0.01、0.001)。表明黨參對UC模型大鼠結(jié)腸能量代謝具有較好提升效果,尤其對Na+, K+-ATPase活力提升優(yōu)于陽性對照藥物。
如圖8所示,與對照組比較,模型組大鼠結(jié)腸組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Keap1、MIRO和DRP1蛋白表達水平均顯著升高(<0.001),Nrf2、FTH1和GPX4蛋白表達水平均顯著降低(<0.001);與模型組比較,SASP組、Fer-1組和黨參中、高劑量組結(jié)腸組織p-PI3K/PI3K和DRP1蛋白表達水平均顯著降低(<0.05、0.001),Nrf2和FTH1蛋白表達水平均顯著升高(<0.05、0.01、0.001);SASP組、Fer-1組和黨參高劑量組結(jié)腸組織p-Akt/Akt、Keap1和MIRO蛋白表達水平均顯著降低(<0.01、0.001),GPX4蛋白表達水平均顯著升高(<0.01、0.001)。
圖7 黨參對UC大鼠結(jié)腸組織ATP含量及ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶、Na+, K+-ATP酶活力的影響(, n = 12)
圖8 黨參對UC大鼠結(jié)腸組織p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Keap1、Nrf2、GPX4、FTH1、DRP1和MIRO蛋白表達的影響(, n =3)
如圖9所示,與對照組比較,模型組結(jié)腸組織、、基因表達水平均顯著升高(<0.001),、、基因表達水平均顯著下降(<0.001);與模型組比較,各給藥組結(jié)腸組織、基因表達水平顯著降低(<0.001),SASP組、Fer-1組和黨參中、高劑量組、、基因表達水平顯著升高(<0.05、0.01、0.001);SASP組和黨參高劑量組基因表達水平均顯著降低(<0.05、0.01)。
圖9 黨參對UC大鼠結(jié)腸組織PI3K、Akt、Keap1、Nrf2、FTH1和GPX4基因表達的影響(, n = 3)
腸黏膜是維持上皮細胞功能完整性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),具有阻止腸腔內(nèi)細菌、抗原等物質(zhì)進入腸黏膜固有層激活免疫細胞[16-18]的生物屏障作用,黏膜受損有助于有害物質(zhì)入侵黏膜層激活免疫應(yīng)答誘發(fā)炎癥反應(yīng)促進病情的進一步發(fā)展[19]。UC發(fā)生時,腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)向腸黏膜固有層移位并激活免疫細胞導(dǎo)致大量炎癥細胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-8)及炎癥損傷介質(zhì)如CRP、-乳酸產(chǎn)生并進一步作為信號分子激活炎癥途徑[20-21],促使活性氧(reactive oxygen species,ROS)爆發(fā)性增加。ROS的聚集消耗過多的SOD、GSH、GPX4等抗氧化酶打破機體氧化平衡系統(tǒng)引起氧化應(yīng)激[22],使細胞內(nèi)GPX4催化的GSH還原反應(yīng)受到抑制,繼而氧化性極強的Fe2+與H2O2以類似Fenton反應(yīng)的方式氧化脂質(zhì),細胞膜和細胞器膜磷脂雙分子層被氧化降解,從而破壞膜結(jié)構(gòu)的流動性和穩(wěn)定性并且使膜通透性增加,細胞伴隨著大量的鐵離子的累積破裂死亡[23]。線粒體是提供能量并調(diào)節(jié)細胞代謝的重要細胞器,處于“分裂-融合”的動態(tài)平衡之中,氧化應(yīng)激至過氧化脂如MDA等大量堆積,與線粒體DNA形成加合物造成蛋白質(zhì)肽鏈斷裂、交聯(lián)、碳基生成和構(gòu)象變化,損傷線粒體呼吸鏈復(fù)合物及其關(guān)鍵酶活性,影響線粒體能量代謝功能至ATP產(chǎn)出不足[24],引起細胞連接分布和功能的改變,細胞間隙增寬[25]損傷呼吸傳遞鏈功能,抑制能量代謝。因此氧化應(yīng)急反映激發(fā)細胞膜的多鏈不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化鏈式反應(yīng),黏膜細胞發(fā)生鐵依賴性崩解死亡的同時降低細胞線粒體酶活性及能量代謝功能[24],從而誘發(fā)腸黏膜損傷。
Nrf2是CNC-bZIP家族中活力最強的轉(zhuǎn)錄激活因子,在細胞抗氧化和親電應(yīng)激反應(yīng)及鐵代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用[25]。生理狀態(tài)下Nrf2接受Keap1作為負調(diào)控因子將Nrf2靶定在胞質(zhì)內(nèi)形成Keap1-Nrf2復(fù)合體,并通過介導(dǎo)Nrf2泛素化降解以維持胞內(nèi)較低水平的Nrf2[27-28]。而當細胞處于UC氧化應(yīng)激狀態(tài)時Keap1-Nrf2復(fù)合體解偶聯(lián),活化的Nrf2進入細胞核內(nèi)形成異二聚體,通過形成半胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)(System Xc-)參與關(guān)鍵抗氧化劑GSH的合成[29],調(diào)節(jié)下游SOD、FTH1等抗氧化和保護性基因的表達[30-32]。GPX4依賴輔因子GSH將有毒的脂質(zhì)過氧化物還原為無毒的脂質(zhì)醇,同時自身轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸凸入赘孰模赏ㄟ^減少脂質(zhì)過氧化作用以抑制細胞發(fā)生鐵死亡。當氧化應(yīng)激狀態(tài)下GSH被耗盡時會導(dǎo)致GPX4失活[33],GPX4的下調(diào)被認為是鐵死亡的關(guān)鍵特征[34]。FTH1具有鐵氧化酶活性,可以催化Fe2+轉(zhuǎn)化為Fe3+形式,從而降低游離鐵的含量,維持細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)[35]。
細胞鐵死亡是導(dǎo)致腸上皮細胞死亡造成腸黏膜屏障受損的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[36]。鐵死亡細胞在電鏡下可觀察到細胞膜和細胞核形態(tài)完整、無破裂,但細胞內(nèi)線粒體形態(tài)小于正常細胞,線粒體膜皺縮致密度增高,嵴減少甚至消失,外膜破碎[37-38]。DRP1是介導(dǎo)線粒體動力學(xué)中線粒體融合與分裂的關(guān)鍵蛋白,參與調(diào)控線粒體內(nèi)膜及外膜的融合與分裂過程[39]。UC狀態(tài)下腸黏膜細胞鐵死亡致線粒體受損,誘導(dǎo)DRP1過表達會使線粒體的“分裂-融合”的動態(tài)平衡破壞,分裂加速,促進線粒體呼吸傳遞鏈功能受損,進一步導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加促進氧化應(yīng)激脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[22],造成循環(huán)損傷。DRP1的抑制和激活受到MIRO對線粒體形態(tài)的影響[40],UC發(fā)生時線粒體需要足量MIRO蛋白發(fā)揮運輸功能滿足炎癥狀態(tài)的能量需求,MIRO表達量急劇增加,加快運輸線粒體到高能量需求的部位以滿足能量的供應(yīng),過量的ROS導(dǎo)致線粒體損傷啟動清除MIRO的機制,MIRO蛋白從受損線粒體上脫離后會被迅速泛素化,缺乏MIRO的受損線粒體將無法繼續(xù)沿著細胞內(nèi)的微管繼續(xù)移動轉(zhuǎn)運[41]。本研究發(fā)現(xiàn)在腸黏膜組織損傷大鼠模型中,結(jié)腸組織線粒體分裂蛋白DRP1表達量上升,表明此時結(jié)腸黏膜細胞線粒體呈過度分裂,融合受抑制,結(jié)腸組織細胞處于線粒體動力學(xué)失衡狀態(tài)。ATP酶活力的大小是細胞能量代謝及功能有無損傷的重要指標[42],本實驗結(jié)果顯示,UC大鼠結(jié)腸組織ATP酶活性下降,表明結(jié)腸細胞內(nèi)外滲透壓失衡,結(jié)腸局部炎癥水腫[43],進一步引起結(jié)腸動力功能障礙,甚至造成結(jié)腸肌肉痙攣[44]。實驗結(jié)果還顯示UC大鼠結(jié)腸組織Ca2+, Mg2+-ATP酶、Na+, K+-ATP酶活力降低,酶活力的降低將影響線粒體對胞質(zhì)Ca2+攝取,減緩呼吸鏈速率,減少ATP的合成[45-46]。
研究表明PI3K/Akt信號通路可以磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子,在腸黏膜細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[47]。本研究中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測及轉(zhuǎn)錄分析均證實了PI3K/Akt是黨參干預(yù)UC發(fā)生發(fā)展的核心差異表達基因及重要信號通路。磷酸化的Akt可促進Keap1/Nrf2核轉(zhuǎn)移與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,促進下游抗氧化系統(tǒng)的表達調(diào)控GPX4,從而清除氧自由基[48],抑制腸黏膜細胞鐵死亡;同時氧自由基的清除有助于恢復(fù)線粒體正常能量代謝功能,促進ATP產(chǎn)出及ATP酶活力的增加。
綜上,腸黏膜損傷是UC的核心病理因素[49],氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的鐵死亡是導(dǎo)致細胞死亡造成腸黏膜屏障受損的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[36,50],線粒體動力學(xué)失衡誘發(fā)的能量代謝障礙是UC的核心病理過程[51]。Akt磷酸化與PI3K聯(lián)動反應(yīng)調(diào)控Keap1/Nrf2,促進GPX4合成調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)抑制腸黏膜細胞鐵死亡,調(diào)控DRP1減少線粒體氧化應(yīng)激損傷維護線粒體動力學(xué)平衡狀態(tài),促進細胞能量代謝恢復(fù)是修復(fù)腸黏膜屏障損傷的有效途徑。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
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LI Fang1, CHEN Zheng-jun1, GE Jun-li1, WANG Chun-xia1, LIANG Jian-qing2, FENG Cui-juan3, YANG Fu-de1
1. School of Pharmacy, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. School of Basic Medicine, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 3. School of Chinese Medicine, Gansu Health Vocational College, Lanzhou 730300, China
To explore the mechanism of Dangshen () on intervening intestinal mucosal cells ferroptosis-mitochondrial dynamics imbalance in ulcerative colitis (UC) via Kelch like ECH-associated protein 1 (Keap1)/nuclear factor E-related factor 2 (Nrf2)/glutathione peroxidase 4 (GPX4) and mitochondrial related protein 1 (DRP1) signaling pathway regulated by phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt).Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis in network pharmacology was used to predict the key signaling pathways ofintervention in UC. SD rats were used to prepare UC models by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-ethanol composite method, rats were randomly divided into control group, model group, sulfasalazine tables (0.3 g/kg) group, iron inhibitor Ferrostatin-1 (0.8 mg/kg) group, andhigh-, medium-, and low-dose (18, 9, 4.5 g/kg) groups, with 12 rats in each group; Drugs were given for 7 d, serum and colon tissue from each group of rats were collected. Histopathological observation and histological damage index (TDI) of colon mucosa were performed by HE staining; ELISA was used to detect Fe2+, interleukin-1β (IL-1β), IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-8, GPX4, C-reactive protein (CRP),-lactate contents in serum; Superoxide dismutase (SOD) activity and contents of malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) in serum were detected, adenosine triphosphate (ATP) content and activities of myeloperoxidase (MPO), Ca2+, Mg2+-ATPase, Na+, K+-ATPase and ATPase in colon tissue were detected by biochemical method. Differentially expressed genes in colon tissues of control group, model group, andhigh-dose group were analyzed by transcription sequencing, and KEGG pathway enrichment analysis were performed to obtain the differentially expressed signal pathway ofintervention in UC. Western blotting was used to detect the expressions of p-PI3K, PI3K, p-Akt, Akt, Keap1, Nrf2, GPX4, recombinant human ferritin heavy chain (FTH1), DRP1 and mitochondrial Rho GTP (MIRO) proteins in colon tissue; qRT-PCR was used to detect the mRNA expressions of,,,,andin colon tissue.The pathological observation and scoring results showed thateffectively improved the inflammatory and edema state of colon tissue; The network pharmacology prediction results indicated that the key targets ofintervention in UC were significantly enriched in PI3K/Akt signaling pathway. The results of ELISA experiments indicated thateffectively reduced IL-1β, IL-6, IL-8,TNF- α,-lactate and CRP levels in serum of UC model rats to inhibit inflammation (< 0.05, 0.01, 0.001), reduced Fe2+, MDA contents and MPO activity in serum (< 0.001), increased GPX4, GSH levels and SOD activity in serum (< 0.001), and inhibited oxidative stress;elevated the ATP content and activities of ATPase, Ca2+, Mg2+-ATPase, Na+, K+-ATPase in colon tissue (< 0.05, 0.01, 0.001), and enhanced energy metabolism. The analysis of KEGG pathway in transcriptome suggested that the differential genes in control groupmodel group andhigh-dose groupmodel group were significantly enriched in PI3K/Akt and other signal pathways. The results of Western blotting experiments confirmed thateffectively downregulated the expressions of p-PI3K/PI3K, p-Akt/Akt, Keap1, MIRO and DRP1 proteins in colon tissue (< 0.05, 0.01, 0.001), and upregulated the expressions of Nrf2, FTH1 and GPX4 proteins (< 0.05, 0.01, 0.001), exerting antioxidant stress, inhibiting iron death, and regulating mitochondrial dynamics. qRT-PCR experiment results also showed thateffectively downregulated the expressions of,andgenes in colon tissue (< 0.05, 0.001), and upregulated the expressions of,andgenes (< 0.05, 0.01, 0.001).is an effective drug for intervention in UC, and its mechanism may be related to PI3K/Akt intervention in Keap1/Nrf2/GPX4, DRP1 signaling pathways to inhibit mitochondrial dynamic imbalance-ferroptosis oxidative stress injury in intestinal mucosal cells.
; ulcerative colitis; PI3K/Akt; oxidative stress; mitochondrial dynamics imbalance; ferroptosis;lobetyolin; atractylenolide III
R285.5
A
0253 - 2670(2023)12 - 3865 - 13
10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.013
2023-01-12
國家重點研發(fā)計劃(2018YFC1706305);甘肅省自然科學(xué)基金項目(22JR5RA590);甘肅省教育科技創(chuàng)新項目(2022A-064,2023A-297)
李 芳(1982—),女,博士研究生,研究方向為中藥藥理與毒理。Tel: (093)15162472 E-mail: 119232388@qq.com
通信作者:楊扶德(1972—),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事中藥品質(zhì)及中藥材規(guī)范化栽培研究。Tel: (0931)5162435 E-mail: gszyyfd@163.com
[責任編輯 李亞楠]