王祎萌，李芳，王文亮，張曉強

(寧夏泰益欣生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750001)

0 引言

泰萬菌素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中的一種，在當前世界醫(yī)藥行業(yè)內(nèi)，已被認定為預防、治療由支原體引起的畜禽類疾病的最新藥品，并在行業(yè)內(nèi)廣泛應用[1-2]。泰萬菌素作為一種新型的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，攻克了其他同類藥物的缺點，具有效率高、毒性低、殘留少、同類間無交叉耐藥性的優(yōu)點。泰萬菌素的抗菌能力，是泰樂菌素的5～10 倍，是替米考星的2～5 倍。主鏈能有效改變細胞的pH 值，抑制PRRS病毒的繁殖，可用于防治畜禽支原體病(豬哮喘、雞慢性呼吸道疾病)、豬藍耳病、傳染性胸膜肺炎和鏈球菌病。

泰萬菌素全稱為乙酰異戊基泰樂菌素，主要由耐熱鏈霉菌在合適的發(fā)酵條件下產(chǎn)生。耐熱鏈霉菌含有酰化基因acyA 和acyB，分別負責乙?；彤愇旎；痆3]。在作用機制方面，泰萬菌素與其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素基本相同，能與敏感細菌的核糖體50s 亞基結(jié)合，從而抑制肽鏈的合成和延伸，通過切斷轉(zhuǎn)肽酶化和mRNA 置換影響細菌蛋白質(zhì)的合成。泰萬菌素對諸多革蘭氏陽性菌具備抗菌活性，如：棒狀桿菌、氣球菌、彎曲桿菌、腸球菌、鏈球菌、葡萄球菌、微球菌、芽孢桿菌、節(jié)桿菌等。同時，對支原體也有一定的抗菌活性，濃度高時效果會更顯著，但對較多的革蘭氏陰性菌沒有作用。泰萬菌素和3-AT 以兩種不同的靶點攻擊支原體和細菌，它們的協(xié)同作用使抗菌和抗支原體活性得到提升，使得藥物在體內(nèi)的作用時間得到有效延長。病原微生物有個缺陷，即其難以同時在兩個不同的地方發(fā)生突變且產(chǎn)生耐藥性。泰萬菌素發(fā)酵合成的發(fā)酵液經(jīng)酸溶堿沉后獲得泰萬菌素成品，但隨著科技的發(fā)展和醫(yī)藥行業(yè)的進步，對各類抗生素的純度等質(zhì)量的要求具有明顯提升，因此本文主要以泰萬菌素成品為原料，通過硅膠柱層析法純化，調(diào)配控制洗脫液、洗脫液配比、洗脫液使用量及洗脫速率等實驗條件，制備高純度泰萬菌素，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 泰萬菌素結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試劑

乙酸乙酯、石油醚、氯仿、正丁醇等試劑均為試劑級，采購于天津市大茂化學試劑有限公司；硅膠為工業(yè)級，采購于天津市承大化學試劑有限公司。

1.2 儀器

本實驗主要儀器為層析柱、電子天平、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水真空泵、高效液相色譜儀等，各儀器詳情如表1 所示。

表1 本實驗儀器詳情表

2 材料與方法

2.1 材料

泰萬菌素成品來源于寧夏泰益欣生物科技股份有限公司。

2.2 方法

2.2.1 制備方法

用電子天平稱取60 g 泰萬菌素成品于2 L 玻璃燒杯中，加入適量乙酸乙酯溶解，再向2 L 燒杯中繼續(xù)加入80 g 硅膠攪拌，充分混勻、蒸干后上樣(干法上樣)。上樣時，先用300 g 硅膠填充層析柱，將蒸干后的樣品填充于硅膠上方，以石油醚對裝填后的硅膠層析柱進行潤洗。完成潤洗后加入洗脫液沖洗，收集的洗脫液經(jīng)濃縮蒸干后檢測組分。

2.2.2 檢測方法

采用HPLC 進行檢測，流動相為乙腈(0.15 mol/L)、醋酸銨溶液、醋酸比例為45∶45∶10；柱子型號為C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；檢測波長為280 nm；進樣量為10 μL。

制備檢測樣品: 精密稱量50 mg 高純度泰萬菌素成品于100 mL 容量瓶中，加入流動相溶解并定容，充分搖勻后，經(jīng)0.45 μm 濾頭過濾待用。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同洗脫液對泰萬菌素A 組分的影響

在柱層析洗脫過程中，不同洗脫液對不同組分的溶解度不同，選用不同洗脫液對洗脫的效果至關(guān)重要。因此，本實驗選用了石油醚、氯仿和正丁醇三種有機溶劑分別與乙酸乙酯進行一定比例混合組成洗脫液，收集洗脫液，進行液相檢測，考察洗脫液種類對泰萬菌素A 組分含量的影響。具體結(jié)果如表2 所示。

表2 不同洗脫液對泰萬菌素A 組分含量的影響

由表2 可知，三種洗脫液中，洗脫液為乙酸乙酯和石油醚時，其A 組分的含量為86.14%，明顯高于乙酸乙酯：氯仿和乙酸乙酯：正丁醇，分別高出4.40%和6.87%。因此，確定洗脫液為乙酸乙酯和石油醚。

3.2 不同洗脫液配比對泰萬菌素A 組分的影響

柱層析填充料對樣品中的不同組分的吸收能力存在差異，洗脫液的不同配比對各組分的洗脫效果不同，本研究共設置1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1、2∶3 和3∶2 等7 中洗脫液配制比例進行驗證洗脫液對泰萬菌素A 組分含量的影響。具體結(jié)果如表3 所示。

表3 不同洗脫液配比對泰萬菌素A 組分含量的影響

根據(jù)表3，觀察1、2、4 組實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著洗脫液中石油醚含量的增加，A 組分含量呈現(xiàn)下降趨勢，說明洗脫液中石油醚含量越低，A 組分的含量越高，洗脫的效果越好；觀察1、3、5 組實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著洗脫液中乙酸乙酯含量的增加，A 組分含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，說明乙酸乙酯的含量過多或過少都會降低A 組分的含量，所以洗脫液中乙酸乙酯的含量應該適中。對比3、7 兩組實驗結(jié)果，乙酸乙酯和石油醚的配比為2∶1 時，A 組分含量最高，為90.77%。因此，確定乙酸乙酯和石油醚的配比為2∶1。

3.3 不同洗脫液體積對泰萬菌素A 組分的影響

洗脫液的體積對洗脫結(jié)果具有直接影響，洗脫液用量過少，可能會導致洗脫不徹底，有效組分無法完全收集，造成A 組分含量較低。洗脫液用量過多，必然會造成有機溶劑的浪費，有機溶劑的揮發(fā)及回收過程中都會有溶劑的損失，造成成本的增加。本研究設置層析柱體積的1.0 倍、1.5 倍、2.0 倍、2.5 倍、3.0 倍、3.5 倍、4.0 倍、4.5 倍 和5.0 倍 等9 種 洗 脫液的體積進行驗證。具體結(jié)果如表所4 所示。

由表4 可知，隨著洗脫液體積的增大，A 組分含量不斷上升，從4 倍柱體積洗脫開始，A 組分含量上升幅度明顯減小，趨于平緩；4.5 和5.0 倍柱體積洗脫時，A 組分含量僅高出4 倍柱體積的0.05% 和0.09%，說明繼續(xù)增加洗脫液體積，意義不大，同時也可以節(jié)約經(jīng)濟成本和避免試劑的浪費。因此，以4 倍柱體積的洗脫液為最佳洗脫液用量繼續(xù)進行實驗。

表4 不同洗脫液體積對泰萬菌素A 組分含量的影響

3.4 不同洗脫速率對泰萬菌素A 組分的影響

硅膠柱用洗脫液沖洗過程中，通過控制洗脫速率可以有效的提升泰萬菌素A 組分的含量，本實驗將洗脫速率分別控制在10 mL/min、20 mL/min、30 mL/min、40 mL/min、50 mL/min、60 mL/min，考察對泰萬菌素A 組分含量的影響。具體結(jié)果如表5 所示。

表5 不同洗脫速率對泰萬菌素A 組分含量的影響

由表5 可知，隨著洗脫速率的增加，A 組分含量逐漸降低，說明洗脫速率越小，洗脫時間越長，A 組分含量越高，洗脫效果越好，但隨著時間的增加，泰萬菌素有效成分會降解，并且實際生產(chǎn)應用中，洗脫速率不宜過慢。在洗脫速率為40 mL/min 時，A 組分含量為95.65%，洗脫速率適中，A 組分含量較優(yōu)，因此，確定洗脫速率為40 mL/min。

3.5 平行試驗

通過單因素試驗，獲得最優(yōu)參數(shù)，組合為最優(yōu)的泰萬菌素柱層析洗脫條件，具體參數(shù)如下：洗脫液為乙酸乙酯和石油醚，洗脫液的最佳配比為2∶1；洗脫液體積為4 倍柱體積；洗脫速率為40 mL/min。進行3 組平行實驗驗證穩(wěn)定性，結(jié)果如表6 所示。

表6 平行實驗驗證數(shù)據(jù)

由表6 可知，三組實驗所得泰萬菌素A 組分平均含量為95.51%。

4 結(jié)論

本研究通過對泰萬菌素純化過程中的洗脫液、洗脫液配比、洗脫液體積和洗脫流速等相關(guān)參數(shù)條件進行優(yōu)化，并通過穩(wěn)定性重復實驗驗證此工藝的穩(wěn)定性、可靠性。結(jié)果顯示洗脫液為：乙酸乙酯和石油醚，洗脫液的最佳配比為2∶1；洗脫液體積為4 倍柱體積；洗脫速率為40 mL/min，A 組分含量可達95.51%。