李瑩 林建東 林曉 肖文彪 郭清清 林炳文 廖秀玉

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，福建 福州 350005)

膿毒癥屬于一種可累及多個器官、系統(tǒng)的因感染所致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，急性腎損傷是膿毒癥進(jìn)展過程中最為嚴(yán)重的一種并發(fā)癥，急性腎損傷的發(fā)生在一定程度上威脅著患者的生命安全，并發(fā)此并發(fā)癥的患者預(yù)后生存期均較短〔1,2〕。目前臨床研究認(rèn)為膿毒癥并發(fā)急性腎損傷的發(fā)生與多種因素相關(guān)，微小RNA(miRNA)在該病發(fā)生過程中具有重要的作用，miR-10a屬于miRNA家族成員之一，其被證實(shí)與膿毒癥并發(fā)急性腎損傷相關(guān)〔3〕。本文分析下調(diào)微小RNA-10a(miR-10a)對膿毒癥并發(fā)急性腎損傷模型大鼠細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取60只SFP級雄性大鼠，購自慕恩(廣州)生物科技有限公司，動物許可證號：SYXK(粵)2020-0225，6～8周齡，平均體重(252.16±25.26)g，在相對濕度為30%～35%、溫度為(23.8±1.5)℃下飼養(yǎng)1 w，每日光照24 h，明暗周期為12 h。本試驗(yàn)操作均嚴(yán)格參照動物實(shí)驗(yàn)倫理要求相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，且獲得醫(yī)院倫理委員會審批同意。主要試劑：miR-10a慢病毒載體構(gòu)建由上海吉瑪公司設(shè)計并完成，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒及相關(guān)試劑均由美國RD公司提供，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒及相關(guān)試劑均由美國Cayman公司提供，小鼠抗大鼠ERK抗體由深圳市豪地華拓生物科技有限公司提供，兔抗人p-ERK抗體由上海冠導(dǎo)生物工程有限公司提供，兔抗大鼠MEK抗體由北京義翹神州科技股份有限公司(Sino Biological Inc.)提供，小鼠抗大鼠p-MEK抗體由上海梵態(tài)生物科技有限公司提供。

1.2分組及建模 隨機(jī)選取60只SPF級雄性大鼠，其中15只為空白組，其余45只采用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥急性腎損傷大鼠模型，對大鼠行常規(guī)20 mg/kg的2%戊巴比妥腹腔麻醉后，以腹部正中為操作切口，制備大約1 cm的切口，將腹膜逐層打開，找到盲腸后對其遠(yuǎn)端行游離處理，將盲腸中的糞便擠向遠(yuǎn)端，盲腸中段使用3號絲線結(jié)扎，盲腸遠(yuǎn)端使用12號針頭做穿孔處理，將少量糞便擠壓至盲腸表面，之后回納盲腸、縫合腹膜、關(guān)閉腹腔，術(shù)后大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)。建模后大鼠表現(xiàn)為直腸溫度較建模前升高>1℃、呼吸頻率、心率為建模前的2倍，精神萎靡、豎毛、口鼻分泌物增多及少動等表現(xiàn)為建模成功標(biāo)準(zhǔn)，最終45只大鼠均建模成功，隨機(jī)分為模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各15只。

1.3miR-10a慢病毒載體構(gòu)建及滴定 使用GenBank查找序列獲得miR-10a序列，構(gòu)建miR-10a過表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(上調(diào))、miR-10a沉默轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(下調(diào))，由上海吉瑪公司設(shè)計并合成，并做慢病毒滴度測定(病毒滴度為1×109TU/ml)。在建模后上調(diào)組尾部注射含10 μl miR-10a過表達(dá)慢病毒懸液，下調(diào)組尾部注射10 μl miR-10a沉默慢病毒懸液。空白組、模型組不進(jìn)行任何處理，24 h后觀察大鼠變化。

1.4miR-10a轉(zhuǎn)染效率鑒定 在miR-10a轉(zhuǎn)染完成24h后，采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測miR-10a轉(zhuǎn)染效率，隨機(jī)選取每組5只大鼠，使用5%苯巴比妥做常規(guī)腹腔注射麻醉后處死，迅速取腎組織，提取腎組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以U6為內(nèi)參照，miR-10a上游序列5′-ACATCATACCCTGTAGAACCGAA-3′，下游：5′-GATTGGAT GTTCTCCACAGTCTC-3′；U6上游序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3′。

1.5樣本采集 采集各組剩余10只大鼠尾部靜脈血1.5 ml，分離血清備用。靜脈血采集完成后做實(shí)驗(yàn)動物常規(guī)麻醉后迅速取腎組織，分為3等份，其中1份做組織切片，另外2份在液氮中保存用于后續(xù)指標(biāo)檢測。

1.6腎功能、腎損傷、局部炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)測定 采用ELISA測定腎功能指標(biāo)肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、腎損傷分子(KIM)-1、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、局部炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10水平，取所制備的血清，將ELISA檢測試劑盒放置于室溫下做平衡20 min處理，之后將不同濃度的50 μl標(biāo)準(zhǔn)品加入至標(biāo)準(zhǔn)孔中，將50 μl待測樣品加入至樣本孔中，每孔中加入100 μl的辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，密封反應(yīng)孔，在溫度為37℃的環(huán)境下孵育1 h，將上清液棄除后加入350 μl的洗滌液，在室溫環(huán)境下孵育1 min，棄除上清液，重復(fù)上述步驟5次，之后將50 μl的底物A、底物B加入至每孔中，37℃孵育15 min，之后終止反應(yīng)，獲得Cr、BUN、NGAL、KIM-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平。

1.7病理組織學(xué)觀察 取腎組織切片，脫蠟、脫水后行蘇木素-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理變化。

1.8腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取1份液氮中所保存的腎組織，制備為組織勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測定氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD活性，采用改良硫代巴比妥酸法測定氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平。

1.9腎組織ERK信號通路蛋白檢測 采用Western印跡測定腎組織ERK信號通路蛋白表達(dá)量，取1份液氮中保存的腎組織，提取組織總蛋白，取20 μg蛋白質(zhì)樣本，電泳1.5 h后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在室溫下做封閉處理，之后分別加入1∶1 000 TBST給予稀釋的ERK信號通路蛋白ERK、p-ERK、絲裂原活化蛋白(MEK)、p-MEK一抗，使用1∶2 500的辣根過氧化氫酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育處理，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，使用Labwork凝膠圖像掃描所獲得膠片，以GAPDH為內(nèi)參，計算ERK、p-ERK、MEK、p-MEK蛋白表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件，計量資料經(jīng)Levene法檢測具備方差齊性，Shapiro-wilk檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染效率鑒定 與空白組(1.14±0.35)相比，模型組、上調(diào)組、下調(diào)組miR-10a表達(dá)量(2.46±0.84、3.25±1.02、1.99±0.32)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，上調(diào)組miR-10a表達(dá)量升高，下調(diào)組miR-10a表達(dá)量降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，說明miR-10a轉(zhuǎn)染成功。

2.2各組腎功能、腎損傷相關(guān)指標(biāo)對比 與空白組相比，模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各指標(biāo)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，上調(diào)組各指標(biāo)水平明顯升高，下調(diào)組各指標(biāo)水平明顯降低(P<0.05)；與上調(diào)組相比，下調(diào)組各指標(biāo)水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.3各組局部炎癥反應(yīng)指標(biāo)對比 與空白組相比，模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各指標(biāo)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，上調(diào)組各指標(biāo)水平明顯升高，下調(diào)組各指標(biāo)水平明顯降低(P<0.05)；與上調(diào)組相比，下調(diào)組各指標(biāo)水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4各組腎臟組織學(xué)觀察 空白組腎組織結(jié)構(gòu)正常，無病變；模型組腎組織可見有細(xì)胞水腫、炎性浸潤、腎小管閉塞、腎小球皺縮表現(xiàn)；上調(diào)組腎組織可見有較模型組更為嚴(yán)重的細(xì)胞水腫、大量的炎性浸潤、腎小管閉塞、腎小球皺縮表現(xiàn)；下調(diào)組腎組織可見細(xì)胞水腫、炎性浸潤現(xiàn)象改善，腎小管、腎小球病變緩解。見圖1。

2.5各組腎臟氧化應(yīng)激程度對比 與空白組相比，模型組、上調(diào)組、下調(diào)組SOD活性明顯降低，MDA水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，上調(diào)組SOD活性明顯降低，MDA水平明顯升高，下調(diào)組SOD活性明顯升高，MDA水平明顯降低(P<0.05)；與上調(diào)組相比，下調(diào)組SOD活性明顯升高，MDA水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.6各組腎組織ERK信號通路蛋白表達(dá)對比 與空白組相比，模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，上調(diào)組各蛋白表達(dá)明顯升高，下調(diào)組各蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與上調(diào)組相比，下調(diào)組各蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表1 各組腎功能、腎損傷及局部炎癥反應(yīng)指標(biāo)對比

圖1 各組腎臟組織學(xué)觀察(HE染色，×200)

表2 各組腎臟氧化應(yīng)激程度及腎組織ERK信號通路蛋白表達(dá)對比

圖2 各組腎組織ERK信號通路蛋白表達(dá)

3 討 論

在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中機(jī)體存在不同程度的炎癥反應(yīng)，隨著疾病的不斷進(jìn)展，可導(dǎo)致多個器官出現(xiàn)急性功能性損傷，急性腎損傷在膿毒癥中較為常見，其可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，加重或者誘發(fā)其他器官損傷，嚴(yán)重威脅著患者的生命安全〔4～6〕。

目前臨床上隨著對膿毒癥并發(fā)急性腎損傷的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，該病的發(fā)生受多種因素的共同影響，微小RNA(miRNA)屬于一類長度大約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其參與多種生理病理過程〔7～9〕。miR-10a屬于miRNA家族成員之一，其定位于7號染色體上，研究發(fā)現(xiàn)，miR-10a參與多種惡性疾病的發(fā)生，miR-10a參與膿毒癥的免疫應(yīng)答和局部炎癥反應(yīng)，當(dāng)炎癥誘發(fā)腎臟損傷后可經(jīng)基因調(diào)控作用和介導(dǎo)促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)參與炎癥損傷，表現(xiàn)為其表達(dá)異常升高〔10～12〕。陳隆望等〔13〕研究認(rèn)為，經(jīng)調(diào)控miR-10a的表達(dá)可改善膿毒癥小鼠脾臟CD4+CD25+Treg免疫功能。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)下調(diào)miR-10a后，膿毒癥并發(fā)急性腎損傷大鼠的腎臟損傷明顯被修復(fù)，表現(xiàn)為腎臟局部炎癥、氧化應(yīng)激被抑制，分析其原因可能與miR-10a被抑制后其所誘發(fā)的局部炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激被抑制而發(fā)揮抑制腎臟進(jìn)一步損傷，促進(jìn)腎功能恢復(fù)相關(guān)。

ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一個亞組，其在臨床上被證實(shí)可受多種細(xì)胞因子和生長因子的激活〔14,15〕。ERK信號通路可介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)，可被氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子等所激活，促使炎性細(xì)胞因子過量表達(dá)，誘發(fā)組織損傷〔16,17〕。研究顯示，ERK信號通路參與腎臟損傷過程，如在糖尿病腎病中其被激活，可介導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增生肥大，進(jìn)一步加劇腎臟損傷〔18,19〕。另外有報道稱，在腎臟調(diào)控和損傷過程中，腎臟可經(jīng)調(diào)控某些miRNA的表達(dá)對一些關(guān)鍵的信號通路發(fā)揮作用，參與細(xì)胞增殖、凋亡，最終介導(dǎo)腎臟損傷〔20,21〕。本研究進(jìn)一步分析下調(diào)miR-10a修復(fù)膿毒癥并發(fā)急性腎損傷大鼠的腎臟損傷的作用機(jī)制，提示下調(diào)miR-10a可能經(jīng)促進(jìn)ERK信號通路失活發(fā)揮腎臟損傷修復(fù)作用。但目前臨床研究并未有報道稱miR-10a、ERK信號通路與膿毒癥并發(fā)急性腎損傷的關(guān)系，因此本文上述研究結(jié)果還需后續(xù)研究進(jìn)一步分析證實(shí)。

綜上，下調(diào)miR-10a可明顯抑制膿毒癥并發(fā)急性腎損傷腎臟氧化應(yīng)激程度，抑制局部炎癥，修復(fù)腎損傷，其作用機(jī)制可能與促使ERK信號通路失活相關(guān)。