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        軟骨母細胞瘤中 H 3.3組蛋白基因突變檢測及其臨床意義△

        2023-03-14 13:48:56羅威董金波古家美王芳吳小延
        癌癥進展 2023年2期
        關鍵詞:肉瘤基因突變軟骨

        羅威,董金波,古家美,王芳,吳小延#

        中山大學腫瘤防治中心1影像科,2分子診斷科,廣州 510060

        軟骨母細胞瘤(chondroblastoma,CB)是一種罕見的良性軟骨瘤,約占所有骨腫瘤的1%,通常累及長骨的骨骺,多見于20~30歲的患者,多發(fā)生于骨骼未成熟患者的骨骺處,男性多見[1-2]。CB并不經(jīng)常導致患者死亡,但CB與其他骨腫瘤具有重疊特征,例如軟骨黏液樣纖維瘤(chondromyxoid fibroma,CMF)和骨巨細胞瘤(giant cell tumor of bone,GCTB),導致有時難以診斷CB[3]。以往的研究發(fā)現(xiàn),95%的CB在H3組蛋白成員H3.3組蛋白A(H3.3 histone A,H3F3A)(1號染色體)和H3.3組蛋白B(H3.3 histone B,H3F3B)(17號染色體)中存在p.K36M突變,其中大多數(shù)涉及H3F3B[4]。在CB中,組蛋白H3.3的36位賴氨酸至甲硫氨酸(H3K36M)突變蛋白與組蛋白H3.3的36位賴氨酸(H3K36)的SET結構域2,組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(SET domain containing 2,histone lysine methyltransferase,SETD2)緊密結合,競爭性抑制它們與共同表達的野生型H3組蛋白結合,從而導致H3K36甲基化異常[5-6]。CB的產(chǎn)生與H3組蛋白第36位賴氨酸甲基化(H3K36me)突變過程有關[5,7]。H3K36me是一種參與表觀遺傳調(diào)控的組蛋白修飾蛋白,在DNA復制、轉(zhuǎn)錄、重組和DNA損傷修復[8]等生物學過程中發(fā)揮重要作用。突變的組蛋白H3K36多肽或核小體可顯著下調(diào)組蛋白H3K36甲基轉(zhuǎn)移酶SETD2的活性,重組H3K36me甲基化情況,并通過改變腫瘤相關基因[6,9]的表達來促進CB的發(fā)生。因此,H3.3組蛋白(H3.3 histone,H3F3)基因中的K36M位點是診斷CB靈敏度和特異度均較好的標志物[10]。本研究通過檢測CB和其他骨腫瘤中H3F3基因突變狀態(tài),分析H3F3基因突變與CB臨床特征的關系,為深入探討H3F3基因在CB發(fā)病機制中的作用提供理論基礎,現(xiàn)報道如下。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        收集2018年5月至2022年8月中山大學腫瘤防治中心分子診斷科存檔的CB患者的病歷資料。納入標準:①有基本的臨床資料;②經(jīng)手術組織病理學明確診斷為CB。排除標準:①骨腫瘤類型不明確;②臨床資料不完整。根據(jù)納入、排除標準,共納入31例CB患者,其中,男性20例,女性11例;年齡11~36歲,平均(19.5±7.4)歲;股骨為最常見的發(fā)病部位,其次為肱骨。另選取24例GCTB、7例動脈瘤樣骨囊腫、1例非骨化性纖維瘤、9例軟骨源性腫瘤(1例CMF、1例內(nèi)生性軟骨瘤、5例間葉性軟骨肉瘤、1例透明細胞軟骨肉瘤、1例繼發(fā)性軟骨肉瘤)、9例骨肉瘤(8例普通型骨肉瘤及1例低級別骨肉瘤)患者的腫瘤組織。所有腫瘤組織均采用中性緩沖甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋。由3位病理科醫(yī)師檢查每個腫瘤組織的蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色的載玻片,并從中選擇合適的石蠟塊用于Sanger測序。

        1.2 檢測方法

        1.2.1 試劑與儀器核酸提取試劑盒購自基因科技股份有限公司,通用型DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。NanoDrop1000超微量分光光度計購自美國Nanodrop公司,ABI 3500XL聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀購自美國Applied Biosystems公司。

        1.2.2 HE染色將3 μm厚的組織切片置于載玻片上,在4%多聚甲醛中浸泡4 h,然后轉(zhuǎn)移至70%乙醇中。將切片放入處理盒中,通過一系列乙醇梯度脫水,并嵌入石蠟塊中。染色前,切片在二甲苯中脫蠟,通過降低乙醇濃度再水化,并在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)中洗滌,然后用HE染色。染色后,切片通過增加濃度的乙醇和二甲苯脫水。

        1.2.3 測定DNA濃度和純度甲醛固定石蠟包埋組織,采用核酸提取試劑盒提取組織樣本DNA。病理科醫(yī)師根據(jù)HE染色選?。?0%的腫瘤組織蠟塊,3 μm厚連續(xù)切片10張,用石蠟貼片機貼于載玻片上,二甲苯脫蠟后嚴格按照試劑盒說明書進行操作,提取完畢后使用超微量分光光度計測定DNA濃度和純度。

        1.2.4 Sanger測序法使用PCR儀擴增H3F3B及H3F3A的36號密碼子目的片段,引物由上海生工生物公司合成,H3F3A上游引物序列為5'-GGCTCGTACAAAGCAGAC-3',下游引物序列為5'-CAGTACATTTATTTAAGCAGTAG-3',長度為277 bp。H3F3B上游引物序列為5'-CACGAAAGCCGCCAGGAA-3',下游引物序列為5'-CAGCGAGCAGGGGAGGAGT-3',長度為 143 bp。PCR 反應體系為 2×Premix EX TapTM12.5 μl,上、下游引物(10 μmmol/L)各 1.0 μl,DNA 模板 5.0 μl,去離子水5.5 μl,總體系 25.0 μl。PCR 反應程序:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,66 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)10次;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)30次;72℃延伸5 min,12℃保溫。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,利用通用型DNA純化回收試劑盒回收。使用ABI 3500XL型測序分析儀進行雙向測序,使用Chromas軟件與基因組DNA序列進行比對。根據(jù)堿基信號峰圖判定是否存在突變。

        1.3 統(tǒng)計學方法

        采用R語言進行統(tǒng)計分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(P25,P75)]表示,組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)及率(%)表示,組間比較采用Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 CB和其他骨腫瘤中 H3F3基因測序結果

        基因突變分析顯示,31例CB中H3F3基因突變陽性率為80.6%,其中H3F3BK36M突變24例,H3F3AK36M突變1例(圖1),而其他骨腫瘤中均未發(fā)現(xiàn)H3F3基因突變。

        圖1 CB病例基因突變的Sanger測序分析

        2.2 H3F3基因突變與CB臨床特征的關系

        不同H3F3基因突變狀態(tài)的CB患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(表1)

        表1 不同 H 3 F 3基因突變狀態(tài)CB患者臨床特征的比較

        3 討論

        CB作為一種良性軟骨瘤,由于與其他骨腫瘤的特征重疊,有時難以確診。在形態(tài)學基礎上通過有限的穿刺活檢區(qū)分這些腫瘤類型特別困難,因此分子檢測(或免疫組化)對于鑒別診斷至關重要。CB在第4版世界衛(wèi)生組織分類中被歸類為具有中等生物學潛力的腫瘤[11],而在第5版中被重新歸類為良性腫瘤[12]。Behjati等[7]的研究顯示,組蛋白H3K36M和H3G34W的突變分別是CB和GCTB產(chǎn)生的驅(qū)動突變。本研究通過DNA測序分析顯示,25例CB都具有這種精確的遺傳改變,顯示出這種突變的獨特性。此外,通過DNA測序分析評估的其他6例CB和50例其他類型骨腫瘤均未顯示突變。

        本研究發(fā)現(xiàn),31例CB中有80.6%的病例出現(xiàn)H3F3基因突變,以H3F3BK36M突變?yōu)橹?,其他骨腫瘤中均無突變,表明這種H3F3K36M基因突變對CB具有獨特性,并且根據(jù)之前的研究顯示,有96%的CB具有p.K36M突變[11],因此該突變檢測方法代表了一種有價值的工具,該基因突變可用于區(qū)分CB和其他原發(fā)性骨腫瘤。此外,由于只有約4%的CB不存在H3F3p.K36M突變,因此未能檢測到突變時應該考慮其他組織類型,并且要謹慎診斷CB。

        除CB外,透明細胞軟骨肉瘤是唯一檢測到p.K36M突變的軟組織腫瘤,它是一種惡性骨腫瘤,僅占所有軟骨肉瘤的2%[11]。透明細胞軟骨肉瘤與CB有許多重疊的臨床特征和放射學特征,包括腫瘤發(fā)病部位,但透明細胞軟骨肉瘤需要整體切除,而CB通常是刮除術。透明細胞軟骨肉瘤最常見于30~40歲患者的股骨近端和肱骨,而CB最常見于20~30歲患者的股骨遠端和脛骨近端。然而,兩者都可以出現(xiàn)在年齡>40歲的患者中,并且可以出現(xiàn)在身體的任何骨骼中。在影像學特征中,透明細胞軟骨肉瘤很難與CB區(qū)分,因為兩種腫瘤類型在MRI上的信號強度非常不均勻。盡管與CB相比,透明細胞軟骨肉瘤通常較大,瘤周水腫和關節(jié)滑膜炎不太明顯,但這些標準不足以區(qū)分這兩種腫瘤[13]。本研究中并未發(fā)現(xiàn)透明細胞軟骨肉瘤有p.K36M突變的情況,或許需要更多的實驗數(shù)據(jù)來證實。

        CB偶爾可以與傳統(tǒng)的中央/表面軟骨腫瘤、間充質(zhì)軟骨肉瘤共享形態(tài)學表現(xiàn)。然而本研究顯示,在這些腫瘤中未顯示有H3F3K36M基因突變的情況,證明了該標志物的獨特價值。區(qū)分CB和軟骨母細胞骨肉瘤可能具有挑戰(zhàn)性,不僅因為形態(tài)重疊,而且在極少數(shù)情況下,CB會轉(zhuǎn)移到肺部。這種病變可以通過從肺部切除來控制,而不會導致疾病進展。區(qū)分這兩種腫瘤對于提供適當?shù)呐R床治療至關重要,這涉及骨肉瘤患者的新輔助化療。有一種異常罕見的骨肉瘤變體,稱為軟骨母細胞瘤樣骨肉瘤,這種腫瘤與其良性對應物的組織學表型相似,但顯示具有核異型性和滲透性生長模式[14]。

        CB富含的破骨細胞成分與其他富含破骨細胞的骨腫瘤重疊,包括GCTB、動脈瘤性骨囊腫及非骨化性纖維瘤等骨腫瘤。本研究及之前的文獻表明,這些不含有H3F3p.K36M突變[15]。盡管96%的GCTB和70%的動脈瘤樣骨囊腫分別具有H3F3G34突變和USP6重排,但尚未報道其他富含破骨細胞腫瘤的診斷性生物標志物[16-18]。因此,H3F3K36M突變可用于排除這些診斷。

        綜上所述,H3F3p.K36M突變在CB中具有獨特性,H3F3p.K36M突變是一種有價值的診斷工具,病理科醫(yī)師可以使用它來快速、低成本地提供更準確的診斷。

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