馮浩， 代雅玲， 章君儀， 陳夢嬌， 彭世雄， 唐樺， 高麗娜， 譚文， 賈曉敏

(1.湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院 & 湖南省人民醫(yī)院 皮膚科， 湖南 長沙 410005； 2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 病理科， 湖南 長沙 410013； 3.長沙市第八醫(yī)院 病理科， 湖南 長沙 410100； 4.拉薩市人民醫(yī)院 病理科， 西藏 拉薩 850000)

皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)屬于高度惡性腫瘤，是由皮膚組織及黏膜黑色素細(xì)胞惡性分化而成，占皮膚腫瘤死亡病例的絕大部分，預(yù)后較差[1-2]。近年來我國CMM的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[3-4]，盡管對CMM的臨床研究較多，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。有文獻(xiàn)報告惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與泛素連接酶的表達(dá)密切相關(guān)，可通過檢測泛素連接酶的表達(dá)量來判斷腫瘤的預(yù)后[5-6]。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育調(diào)控樣蛋白(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 4-like，Nedd4L)是早期胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育下調(diào)基因，屬于泛素連接酶Nedd4家族成員[7]，Nedd4L已被證明在前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膽囊癌、胃癌、惡性膠質(zhì)瘤及結(jié)腸直腸癌等腫瘤的預(yù)后中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。環(huán)指型泛素連接酶(asitasb-lineage lymphoma-b，Cbl-b)是Cbl家族成員之一，屬于環(huán)指型E3泛素連接酶，在腫瘤發(fā)病中可通過其N-端酪氨酸激酶結(jié)合(tyrosine kinase binding，TKB)結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合底物蛋白酪氨酸激酶，從而啟動底物泛素化降解，參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控[9-10]；研究發(fā)現(xiàn)Nedd4L和Cbl-b的表達(dá)與CMM密切相關(guān)[11-12]，但缺乏同時檢測2種指標(biāo)表達(dá)與CMM發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系研究。因此，本研究探討Nedd4L與Cbl-b在CMM中的表達(dá)情況，并分析其臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年2月—2018年2月就診的CMM患者作為CMM組，要求病理檢查符合CMM診斷標(biāo)準(zhǔn)[13-14]，且入組前未接受過手術(shù)、化療及激光治療等；排除感染性疾病、急慢性肝腎功能不全、結(jié)締組織病變、自身免疫疾病等。共納入CMM組患者40例，男25例、女15例，年齡24～78歲、平均(52.2±3.8)歲，病程6個月～15年、平均(6.8±1.2)年，發(fā)生于四肢、胸背部、外陰部及面頰部分別為12例、8例、10例及10例，無轉(zhuǎn)移CMM 25例、有轉(zhuǎn)移CMM 15例，CMM的臨床分期分0期(原位癌)12例、Ⅰ～Ⅱ期(腫瘤細(xì)胞局限無轉(zhuǎn)移)8例、Ⅲ期(腫瘤發(fā)生區(qū)域轉(zhuǎn)移，但仍局限于皮膚內(nèi))10例及Ⅳ期(腫瘤已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)10例，腫瘤潰瘍20例、無腫瘤潰瘍20例。所有CMM組患者均有較完整的病歷資料，并且通過電話隨訪患者預(yù)后，并簽署知情同意書。同時收集良性痣患者50例為對照組，男32例、女18例，年齡18～72歲、平均(51.9±3.2)歲，皮內(nèi)痣21例、交界痣19例及混合痣10例。收集2組患者病理科存檔蠟塊及隨訪情況。

1.2 研究方法

1.2.1鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(streptavidin-perosidase，SP)檢測組織中Nedd4L、Cbl-b表達(dá) 取2組患者病變組織切片標(biāo)本，采用無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各浸泡30 min；酒精脫水，透明劑、脫水劑與石蠟混合，無水乙醇 ∶二甲苯(1 ∶1)與二甲苯Ⅰ各10 min，二甲苯Ⅱ7 min；組織透明后，采用石蠟Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ于60 ℃依次浸蠟1 h；先將蠟塊冷凍5 min，采用KD202A病理切片機(jī)(金華科迪儀器設(shè)備有限公司)切片，依次放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ、10 min/次，加無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ、5 min/次，加95%和70%酒精、3 min/次；蒸餾水浸洗2 min；組織切片采用蘇木素染液進(jìn)行染核，沖洗；依次加適量無水乙醇Ⅰ、Ⅱ及二甲苯Ⅰ、Ⅱ，5 min/次；切片風(fēng)干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。Nedd4L以胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色顆粒狀物質(zhì)為陽性表達(dá)、也可在CMM細(xì)胞核中少量表達(dá)為陽性，Cbl-b表達(dá)以胞漿或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞；染色切片由高年資醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行診斷及染色，每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野(200倍)，每個高倍視野以50個腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.2.2染色結(jié)果判斷 根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度及染色密度判斷染色結(jié)果，均采用4級評分，染色強(qiáng)度規(guī)定不著色、呈淡黃色、棕黃色及棕褐色分別計為0、1、2及3分，染色密度規(guī)定著色細(xì)胞比例<5%、5%～25%、26%～50%及>50%分別計為0(陰性)、1、2及3分，染色強(qiáng)度和染色密度乘積得分即得染色結(jié)果；乘積得分≤2分、3～6分及>6分別定義為陰性(-)、陽性(+)及強(qiáng)陽性(++)表達(dá)，同時計算蛋白表達(dá)率(蛋白表達(dá)率=陽性表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)×100%)[15]。

1.2.3隨訪資料收集 通過查閱病歷并進(jìn)行隨訪，收集CMM組患者性別、年齡、腫瘤部位、有無發(fā)生轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤潰瘍、腫瘤厚度等一般臨床資料，隨訪3年內(nèi)生存時間。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料數(shù)據(jù)采用頻數(shù)、百分比表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法比較組間差異，兩兩比較P值采用0.05/6=0.008作為校正標(biāo)準(zhǔn)；采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析Nedd4L、Cbl-b單一和聯(lián)合檢測對CMM組患者預(yù)后的預(yù)測價值；P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nedd4L和Cbl-b蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示，Nedd4L蛋白在CMM組患者病理切片組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)、對照組中呈弱陽性表達(dá)，Cbl-b在CMM組和對照組患者組織中分別呈陽性和陰性表達(dá)；χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，CMM組患者組織中Nedd4L、Cbl-b蛋白陽性表達(dá)率均高于對照組患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 CMM組和對照組患者病理切片組織中Nedd4L和Cbl-b的表達(dá)(SP，×200)Fig.1 Expression of Nedd4L and Cbl-b in control group and CMM group(SP，×200)

2.2 不同臨床分期CMM患者病理切片組織中Nedd4L和Cbl-b表達(dá)

χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，CMM組不同臨床分期患者病理切片組織中Nedd4L和Cbl-b的陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床分期CMM組患者的Nedd4L和Cbl-b陽性表達(dá)[n(%)]Tab.2 Positive expression of Nedd4L and Cbl-b in CMM patients with different clinical stages[n(%)]

2.3 CMM組患者隨訪期間的死亡情況

隨訪結(jié)果顯示，CMM組患者死亡21例、死亡率為52.50%(21/40)；CMM組患者年齡越大、腫瘤潰瘍、腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、臨床分期越晚、腫瘤厚度越厚、Nedd4L及Cbl-b陽性表達(dá)是導(dǎo)致CMM預(yù)后較差的關(guān)鍵因素(P<0.05)。見表3。

表3 不同臨床特征CMM組患者死亡率比較[n(%)]Tab.3 Comparison of mortality rate of CMM patients with different clinical features[n(%)]

2.4 Nedd4L和Cbl-b指標(biāo)評估CMM患者預(yù)后的價值

ROC分析可知，Nedd4L和Cbl-b表達(dá)在CMM組患者死亡率診斷中曲線下面積(area under curve，AUC)均>0.5，提示Nedd4L、Cbl-b表達(dá)在CMM組患者死亡率診斷中有一定的應(yīng)用價值；各指標(biāo)Youden指數(shù)最大值所對應(yīng)的變量值獲得最佳臨界點(diǎn)，確定Nedd4L、Cbl-b在CMM患者預(yù)后中的診斷值，Nedd4L聯(lián)合Cbl-b對CMM患者預(yù)后的判斷和特異性均高于單一指標(biāo)(P<0.05)。見表4。

表4 Nedd4L和Cbl-b檢測對CMM患者預(yù)后的評估價值Tab.4 Evaluating value of Nedd4L and Cbl-b in prognosis of patients with CMM

3 討論

CMM是一種發(fā)病率高、惡性程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)的惡性腫瘤，目前CMM治療仍以手術(shù)為主，化療、放療、靶向治療及免疫治療在臨床上也有廣泛應(yīng)用[16]，但不同年齡、發(fā)病部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度及手術(shù)切除范圍的患者預(yù)后效果存在明顯的差異[17-18]。

Nedd4L和Cbl-b是E3泛素連接酶家族成員，參與細(xì)胞周期的調(diào)控、凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及藥物抵抗等重要過程[19-20]。Nedd4家族成員具有獨(dú)特的模塊結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，氨基末端C2鈣依賴性磷脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域和蛋白與蛋白相互作用的2～4個WW結(jié)構(gòu)域和羧基末端HECT泛素連接酶結(jié)構(gòu)域[21]。E3泛素連接酶可與底物蛋白直接或間接結(jié)合并決定蛋白泛素化特異性，泛素化降解蛋白在調(diào)控細(xì)胞生命活動過程中起到重要作用，因此，確保蛋白質(zhì)泛素化過程有序正常維持對維持細(xì)胞生命活性有重要的意義，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[22-25]。

Cbl-b是建立T細(xì)胞激活閾值和通過各種機(jī)制調(diào)節(jié)外周T細(xì)胞耐受必不可少的關(guān)鍵因子[26]。有研究表明，Cbl-b也可調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，并在宿主對病原體的防御和抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]。Cbl-b缺失會導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)控缺陷，并會導(dǎo)致自發(fā)性或誘導(dǎo)性自身免疫反應(yīng)[23]。在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中可存在Cbl-b過表達(dá)情況，從而影響腫瘤免疫耐受性。

本研究結(jié)果表明Nedd4L、Cbl-b陽性表達(dá)與CMM的發(fā)生及病情進(jìn)展有密切的關(guān)系，其中對相關(guān)病理標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，CMM組患者組織中Nedd4L、Cbl-b蛋白表達(dá)水平高于對照組；對CMM患者進(jìn)行3年隨訪觀察結(jié)果顯示，CMM組患者死亡率為52.05%；對影響CMM患者死亡的相關(guān)因素分析，結(jié)果顯示，腫瘤潰瘍、腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤厚度、Nedd4L及Cbl-b陽性表達(dá)是CMM患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，這表明Nedd4L及Cbl-b陽性表達(dá)除了與CMM進(jìn)展有關(guān)外，還與CMM患者預(yù)后有著密切聯(lián)系。本研究采用ROC曲線分析，Nedd4L、Cbl-b在CMM患者預(yù)后中的診斷價值，結(jié)果顯示，Nedd4L聯(lián)合Cbl-b對CMM患者預(yù)后的診斷靈敏性、特異性高于單一指標(biāo)，表明Nedd4L、Cbl-b可作為評價CMM病情進(jìn)展及預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

綜上，Nedd4L、Cbl-b陽性表達(dá)與CMM發(fā)生及病情進(jìn)展有密切關(guān)系。腫瘤潰瘍、腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤厚度、Nedd4L及Cbl-b陽性表達(dá)是影響CMM患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素；Nedd4L、Cbl-b可作為CMM患者預(yù)后的評價指標(biāo)，且聯(lián)合應(yīng)用可提高CMM患者預(yù)后評價的準(zhǔn)確性及靈敏性，可為CMM預(yù)后預(yù)測的評價指標(biāo)。