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        基于可培養(yǎng)技術(shù)的中國(guó)家用洗衣機(jī)中真菌多樣性研究

        2023-02-04 15:48:33曹運(yùn)奕張晶晶高源陳劍康佳麗姚粟
        中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化 2023年5期

        曹運(yùn)奕 張晶晶 高源 陳劍 康佳麗 姚粟

        摘 要:本文通過(guò)可培養(yǎng)方法分析中國(guó)家用洗衣機(jī)中的真菌多樣性,采用不同培養(yǎng)基對(duì)洗衣機(jī)不同位置的真菌進(jìn)行分離,通過(guò)序列分析進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明從14臺(tái)洗衣機(jī)的57個(gè)樣品中共分離獲得真菌253株,涵蓋36個(gè)屬。洗衣機(jī)中優(yōu)勢(shì)真菌主要有青霉屬(Penicillium)、枝孢菌屬(Cladosporium)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、紫霉屬(Purpureocillium)等。研究結(jié)果為洗衣機(jī)中具有致味、致污、致病和抗逆功能的特征微生物的定向篩選、抗菌抑菌試驗(yàn)的開(kāi)展以及作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞:洗衣機(jī),真菌多樣性,可培養(yǎng)方法

        DOI編碼:10.3969/j.issn.1002-5944.2023.05.037

        0 引 言

        洗衣機(jī)是現(xiàn)代家庭必不可少的家用電器,保有量逐年增加[1]。在全球倡導(dǎo)“健康環(huán)?!贝蟊尘跋?,疊加新冠疫情影響,消費(fèi)者健康需求不斷升級(jí),“健康洗護(hù)”功能開(kāi)發(fā)成為行業(yè)提速發(fā)展的主賽道[2-4]。由于洗衣機(jī)存在內(nèi)環(huán)境潮濕、內(nèi)筒和外筒夾層存在大量污垢、消毒管理頻率低等問(wèn)題,造成洗衣機(jī)內(nèi)部微生物的大量滋生,引起衣物的二次污染,甚至成為致病微生物傳播的載體,進(jìn)而增加人們感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5-7]。圍繞洗衣機(jī)長(zhǎng)時(shí)間使用存在的潛在微生物污染問(wèn)題,全面開(kāi)展家用洗衣機(jī)微生物群落狀況調(diào)研,將為推動(dòng)洗衣機(jī)抗除菌技術(shù)實(shí)現(xiàn)專(zhuān)業(yè)化、細(xì)分化升級(jí),構(gòu)建科學(xué)、健康的洗護(hù)生態(tài)環(huán)境奠定基礎(chǔ)[8,9]。

        目前,平板培養(yǎng)法仍然是研究洗衣機(jī)內(nèi)微生物的主要方法。Jacksch等人[10]采集了洗衣機(jī)洗滌劑抽屜和門(mén)封圈樣品,發(fā)現(xiàn)洗衣機(jī)內(nèi)平均生物量為2.1±1.0×104 CFU/cm2,門(mén)封圈頂部的生物量為11.1±9.2×101 CFU/cm2。Gattlen等人研究表明,以培養(yǎng)法分離出的真菌達(dá)上百種,包括近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis),曲霉屬(Aspergillus),枝孢菌屬(Cladosporium),膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)等[11,12]。李炎等人[13]研究發(fā)現(xiàn)115份洗衣機(jī)洗滌水水樣中真菌菌落總數(shù)平均為2.3×102CFU/mL。Tischner Z等[14]人對(duì)來(lái)自匈牙利的61臺(tái)洗衣機(jī)的門(mén)封圈、料盒(洗衣粉、柔順劑)開(kāi)展真菌的分離研究,共分離得到71株真菌,其中32株屬于酵母菌,39株屬于絲狀真菌,枝孢霉屬(Cladosporium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉菌屬(Penicillium)、紅酵母屬(Rhodotorula)均為優(yōu)勢(shì)分離菌屬。綜上所述,洗衣機(jī)內(nèi)部存在潛在的微生物污染風(fēng)險(xiǎn),但是目前我國(guó)在這方面的研究鮮有報(bào)道。

        因此,本研究基于可培養(yǎng)技術(shù)系統(tǒng)開(kāi)展了我國(guó)家用洗衣機(jī)真菌多樣性分析,旨在探究洗衣機(jī)內(nèi)部不同位點(diǎn)的可培養(yǎng)真菌多樣性,分離一批優(yōu)勢(shì)的真菌微生物菌株,為后期定向篩選洗衣機(jī)中具有致味、致污、致病和抗逆功能的特征微生物資源奠定基礎(chǔ),為洗衣機(jī)抗菌、抑菌試驗(yàn)的開(kāi)展以及抗菌材料的開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        生物安全柜(ESCO AC2-6S1 CLASS II TYPEA 2);隔水式培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);高速冷凍離心機(jī)(5424 R),德國(guó)Eppendorf 公司;PCR儀(TRIO48),德國(guó)Biometra公司;微量核酸蛋白分析儀(BioDrop-μLite),英國(guó)Biochrom有限公司;電泳儀(EC250-90),美國(guó)BIO-RAD公司;恒溫培養(yǎng)箱(GHP-9160),上海一恒科學(xué)儀器有限公司;測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

        1.2 材料

        麥芽提取粉瓊脂(MEA),馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;氯硝胺甘油瓊脂培養(yǎng)基(DG-18),購(gòu)自海博科技有限公司;真菌DNA提取試劑盒,磁珠組織DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek公司;PCR MasterMix,DL2000 Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品采集

        本研究收集了來(lái)自北京、廣州、青島、無(wú)錫地區(qū)共14臺(tái)在使用期的波輪和滾筒洗衣機(jī)作為研究對(duì)象,詳細(xì)信息見(jiàn)表1。每臺(tái)洗衣機(jī)設(shè)置5個(gè)采樣位點(diǎn),包括洗衣機(jī)的門(mén)封圈、料盒、內(nèi)筒外壁、外筒內(nèi)壁和下水口,共采集57份樣品。參考GB/T 18204.4-2013《公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第4部分:公共用品用具微生物》[15]對(duì)洗衣機(jī)的待采樣部位進(jìn)行了采樣:使用無(wú)菌干燥棉拭子,于5mL滅菌生理鹽水內(nèi)浸潤(rùn),在洗衣機(jī)的待采樣部位均勻涂抹進(jìn)行樣品的采集,用滅菌剪刀剪去棉簽手接觸部位,將棉拭子放入剩余的生理鹽水內(nèi),制備成待檢樣品。

        1.3.2 樣品中可培養(yǎng)真菌的分離純化

        洗衣機(jī)采集的樣品以10倍梯度逐級(jí)稀釋?zhuān)频?∶10和1∶100的樣品懸液,分別吸取100μL原液和稀釋液涂布于PDA、MEA、DG18培養(yǎng)基上,每種培養(yǎng)基涂布兩個(gè)平板,分別放置于28℃和20℃,好氧培養(yǎng)3-10d。選取培養(yǎng)基上形態(tài)特征不同的菌落進(jìn)行純化和計(jì)數(shù)。

        1.3.3 樣品中可培養(yǎng)真菌的菌種鑒定

        利用真菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的DNA,再利用核糖體翻譯間隔序列(ITS)、核糖體rDNA大亞基(26S D1/D2)[16]等分子標(biāo)記引物對(duì)絲狀真菌和酵母菌的核酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:2×PCR MasterMix 21μL,10μmol/L上、下游引物各1μL,DNA 30ng,ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件:95℃ 5min;95℃ 30s,55℃ 45s,72℃45s,共27個(gè)循環(huán);72℃ 10min[17 ]。擴(kuò)增后獲得約600bp的DNA片段,并進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,用菌株的26S rDNA和ITS基因作為靶序列,在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST程序搜索同源序列,挑選與靶序列最相近的參考菌株系列,以97%序列相似性為判定標(biāo)準(zhǔn)完成菌種鑒定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同采樣位置真菌分離結(jié)果分析

        從14臺(tái)洗衣機(jī)的不同采樣位置共分離得到253株真菌,其中,下水口分離到的菌株數(shù)量最多,分離到63株真菌;內(nèi)筒外壁和外筒內(nèi)壁次之,分別分離到61株和55株真菌;料盒和密封圈分別分離到42株和32株。洗衣機(jī)不同采樣位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)真菌詳見(jiàn)表2。在優(yōu)勢(shì)真菌中,木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)菌株易形成生物被膜,赭霉屬(Ochroconis)菌株可從人體呼吸道、表皮組織中分離出,對(duì)人類(lèi)健康具有潛在影響;枝孢菌屬(Cladosporium)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)的部分菌株具有致病性;內(nèi)筒外壁和外筒內(nèi)壁不易清潔,在清洗過(guò)程中微生物可能間接污染衣物,需要重點(diǎn)防控相關(guān)致病菌的產(chǎn)生;洗衣機(jī)的料盒主要是洗滌劑存放處,若污染真菌,會(huì)隨洗衣液污染衣物。

        在洗衣機(jī)的5個(gè)采樣位點(diǎn)中,洗衣機(jī)不同采樣位置有6個(gè)共有菌屬(詳見(jiàn)圖1),分別為青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、枝孢菌屬 (Cladosporium)、木霉屬(Trichoderma)、紫霉屬(Purpureocillium),說(shuō)明這幾類(lèi)真菌在洗衣機(jī)不同位點(diǎn)中廣泛分布,是洗衣機(jī)真菌污染重點(diǎn)關(guān)注的菌種。洗衣機(jī)不同位點(diǎn)分布的真菌具有一定的差異性,洗衣機(jī)下水口、內(nèi)筒外壁和外筒內(nèi)壁分離到的特有菌屬較多,推測(cè)可能由于內(nèi)筒外壁和外筒內(nèi)壁與下水口直接接觸衣物和污水,且潮濕不易清潔,因而菌株多樣性豐富。

        2.2 不同地理位置真菌分離結(jié)果分析

        通過(guò)對(duì)不同城市分離菌株的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),無(wú)錫地區(qū)分離到的菌株數(shù)量最多,總共分離到82株;北京次之,分離到70株;青島和廣州分別分離到53株和48株。洗衣機(jī)不同地理位置優(yōu)勢(shì)真菌詳見(jiàn)表3。洗衣機(jī)不同地理位置有3個(gè)共有菌屬,詳見(jiàn)圖2,分別為青霉屬(Penicillium)木霉屬(Trichoderma)、紫霉屬(Purpureocillium)。這三個(gè)屬的菌株在洗衣機(jī)不同位點(diǎn)中也均有分布,表明這三類(lèi)菌在洗衣機(jī)中易傳播,且環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng),可在后續(xù)研究中重點(diǎn)關(guān)注。

        為進(jìn)一步研究不同地域?qū)ο匆聶C(jī)中微生物多樣性的影響,將北京和青島作為北方代表城市,無(wú)錫地區(qū)和廣州作為南方代表城市進(jìn)行分析。北方總共分離到12 3株,南方總共分離到13 0株。北方樣品分離頻次前五的菌種分別為青霉屬(Penicillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、紫霉屬(Purpureocillium)和赭霉屬(Ochroconis),北方地區(qū)中青島滾筒分離到的菌株數(shù)最多;南方樣品分離頻次前五的菌種分別為青霉屬(Penicillium)、紫霉屬(Purpureocillium)、枝孢菌屬(Cladosporium)、曲霉屬(Aspergillus)和木霉屬(Trichoderma),南方地區(qū)廣州滾筒分離到的菌株數(shù)最多。綜上所述,青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、紫霉屬(Purpureocillium)、枝孢菌屬(Cladosporium)為不同地域洗衣機(jī)中的共同優(yōu)勢(shì)菌,其中青霉屬(Penicillium)是兩個(gè)地域分離頻次均最高的菌屬。

        2.3 洗衣機(jī)中優(yōu)勢(shì)真菌的特性分析

        基于可培養(yǎng)技術(shù)分離篩選洗衣機(jī)中特征性微生物,結(jié)合不同地域、不同采樣位置中微生物的分布以及生物學(xué)特性,分析造成洗衣機(jī)使用過(guò)程中異味、生物膜等問(wèn)題的關(guān)鍵微生物,篩選出的關(guān)鍵真菌微生物類(lèi)群主要為青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢菌屬(Cladosporium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、紫霉屬(Purpureocillium)、假絲酵母屬(Candida)和赭霉屬(Ochroconis)等。其中,枝孢霉屬(Cladosporium)、假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、赭霉屬(Ochroconis)均為多篇文獻(xiàn)通過(guò)可培養(yǎng)分離得到的菌株,木霉屬(Trichoderma)和紫霉屬(Purpureocillium)、黑酵母屬(Aureobasidium)、毛殼菌屬(Chaetomium)等為本研究從洗衣機(jī)中分離到的特有菌株。

        青霉屬(Penicillium)在腐爛的水果、蔬菜、肉類(lèi)和各種潮濕的有機(jī)物上常見(jiàn)[18,19],洗衣機(jī)中環(huán)境較為潮濕,容易滋生青霉。該屬部分種可引起角膜、皮膚、外耳、呼吸道、泌尿系統(tǒng)感染,以及人工瓣膜植入后發(fā)生的心內(nèi)膜炎。已有文章報(bào)道,青霉在嚴(yán)重免疫功能低下患者中引起播散性疾病,許多菌株產(chǎn)生真菌毒素[20]。曲霉屬(Aspergillus)在自然界分布廣泛,可分離自空氣、土壤、腐敗食物和臨床呼吸道組織,37℃生長(zhǎng),可侵害家禽、家畜甚至人體內(nèi)臟特別是呼吸道器官,菌絲體發(fā)達(dá)可形成生物膜[21]。枝孢菌屬(Cladosporium)也是非培養(yǎng)結(jié)果中分離到的關(guān)鍵菌種,可形成生物膜,部分種可引起角膜炎,可廣泛引起哮喘病人或有類(lèi)似呼吸系統(tǒng)疾病患者的過(guò)敏反應(yīng)[22]。鐮刀菌屬(Fusarium)中有些種可產(chǎn)生玉米赤酶烯酮、T-2毒素、嘔吐毒素等對(duì)人和動(dòng)物有強(qiáng)烈毒性的真菌毒素,可引起人體心血管、食管癌、角膜潰瘍等疾病,污染糧食、蔬菜和飼料,人畜誤食會(huì)中毒,鐮刀菌菌絲體發(fā)達(dá)可形成生物膜,具有致污特性[23]。紫霉屬(Purpureocillium)在不同位點(diǎn)和不同地域均有被分離到,菌株生長(zhǎng)速度較快,能快速產(chǎn)生孢子,廣泛存在于土壤和空氣中,可導(dǎo)致皮膚感染[24]。假絲酵母屬(Candida)可形成生物膜,導(dǎo)致菌血癥,可感染免疫力低下的病人和其他動(dòng)物[25],導(dǎo)致鵝口瘡癥。赭霉屬(Ochroconis)也是非培養(yǎng)結(jié)果中分離到的關(guān)鍵菌種,可能導(dǎo)致真菌病[26]。

        3 結(jié) 論

        本研究選取14臺(tái)洗衣機(jī),通過(guò)可培養(yǎng)方法共分離獲得真菌253株,涵蓋36個(gè)屬,97個(gè)種。洗衣機(jī)中的優(yōu)勢(shì)真菌主要有青霉屬(Penicillium)、枝孢菌屬(Cladosporium)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、紫霉屬(Purpureocillium)等。分離到的優(yōu)勢(shì)菌屬中,青霉屬(Penicillium)、枝孢菌屬(Cladosporium)、紫霉屬(Purpureocillium)和曲霉屬(Aspergillus)在自然界分布極廣。青霉屬(Penicillium)和曲霉屬(Aspergillus)是引起多種物質(zhì)霉腐的主要微生物。青霉屬(Penicillium)、枝孢菌屬(Cladosporium)、曲霉屬(Aspergillus),這三個(gè)屬的菌株在洗衣機(jī)中易傳播,且環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng),可作為洗衣機(jī)中重點(diǎn)關(guān)注菌屬。紫霉屬(Purpureocillium)和木霉屬(Trichoderma)在不同位點(diǎn)和不同地域均有被分離到,這兩類(lèi)菌株生長(zhǎng)速度較快,且能快速產(chǎn)生孢子,易傳播,屬于臨床常見(jiàn)報(bào)道的風(fēng)險(xiǎn)菌種,后續(xù)需進(jìn)一步跟蹤研究。按照洗衣機(jī)的不同采樣位置和不同地理位置,對(duì)洗衣機(jī)中分離真菌的多樣性進(jìn)行了分析。洗衣機(jī)不同采樣位置的材質(zhì)和結(jié)構(gòu)不同,真菌種類(lèi)具有一定的特異性,下水口和內(nèi)筒外壁相較于其他位置分離到的真菌株數(shù)較多;南方城市的洗衣機(jī)分離到的真菌數(shù)量多于北方城市。針對(duì)洗衣機(jī)的真菌污染情況應(yīng)加強(qiáng)關(guān)注,一方面研究新型抗菌材料,減少洗衣機(jī)中微生物的附著和增殖;另一方面應(yīng)建立良好的使用習(xí)慣,定期對(duì)洗衣機(jī)清潔消毒,以減少微生物污染。研究結(jié)果為洗衣機(jī)中具有致味、致污、致病和抗逆功能的特征微生物的定向篩選、抗菌抑菌試驗(yàn)的開(kāi)展、關(guān)鍵特征微生物的作用機(jī)制的研究以及抗菌材料的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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        作者簡(jiǎn)介

        曹運(yùn)奕,博士,工程師,研究方向?yàn)榧译娢⑸铩?/p>

        姚粟,通信作者,博士,教授級(jí)高級(jí)工程師,研究方向?yàn)楣I(yè)微生物。

        (責(zé)任編輯:張佩玉)

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