李娟，倪惠華

卵巢癌是目前僅次于宮頸癌的第二大常見婦科惡性腫瘤，2020 年全球約有31 萬卵巢癌新發(fā)病例［1］。由于早期癥狀不明顯，多數(shù)患者在診斷時已為晚期，總體預(yù)后較差［2-3］。卵巢癌不同的表觀遺傳學(xué)特征與分子異質(zhì)性有關(guān)，迫切需要探索更多分子標(biāo)志物用于早期診斷與患者風(fēng)險分層，以優(yōu)化個性化治療策略［4］。游離脂肪酸具有受體信號，在基因表達和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸與G 蛋白偶聯(lián)跨膜受體家族中的游離脂肪酸受體（FFAR）結(jié)合而充當(dāng)細胞外信號分子。G 蛋白偶聯(lián)受體（GPR）120 和GPR40 可被中長鏈游離脂肪酸激活在調(diào)節(jié)血脂和葡萄糖代謝以及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［7］。目前，已有多項研究報道，GPR120 與GPR40 在多種人類癌癥組織和細胞系中存在異常表達［8-10］，提示這些游離脂肪酸受體可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。然而，少有關(guān)于GPR120與GPR40在卵巢癌中作用的報道。體內(nèi)動物模型與體外細胞研究顯示，卵巢細胞可表達GPR120 與GPR40，而抑制兩者表達可影響細胞生長［11-12］。因此，本研究通過免疫組織化學(xué)染色分析GPR120 與GPR40 在卵巢癌樣本中的表達情況，探討2種蛋白表達與卵巢癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在闡明GPR120 與GPR40 作為卵巢癌分子標(biāo)志物的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月—2019年12月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科受手術(shù)治療的128例原發(fā)性卵巢癌患者，平均年齡（54.8±12.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)明確診斷為上皮性來源卵巢癌，包括漿液性和黏液性。（2）FIGO分期Ⅰ—Ⅲ期，無超出腹腔的遠處轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前接受化療、放療等的抗腫瘤治療者。（2）臨床病理資料與隨訪信息不完整者。從我院病理科系統(tǒng)收集所有手術(shù)患者的石蠟包埋組織樣本，查閱病歷記錄患者的臨床病理數(shù)據(jù)。本研究已通過我院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)（倫理號：NTFY2017-A09），所有患者簽署知情同意書。

1.2 免疫組化染色與結(jié)果判定 將石蠟包埋的卵巢癌組織連續(xù)切割成4μm 厚的切片，二甲苯和梯度乙醇進行脫蠟和脫水。PBS洗滌切片后，在95 ℃的檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中抗原修復(fù)30 min。在室溫下使用3%H2O2溶液抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性15 min，并將切片與胎牛血清在室溫下孵育30 min，阻斷非特異性位點。PBS緩沖液多次洗滌切片后，分別加入1∶200 稀釋的兔抗人多克隆GPR120 與GPR40（英國Abcam 公司）一抗，在4 ℃下孵育過夜。次日，向組織切片中加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）繼續(xù)孵育30 min。PBS 緩沖液洗滌切片后，使用二氨基聯(lián)苯胺顯色劑觀察免疫染色，并用蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片固定。

免疫組化染色的結(jié)果由2名研究人員根據(jù)染色強度與陽性染色細胞比例進行獨立評分。染色強度評分分為4 個等級：陰性=0 分、弱（淺黃色）=1 分、中等（棕黃色）=2 分、強（棕色）=3 分；陽性染色細胞的比例分計分標(biāo)準(zhǔn)如下：＜25%=0分，25%~49%=1 分，50%~75%=2 分，>75%=3 分。將染色強度得分與陽性染色細胞比例得分相乘得到免疫組化染色的最終分數(shù)，其中＜4 分被定義為低表達，≥4 分被定義為高表達。如果2 位評價者的評分有不一致之處，則由第3 人進行復(fù)核，并協(xié)商得出相對最終結(jié)果。

1.3 隨訪 通過查閱門診或住院病例以及電話探訪等定期隨訪方式了解患者的生存狀態(tài)。生存分析的主要研究結(jié)局為無病生存期（DFS），計算為患者自手術(shù)之日起直至因卵巢癌復(fù)發(fā)或死亡的時間節(jié)點。本研究的中位隨訪時間為41.0（33.0，49.0）個月，隨訪完成率100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；分類變量以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。使用Kaplan-Meier 方法進行生存分析，組間差異的比較采用Log-rank檢驗。Cox回歸分析卵巢癌患者預(yù)后的影響因素。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPR120、GPR40 蛋白在卵巢癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化染色結(jié)果表明，兩者主要在胞漿與胞膜中呈陽性表達，見圖1。進一步分析發(fā)現(xiàn)，80 例（62.5%）患者GPR120 高表達，72例（56.3%）GPR40高表達。其中，F(xiàn)IGOⅡ—Ⅲ期和組織學(xué)G3 級患者的GPR120 和GPR40 高表達表達比例分別高于FIGOⅠ期與組織學(xué)G1—G2 級，見表1、2。

Fig.1 Immunohistochemical staining of GPR120 and GPR40 protein expression in ovarian cancer tissue(×400)圖1 GPR120與GPR40蛋白在卵巢癌組織中的免疫組化染色結(jié)果（×400）

2.2 GPR120、GPR40 表達與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪期間，共有41 例（32.0%）患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或因卵巢癌死亡，全組患者的4 年DFS 率為62.2%。生存分析表明，GPR120 高表達者的預(yù)后結(jié)局明顯劣于低表達者，4 年DFS 率分別為56.9%和70.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rankχ2=5.144，P=0.023），圖2A。此外，GPR40高表達者的4年DFS率亦顯著低于低表達者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（57.7%vs.68.4%，Log-rankχ2=4.491，P=0.034），圖2B。

2.3 影響卵巢癌患者DFS的Cox回歸分析 以年齡（＜55 歲=0，≥55 歲=1），組織學(xué)分級（G1/G2=0，G3=1），腫瘤大?。ǎ? cm=0，≥5 cm=1），腹水（＜100 mL=0，≥100 mL=1），F(xiàn)IGO分期（Ⅰ期=0，Ⅱ—Ⅲ期=1），術(shù)后殘留灶大小（＜1 cm=0，≥1 cm=1），化療（否=0，是=1），GPR120 表達（低表達=0，高表達=1），GPR40 表達（低表達=0，高表達=1）為自變量，以生存結(jié)局（生存=0，死亡=1）為因變量，進行單因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示，組織學(xué)分級、腫瘤大小、FIGO 分期、術(shù)后殘留灶大小、GPR120 表達和GPR40 表達與卵巢癌患者低DFS 顯著相關(guān)。結(jié)合單因素分析結(jié)果，選取FIGO 分期、術(shù)后殘留灶大小、GPR120 表達、GPR40表達進行多因素Cox 回歸分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO 分期Ⅱ—Ⅲ期、術(shù)后殘留灶≥1 cm、GPR120 高表達與GPR40 高表達是卵巢癌患者DFS 的獨立影響因素，見表3、4。

Tab.1 Comparison of GPR120 protein expression levels between ovarian cancer patients with different clinicopathological features表1 不同臨床病理特征的卵巢癌患者GPR120蛋白表達水平比較

3 討論

近年來，以手術(shù)聯(lián)合化療、靶向藥物的綜合治療取得了很大進展，但卵巢癌患者仍面臨著腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的嚴峻挑戰(zhàn)。作為臨床常用的血清腫瘤標(biāo)志物，CA125 和HE4 對卵巢癌的診斷與預(yù)后評估并未顯示出足夠的特異性與敏感性［13］。因此，尋找能夠評估卵巢癌生物學(xué)行為和患者預(yù)后，并作為潛在治療靶點的可靠分子標(biāo)志物具有重要臨床意義。

Tab.2 Comparison of GPR40 protein expression levels between ovarian cancer patients with different clinicopathological features表2 不同臨床病理特征的卵巢癌患者GPR40蛋白表達水平比較

Tab.3 Univariate Cox regression analysis of DFS for ovarian cancer patients表3卵巢癌患者DFS的單因素Cox回歸分析

Fig.2 Relationship between GPR120 and GPR40 protein expression and DFS in ovarian cancer patients圖2 GPR120、GPR40蛋白表達與卵巢癌患者DFS的關(guān)系

Tab.4 Multivariate Cox regression analysis of DFS for ovarian cancer patients表4 卵巢癌患者DFS的多因素Cox回歸分析

GPR120 與GPR40 作為G 蛋白偶聯(lián)受體家族中的成員，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、激素分泌和抗炎反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［10］。最近有研究發(fā)現(xiàn)兩者在多種腫瘤中存在明顯異常表達，并參與了腫瘤的發(fā)生與進展［14-16］。Cui 等［17］發(fā)現(xiàn)GPR120 在食管癌組織中的表達水平顯著提升，與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期密切相關(guān)，下調(diào)GPR120 表達顯著抑制了食管癌細胞在體外的增殖、遷移和侵襲能力，在體內(nèi)動物模型中，GPR120表達沉默同樣延緩了腫瘤的生長。Sun等［15］發(fā)現(xiàn)GPR120在胰腺癌中顯著高表達，生存分析發(fā)現(xiàn)GPR120 高表達可以預(yù)測胰腺癌患者的不良預(yù)后。這些結(jié)果表明，GPR120可能發(fā)揮致癌作用，促進腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。

GPR40 與人類癌癥的關(guān)系亦被多項研究證實。Kleemann等［16］在114例石蠟包埋的黑色素瘤組織中研究了GPR40 蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與良性痣相比，黑色素瘤和黑色素瘤轉(zhuǎn)移瘤中GPR40 表達更高，可作為黑色素瘤患者的獨立預(yù)后標(biāo)志物。此外，Nakashima等［18］檢測了36例漿膜下浸潤性結(jié)直腸癌中GPR40的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有患者均有GPR40陽性表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移（尤其是肝轉(zhuǎn)移）、TNM 分期和不良預(yù)后呈正相關(guān)。在生物學(xué)功能方面，既往研究證實選擇性抑制GPR40 受體的活性，可以明顯降低黑素瘤、骨肉瘤細胞的運動性，抑制腫瘤的遷移［19］。這些研究結(jié)果表明GPR40 的異常激活可能是腫瘤進展的標(biāo)志之一，以GPR40受體作為靶點有望成為未來抗腫瘤治療的新方式。本研究重點探討了GPR120與GPR40兩者作為卵巢癌分子標(biāo)志物的臨床與預(yù)后意義，發(fā)現(xiàn)GPR120 與GPR40 在大多數(shù)卵巢癌組織中呈明顯高表達，且與較高的組織學(xué)分級和進展的腫瘤分期相關(guān)。生存分析揭示GPR120 與GPR40 高表達是卵巢癌患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子。這些證據(jù)支持GPR120與GPR40參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程的假設(shè)，為更好地理解兩者在卵巢癌中的作用機制提供了研究基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究證實了兩種游離脂肪酸相關(guān)的G 蛋白偶聯(lián)受體GPR120與GPR40在卵巢癌組織中的高表達，兩者表達的增加與高組織學(xué)分級、FIGO 分期及不良預(yù)后顯著相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明GPR120 與GPR40 是預(yù)測卵巢癌侵襲性與預(yù)后不良的有效分子標(biāo)志物，兩者可能參與了卵巢癌的惡性轉(zhuǎn)化與進展。