趙永強(qiáng)，樊繼德，陸信娟，劉燦玉，張碧薇，楊青青，葛 潔，史新敏，楊 峰

（江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇徐州 221121）

大蒜（Allium sativum L.）是世界上第二重要的蔥屬植物，作為重要的調(diào)味類蔬菜和藥用植物，種植范圍廣泛分布于亞熱帶至溫帶地區(qū)[1]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAOSTAT）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國是世界上最重要的大蒜產(chǎn)銷國，2021年大蒜收獲面積831 832 hm2、產(chǎn)量 20 513 385.83 t，分別占世界總收獲面積和總產(chǎn)量的50.13%和72.73%。

大蒜是典型的無性繁殖作物，病毒侵染后可以在其體內(nèi)世代積累，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降[2]。我國大蒜普遍受到病毒侵染，且多為復(fù)合侵染。侵染我國大蒜的病毒主要包括香石竹潛隱病毒屬（Carlavirus）的青蔥潛隱病毒（Shallot latent virus，ShLV）和大蒜普通潛隱病毒（Garlic common latent virus，GarCLV）；馬鈴薯 Y 病毒屬（Potyvirus）的韭蔥黃條病毒（Leek yellow stripe virus，LYSV）和洋蔥黃矮病毒（Onion yellow dwarf virus，OYDV）；青蔥 X 病毒屬（Allexivirus）的大蒜A病毒（Garlic virus A，GarV-A）、大蒜 B 病毒（Garlic virus B，GarV-B）、大蒜C 病毒（Garlic virus C，GarV-C）、大蒜 D 病毒（Garlic virus D，GarV-D）、大蒜 E 病毒（Garlic virus E，GarV-E）和大蒜X病毒（Garlic virus X，GarV-X）等[3-6]。

應(yīng)用無病毒種植材料是解決大蒜病毒病的最有效途徑。無病毒大蒜種植材料可以通過體外組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)，包括微繁殖、分生組織培養(yǎng)、熱療、化學(xué)療法、冷凍療法和體細(xì)胞胚胎發(fā)生等[7]。由于體外組織培養(yǎng)技術(shù)尚未達(dá)到100%的脫毒率，因此準(zhǔn)確、快速、高效的大蒜病毒檢測技術(shù)是完善大蒜脫毒良繁體系的迫切需求。在已開發(fā)的眾多大蒜病毒檢測方法中，多重RT-PCR方法由于同時具備準(zhǔn)確、靈敏、高效和低成本優(yōu)勢而被普遍接受。MAJUMDER等[8]于2014年開發(fā)了一種多重RT-PCR方法，用于同時檢測和鑒定感染印度大蒜的 OYDV、ShLV、GarCLV和蔥屬X病毒屬病毒。HU等[9]2015年也開發(fā)了一種多重RT-PCR檢測體系，可以同時檢測在我國湖南省鑒定的4種大蒜病毒/病毒組（OYDV、LYSV、ShLV和allexiviruses）。然而，在對大蒜組培苗和大田植株進(jìn)行病毒檢測時，ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV和allexiviruses的單獨(dú)或混合感染時有檢出，雖然NAM等[10]2015年通過兩組獨(dú)立的多重RT-PCR配合，實(shí)現(xiàn)了對上述5種病毒/病毒組的有效檢測和鑒別，但仍然不能滿足大蒜病毒高效、快速檢測的技術(shù)需求。因此，本研究針對以上5種病毒/病毒組開發(fā)多重RT-PCR檢測體系，用以快速、簡潔地鑒別這5種病毒/病毒組。

1 材料和方法

1.1 病毒與大蒜組培苗、大田樣品來源

在前期病毒檢測中，“徐蒜6號”大蒜組培苗樣品 XS6-2檢測到 GarCLV、OYDV和 allexiviruses，XS6-28檢測到ShLV、LYSV和OYDV（結(jié)果未提供）。將樣品XS6-2和XS6-28的cDNA等比混合為同時含有 ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV 和 allexiviruses的cDNA混合液，用于本研究多重RT-PCR體系的建立和優(yōu)化。

根據(jù)日常病毒檢測經(jīng)驗(yàn)，由保留兩個葉原基的莖尖培養(yǎng)獲得的大蒜組培苗脫毒效果較差，體內(nèi)殘留的病毒多樣性豐富。為了驗(yàn)證建立的多重RT-PCR方法，以大田常規(guī)種植的大蒜品種“徐蒜6號”鱗莖為外植體，定制了一批由保留兩個葉原基的莖尖培養(yǎng)獲得的大蒜組培苗。挑選高度大于10 cm的組培苗24株，采集假莖基部1.5～2.0 cm以上全部組織，保存于-80℃，用于后續(xù)總RNA提取。

大田樣品取自田間大蒜植株第3～4片完全展開的葉片，具體信息見表1。

表1 大田大蒜樣品Table 1 Garlic field samples

1.2 總RNA的提取與cDNA合成

大蒜組培苗樣品和大田樣品液氮冷凍研磨，利用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒（生工生物工程有限公司，上海）提取總RNA，以隨機(jī)引物Random Primers為反向引物、M-MuLV第 1鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA（生工生物工程有限公司，上海），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的設(shè)計與合成

在考慮引物特異性、Tm相容性以及擴(kuò)增子長度等因素的基礎(chǔ)上，ShLV和OYDV的檢測選用HU等[9]開發(fā)的引物，allexiviruses（包括 GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E和GarV-X）簡并引物參考DOVAS等[11]。另外，從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索到GarCLV（NC_016440.1）和 LYSV（NC_005029.1）外殼蛋白（CP）基因序列，使用Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）篩選了兩對特異性引物用于檢測GarCLV和LYSV。引物主要信息見表2，交由生工生物（上海）有限公司合成。

表2 大蒜病毒檢測引物Table 2 Primers used in detection of garlic viruses

1.4 單重PCR與多重PCR擴(kuò)增

以cDNA混合液為PCR反應(yīng)模板，5對特異性引物分別進(jìn)行單重和多重PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：PCR Mix（2×SanTaq Plus PCR Mix 預(yù)混液，生工生物，上海）25 μL、cDNA 混合液模板 2 μL、10 μmol/L的正反向引物各2 μL、滅菌ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，循環(huán) 30次，最后72℃繼續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及測序

多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶分別用DNA凝膠回收試劑盒（MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，TaKaRa，大連）回收純化，回收產(chǎn)物連接pMD18-Tvector并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，然后將獲得的陽性克隆菌液送交生工生物（上海）有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI上用BLAST工具進(jìn)行比對分析。

1.6 多重PCR檢測體系的優(yōu)化

用NanoDrop 2000超微量紫外/可見分光光度計測定 ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV 和 allexiviruses陽性克隆質(zhì)粒初始濃度，根據(jù)王瑩等[12]的計算公式，計算得出各病毒質(zhì)?？截悢?shù)。將5種質(zhì)粒按比例稀釋并混合為濃度均為1.0×108copies/μL的質(zhì)粒混合液。用上述質(zhì)粒混合液為模板，分別對多重PCR體系的退火溫度和引物比例進(jìn)行優(yōu)化。

1.7 單重和多重PCR檢測體系靈敏度測定

上述質(zhì)粒混合液通過10倍稀釋，依次稀釋至1.0 ×105、1.0 ×104、1.0 ×103、1.0 ×102、1.0 ×101和1.0×100copies/μL，以 ddH2O 為陰性對照，分別應(yīng)用單重和多重PCR體系檢測，比較兩種檢測方法的靈敏度。

1.8 多重RT-PCR體系應(yīng)用分析

對24份定制的大蒜組培苗樣品和48份大田樣品進(jìn)行多重RT-PCR檢測分析，并利用5對特異性引物分別對編號25～48的大田樣品進(jìn)行單重RT-PCR檢測，以驗(yàn)證建立的多重RT-PCR檢測方法的適應(yīng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性與相容性

以cDNA混合液為模板的單重與多重PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖1）表明，5對引物單重PCR均可以擴(kuò)增出一條單一的、清晰的目的條帶，大小與預(yù)期基本一致；多重PCR體系可以擴(kuò)增獲得5條特異性的目的條帶，且條帶分布合理，容易區(qū)分。

圖1 大蒜病毒單重PCR與多重PCR檢測Figure 1 Single PCR and multiplex PCR detection of garlic viruses

分別對多重PCR擴(kuò)增獲得的5條特異性條帶進(jìn)行克隆及測序。序列測定結(jié)果證明，從上到下5條特異性條帶的大小分別為 592、431、338、265、190 bp，與預(yù)期完全一致；5條序列分別與GenBank中公布的ShLV澳大利亞分離物HQ258896.2的相似性達(dá)100%、GarCLV中國分離物MN059119.1的相似性達(dá)98%、LYSV中國分離物MN059516.1的相似性達(dá)100%、OYDV中國分離物MN059609.1的相似性達(dá)100%、allexiviruses（包括GarV-A中國分離物MN059321.1、GarV-D中國分離物MN059341.1、GarV-E中國分離物AJ292230.1、GarV-X中國分離物MN059398.1）的相似性達(dá)98%。這說明多重PCR擴(kuò)增出的5條特異性片段來自這5種大蒜病毒/病毒組基因。

2.2 多重PCR體系的優(yōu)化

分光光度法測得 ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV和 allexiviruses質(zhì)粒初始濃度分別為 59.1、53.5、56.3、57.2和88.2 ng/μL，計算得出對應(yīng)質(zhì)粒濃度分別為1.64 ×1010、1.56 ×1010、1.69 ×1010、1.76 ×1010和2.80×1010copies/μL。

以稀釋、混合后濃度均為1.0×108copies/μL的5種病毒質(zhì)?；旌弦簽槟０?，對多重PCR體系的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。在引物體積比 1∶1∶1∶1∶1 的情況下，設(shè)置參試退火溫度 54.0、54.2、54.5、55.1、55.9、56.6、57.4、58.1、58.9、59.5、59.8、60.0 ℃。結(jié)果表明（圖2），在設(shè)定的參試溫度范圍內(nèi)，ShLV、LYSV和OYDV擴(kuò)增效果受退火溫度影響較小，而GarCLV和allexiviruses變化較大，其中，GarCLV的最佳退火溫度為56.6、57.4、58.1、58.9、59.5、59.8、60.0 ℃，而allexiviruses 在 54.0、54.2、54.5、55.1、55.9、56.6 ℃可以獲得更明亮的條帶。因此，確定本研究建立的多重PCR體系的最佳退火溫度為56.6℃（圖2泳道 6）。

圖2 退火溫度對多重PCR擴(kuò)增的影響Figure 2 The effect of annealing temperature on multiplex PCR anplification

另外，通過條帶明亮程度可以明顯看出，本研究設(shè)計的5組特異性引物會相互影響，特別是ShLV和allexiviruses的擴(kuò)增效率受到顯著影響，因此進(jìn)一步對多重PCR體系的引物比例進(jìn)行了優(yōu)化。設(shè)置ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV 和 allexiviruses引物體積比分別為 1∶1∶1∶1∶1、12∶8∶3∶3∶14、6∶4∶1∶1∶8、5∶4∶2∶2∶7、5∶3∶2∶2∶8、4∶3∶2∶2∶9、10∶8∶3∶3∶16 和 5∶3∶1∶1∶10，即 50 μL反應(yīng)體系中各正反向引物用量分別為2/2/2/2/2、3/2/0.75/0.75/3.5、3/2/0.5/0.5/4、2.5/2/1/1/3.5、2.5/1.5/1/1/4、2/1.5/1/1/4.5、2.5/2/0.75/0.75/4 和2.5/1.5/0.5/0.5/5 μL。凝膠成像結(jié)果表明（圖3），引物體積比 10∶8∶3∶3∶16（圖3泳道7）PCR擴(kuò)增獲得的5條特異性條帶亮度最為均勻，可以有效抵消引物間的相互影響。

圖3 多重PCR檢測體系引物比例篩選Figure 3 Primer ratio test in multiplex PCR

因此，確定50 μL的最佳反應(yīng)體系為：2×PCR Mix 25 μL、cDNA 混合液模板 2 μL、引物混合液（ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV 和 allexiviruses引物體積比10∶8∶3∶3∶16）20 μL、無菌 ddH2O 補(bǔ)足 50 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56.6℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)30次；72℃繼續(xù)延伸10 min。

2.3 檢測靈敏度分析

靈敏度測定結(jié)果表明，單重PCR檢測ShLV（圖4a）、GarCLV（圖4b）、LYSV（圖4c）和 OYDV（圖4d）的最低檢測濃度均為1.0 ×101copies/μL，而allexiviruses（圖4e）為 1.0×102copies/μL。多重 PCR檢測靈敏度測定結(jié)果（圖4 f）表明，在最佳體系和反應(yīng)條件下，5種病毒/病毒組的最低檢測濃度均為1.0×102copies/μL。因此，多重PCR檢測靈敏度相較于單重PCR有一定程度的降低。

圖4 單重PCR與多重PCR檢測靈敏度Figure 4 Sensitivity of single PCR and multiplex PCR

2.4 多重RT-PCR體系應(yīng)用效果

用建立的多重RT-PCR體系檢測定制的24份大蒜組培苗樣品。結(jié)果表明（圖5），2份樣品完全脫除大蒜病毒（樣品6和20），10份樣品病毒載量明顯降低（樣品 1、3、7、10、11、13、16、19、21 和 24）。未完全脫除病毒的組培苗樣品中，1份樣品檢測到1種病毒殘留（樣品4檢測到GarCLV）、4份樣品檢測到2種病毒/病毒組殘留（樣品1檢測到GarCLV和allexiviruses；樣品 10和 21檢測到 GarCLV和LYSV；樣品17檢測到ShLV和LYSV）、10份樣品檢測到3種病毒/病毒組殘留（樣品5和24檢測到GarCLV、LYSV 和 allexiviruses；樣品 7、8、9、12、18和23檢測到ShLV、GarCLV和LYSV；樣品13和16檢測到 GarCLV、LYSV和 OYDV）、6份樣品檢測到4種病毒/病毒組殘留（樣品2檢測到ShLV、GarCLV、LYSV 和 allexiviruses；樣品 3、11、14、15 和22檢測到 ShLV、GarCLV、LYSV 和 OYDV）、1份樣品 （樣品19） 同時檢測到 ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV和allexiviruses殘留。

圖5 應(yīng)用多重RT-PCR檢測大蒜組培苗樣品Figure 5 Garlic tissue culture plantlets test using multiplex RT-PCR

大田樣品病毒檢測結(jié)果（圖6a和圖6b）表明，所有樣品均受到至少2種病毒/病毒組的復(fù)合感染。其中，2種病毒/病毒組復(fù)合感染率僅為4.17%（2個樣品）、3種病毒/病毒組復(fù)合感染率35.42%（17個樣品）、4種病毒/病毒組復(fù)合感染率22.92%（11個樣品）、5種病毒/病毒組復(fù)合感染率37.50%（18個樣品）。另外，參試的48份大田樣品中，ShLV檢出率60.42%（29例）、GarCLV 檢出率 47.92%（23例）、LYSV檢出率89.58%（43例）、OYDV檢出率95.83%（46例）、allexiviruses檢出率100%。

圖6 應(yīng)用多重RT-PCR檢測大田樣品Figure 6 Garlic field sample test using multiplex RT-PCR

另外，本研究還利用單重RT-PCR對編號25～48的大田樣品多重RT-PCR檢測結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證（圖7）。大蒜組培苗和大田樣品病毒檢測的應(yīng)用，說明本研究建立的大蒜病毒多重RT-PCR檢測方法準(zhǔn)確、可靠，可以高效、特異的檢測和鑒別感染我國大蒜的5種病毒/病毒組。

圖7 應(yīng)用單重RT-PCR檢測大田樣品Figure 7 Garlic field sample test using single RT-PCR

3 討論

病毒病是最常見的大蒜病害，一旦染病很難有效治療。防治大蒜病毒病最直接、最有效的方法是使用無病毒種植材料。CONCI等[13]研究表明，雖然無病毒大蒜種植材料在田間會很快受到病毒的再次感染，但是在第1個種植周期產(chǎn)量仍能增加66%～216%，鱗莖周長增加13%～37%；在第3年之前，產(chǎn)量逐漸下降，隨后在第4年和第5年保持穩(wěn)定，但仍高于常規(guī)大蒜種。

自20世紀(jì)70年代以來，國內(nèi)外研究人員在利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)脫除大蒜病毒方面進(jìn)行了諸多研究[14-19]。但是由于繁殖系數(shù)低，導(dǎo)致大蒜脫毒組培和良種繁育等成本居高不下，脫毒大蒜良種難以廣泛推廣應(yīng)用。在提高大蒜脫毒材料繁殖系數(shù)尚未取得突破性進(jìn)展的情況下，進(jìn)一步降低病毒檢測等各環(huán)節(jié)成本有利于大蒜脫毒種植材料的推廣應(yīng)用。

多重RT-PCR技術(shù)是基于單重RT-PCR發(fā)展而來，該技術(shù)在一個反應(yīng)體系中加入2對或2對以上引物，同時特異性擴(kuò)增多個靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)對多個靶標(biāo)進(jìn)行同時診斷的技術(shù)。由于多重RT-PCR技術(shù)的高效和低成本優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于動植物病毒的檢測[20-22]。為了進(jìn)一步提高大蒜組培苗病毒檢測效率、降低成本，從而推動大蒜脫毒種植材料的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，建立了一套能夠同時檢測和鑒定ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV 和 allexiviruses 5 種病毒/病毒組的多重RT-PCR方法。該方法選擇和設(shè)計的引物特異性強(qiáng)，病毒目的基因片段大小分布合理，不僅能夠保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，還可以有效地鑒別侵染病毒的種類。

在多重RT-PCR體系中，引物擴(kuò)增效率一致性是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵性因素。隨著PCR反應(yīng)體系內(nèi)引物的增多，引物之間Tm相容難度增大，形成引物二聚體甚至多聚體的可能性也大幅增加，導(dǎo)致目的基因擴(kuò)增效率降低，影響檢測靈敏度和特異性[23]。本研究中，選用的5對引物在退火溫度56.6℃都能獲得最佳的擴(kuò)增效果，具有較好的Tm相容性。然而，即使在最佳退火溫度下，本研究選用的5對引物間仍存在擴(kuò)增不平衡，通過引物比例的優(yōu)化，在 ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV 和 allexiviruses引物體積比為 10∶8∶3∶3∶16 時，能達(dá)到較為均衡的擴(kuò)增效果，但是檢測靈敏度相較于單重RT-PCR仍有一定程度的降低。

大蒜組培苗樣品病毒檢測結(jié)果表明，雖然保留兩個莖尖葉原基脫毒成功率僅8.33%，但陽性苗的病毒載量仍顯著低于大田樣品，使得多重RT-PCR檢測由于靈敏度降低而可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，本研究建立的大蒜病毒多重RT-PCR檢測方法雖然可以快速、有效地檢測和鑒別5種病毒/病毒組，但應(yīng)用于組培苗病毒檢測尚有一定的靈敏度局限。另外，鑒于大田零星出現(xiàn)矮化、葉片皺縮的大蒜植株，本研究也通過大田樣品的多重RT-PCR檢測對其病毒感染情況進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植株矮化、皺縮樣品與花葉樣品之間5種病毒/病毒組的感染情況并未出現(xiàn)明顯差異，證明 ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV 和allexiviruses 5種病毒/病毒組的侵染差異并非引起大蒜植株矮化、葉片皺縮的主要原因。