趙海東，喻閩鳳，解換弟，陳立紅

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518000）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是多種炎癥細胞和細胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，多由于接觸變應(yīng)原后產(chǎn)生氣道高反應(yīng)，引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶、咳嗽等癥狀，是威脅公共健康最常見的慢性肺部疾病，兒童哮喘以男孩多發(fā)，存在遺傳的可能[1]。吸入糖皮質(zhì)激素（ICS）是目前作用靶點最廣、效應(yīng)最強的哮喘治療藥物，不僅作為首選長期控制藥物，也是使用速效支氣管舒張劑緩解哮喘癥狀時的聯(lián)合用藥[2]。但由于哮喘病程長及ICS依從性差、吸入方法錯誤等原因，常導(dǎo)致兒童哮喘控制不佳，尤其是3～5歲年齡階段的患兒[3]。穴位貼敷是中醫(yī)常用的外治法之一，因其療效良好、經(jīng)濟方便、不良反應(yīng)小，被家屬及患兒廣泛接受。課題組前期臨床研究顯示，引痰方貼敷涌泉穴治療在改善哮喘患兒呼吸頻率、減輕臨床癥狀及體征、促進胸部X射線吸收等方面的療效顯著[4]；但其具體作用機制尚不明確。因此，本研究以卵清蛋白（OVA）哮喘小鼠為研究對象，進一步觀察引痰方穴位貼敷雙側(cè)涌泉穴對哮喘小鼠氣道炎癥的影響，探討其作用機制，以期為臨床應(yīng)用引痰方穴位貼敷雙側(cè)涌泉穴治療哮喘提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物70只SPF級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由珠海百試通生物科技有限公司提供，動物使用許可證號：SYXK（粵）2018-0014，實驗動物質(zhì)量合格證號：44822700003780。設(shè)施合格證號：00281725。動物實驗方案已通過深圳市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準。

1.2 藥物、試劑與儀器引痰方（外用，由明礬、皂莢、牽牛子按質(zhì)量分數(shù)1∶1∶1比例磨粉后姜汁調(diào)和而成），由深圳市中醫(yī)院提供，批號：20210720，規(guī)格：1 kg/袋；吸入用布地奈德混懸液（AstraZeneca Pty Ltd.，規(guī)格：2 mL∶1 mg，批號：327314）；凡士林（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：J0603A）；卵清蛋白（美國Sigma公司，批號：SLCB8249）；氫氧化鋁佐劑（美國賽默飛世爾科技有限公司，批號：WF322465）；烏拉坦（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z10O11Y126927）。小鼠白細胞介素（IL）-17、IL-11、IL-13，小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司）。酶標儀（美國賽默飛世爾科技有限公司，型號：Multiskan FC）；多功能誘咳引喘儀（深圳市長庚醫(yī)用物資有限公司廣州分公司，型號：YLS-8A）。

1.3 造模方法[5-8]致敏液制備：將20 mg OVA加入1 mL生理鹽水，充分溶解后，取0.4 mL加入9.6 mL生理鹽水，混勻，取與該液體等體積的氫氧化鋁佐劑混合，搖勻30 min后使用。激發(fā)液制備：500 mg OVA加入10 mL的生理鹽水中，充分溶解后使用。哮喘模型構(gòu)建：第0、7、14天給予小鼠腹腔注射致敏液0.2 mL/只，第24～26天以激發(fā)液10 mL霧化吸入，40 min/d。若小鼠出現(xiàn)張口喘息、腹部翕動、易激惹、煩躁不安，且出現(xiàn)噴嚏頻頻，飲水增多，表明造模成功。正常對照小鼠在第0、7、14天給予0.2 mL生理鹽水代替致敏液，第24～26天給予生理鹽水10 mL霧化吸入，40 min/d。

1.4 分組與干預(yù)將70只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，選取12只作為正常對照組，飼喂普通飼料；其余58只設(shè)為造模組，飼喂普通飼料，同時構(gòu)建哮喘模型。將造模成功的48只小鼠隨機分為模型對照組、凡士林穴位貼敷組、引痰方穴位貼敷組和布地奈德霧化組，每組12只。穴位選擇：根據(jù)華興邦等[9]研制的大鼠穴位圖譜，涌泉穴位于后肢掌心前正中。引痰方穴位貼敷組：用膠布固定引痰方貼劑外用于雙側(cè)涌泉穴，每日1次，每次6 h，連續(xù)治療2周。凡士林穴位貼敷組：用膠布固定凡士林貼劑外用于雙側(cè)涌泉穴，每日1次，每次6 h，連續(xù)治療2周。布地奈德霧化組：給予布地奈德霧化治療，每次0.5 mg，每次霧化10 min，每日上午、下午各1次，連續(xù)治療2周。正常對照組和模型對照組：給予無菌注射用水霧化治療，每次2 mL，每次霧化10 min，每日上午、下午各1次，連續(xù)霧化2周。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 支氣管肺泡灌洗液（BALF）炎癥細胞計數(shù)給藥結(jié)束后，結(jié)扎小鼠一側(cè)肺組織，另一側(cè)進行灌洗，得到支氣管肺泡灌洗液，顯微鏡下進行炎癥細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)，并計算嗜酸性粒細胞占比。

1.5.2 ELISA法檢測肺組織勻漿液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量取肺組織（約45 mg）加入300 μL RIPA裂解液（其中含有1 mmol/L的PMSP和1×蛋白酶抑制劑PhosSTOP）充分勻漿，按照IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α的ELISA試劑盒說明書操作。

1.5.3 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察肺組織病理學(xué)變化取右肺組織置于4%甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片和HE染色，顯微鏡下觀察其病理變化。

1.5.4 氣道及其周圍炎癥評分根據(jù)既往文獻研究[10-11]，針對氣道及其周圍炎癥細胞浸潤情況進行評分。具體評分細則見表1。

表1 炎癥評分標準Table 1 Inflammation scoring criteria

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠生物行為變化比較在整個實驗過程中：正常對照組小鼠活動正常，毛發(fā)色澤光亮，體質(zhì)量逐漸增加；模型對照組及各治療組哮喘小鼠飲食少，毛色灰暗，發(fā)育遲緩。

在霧化激發(fā)過程中，前期觀察到模型對照組及各治療組哮喘小鼠出現(xiàn)抓鼻、躁動不安，呼吸急速深快，后期活動減少、嘴唇紫紺、聚集成堆、大便增多等異常癥狀，而正常對照組小鼠無上述異常癥狀，說明哮喘造模成功。

藥物干預(yù)后，引痰方穴位貼敷組和布地奈德霧化組哮喘小鼠活動增加，哮喘行為變化減輕。

2.2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞水平比較表2結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型對照組和凡士林穴位貼敷組小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)明顯增加，嗜酸性粒細胞數(shù)量及占比明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型對照組比較，引痰方穴位貼敷組和布地奈德霧化組小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)量及占比顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；引痰方穴位貼敷組小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)量及占比與布地奈德霧化組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)量及占比比較Table 2 Comparison of the total number of inflammatory cells and the number and proportion of eosinophils in the bronchoalveolar lavage fluid among various groups of mice （±s）

表2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)量及占比比較Table 2 Comparison of the total number of inflammatory cells and the number and proportion of eosinophils in the bronchoalveolar lavage fluid among various groups of mice （±s）

注：①P＜0.01，與正常對照組比較；②P＜0.01，與模型對照組比較

組別正常對照組模型對照組凡士林穴位貼敷組引痰方穴位貼敷組布地奈德霧化組鼠數(shù)/只6 6 6 6 6炎癥細胞總數(shù)/（×104個·mL-1）18.67±3.01 71.83±4.79①73.83±7.78①27.50±3.94②18.83±4.12②嗜酸性粒細胞數(shù)量/（×104個·mL-1）0.28±0.36 45.26±7.42①48.92±9.13①5.70±2.63②2.60±1.96②嗜酸性粒細胞占比/%0.01±0.02 0.63±0.09①0.66±0.08①0.20±0.06②0.13±0.07②

2.3 各組小鼠肺組織勻漿液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量比較表3結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型對照組和凡士林穴位貼敷組小鼠肺組織勻漿液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型對照組和凡士林穴位貼敷組比較，引痰方穴位貼敷組和布地奈德霧化組小鼠肺組織勻漿液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；引痰方穴位貼敷組IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量與布地奈德霧化組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠肺組織勻漿液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量比較Table 3 Comparison of IL-17，IL-11，IL-13 and TNF-α levels in lung tissue homogenate among various groups of mice （±s，pg·mL-1）

表3 各組小鼠肺組織勻漿液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量比較Table 3 Comparison of IL-17，IL-11，IL-13 and TNF-α levels in lung tissue homogenate among various groups of mice （±s，pg·mL-1）

注：①P＜0.01，與正常對照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對照組比較

組別正常對照組模型對照組凡士林穴位貼敷組引痰方穴位貼敷組布地奈德霧化組鼠數(shù)/只6 6 6 6 6 IL-17 37.49±1.34 41.88±2.57①41.59±1.34①38.49±1.51③37.97±1.20③IL-11 75.66±4.19 83.74±4.63①83.61±3.88①77.24±2.99②76.04±5.83③IL-13 50.85±1.71 58.04±2.80①57.71±2.61①54.34±1.57③55.41±2.02②TNF-α 453.07±10.21 491.01±27.36①491.29±14.00①459.40±44.48②457.96±9.02②

2.4 各組小鼠氣道及其周圍的炎癥評分比較表4結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型對照組和凡士林穴位貼敷組小鼠氣道及其周圍的炎癥評分增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；引痰方穴位貼敷組和布地奈德霧化組小鼠氣道及其周圍的炎癥評分較模型對照組和凡士林穴位貼敷組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；引痰方穴位貼敷組炎癥評分與布地奈德霧化組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組小鼠氣道及其周圍的炎癥評分比較Table 4 Comparison of inflammation scores in and around the airways among various groups of mice（±s，分）

表4 各組小鼠氣道及其周圍的炎癥評分比較Table 4 Comparison of inflammation scores in and around the airways among various groups of mice（±s，分）

注：①P＜0.01，與正常對照組比較；②P＜0.01，與模型對照組比較

組別正常對照組模型對照組凡士林穴位貼敷組引痰方穴位貼敷組布地奈德組鼠數(shù)/只6 6 6 6 6炎癥評分0.67±0.52 3.17±0.75①3.50±0.55①2.50±0.55②2.17±0.75②

2.5 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化比較圖1結(jié)果顯示：正常對照組小鼠氣道壁厚度正常，可見散在炎癥細胞、管腔無狹窄。與正常對照組比較，模型對照組和凡士林穴位貼敷組哮喘模型小鼠肺組織可見支氣管上皮細胞腫脹、部分脫落，基底膜增生、變厚，可見大量炎癥細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞為主。引痰方穴位貼敷組和布地奈德霧化組肺組織損傷較模型對照組和凡士林穴位貼敷組明顯減輕。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化比較（HE染色）Figure 1 Comparison of histopathological changes in the lung tissue among various groups of mice（HE staining）

3 討論

哮喘歸屬于中醫(yī)學(xué)“哮證”“喘證”的范疇。哮喘最早記載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》。《癥因脈治·哮病》云：“哮病之因痰飲留伏，結(jié)成窠臼。”強調(diào)了痰邪對哮喘的影響?！蹲C治匯補·哮病》中所述：“哮即痰喘之久而常發(fā)者，因內(nèi)有壅塞之氣，外有非時之感，膈有膠固之痰，三者相合，閉拒氣道，搏擊有聲，發(fā)為哮病。”強調(diào)了氣機不暢、外感時邪、痰阻氣道是哮喘發(fā)病的主要病機[12]。引痰方源自清代陳復(fù)正《幼幼集成》，由明礬、皂莢、牽牛子組成，1∶1∶1等分研成細末，姜汁調(diào)和，貼敷涌泉穴。方中：明礬能祛除風(fēng)痰；皂莢辛溫通利氣道，咸能軟化膠結(jié)之痰；牽牛子能瀉肺氣，逐痰飲。三藥合用共奏祛痰之效。涌泉穴為足少陰腎經(jīng)之根，足少陰腎經(jīng)起始之井穴，是足少陰腎經(jīng)經(jīng)氣所出之處，既可交通陰陽，又能絡(luò)脾入肺，使藥力循經(jīng)，直達腎脾肺，調(diào)其功能，補其虛損，達到陰陽平衡的狀態(tài)[4]。故明礬、皂莢、牽牛子外敷足少陰腎經(jīng)之涌泉穴具有祛痰平喘、納氣歸元之功。

氣道炎癥是哮喘的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，多種炎癥細胞聚集，釋放炎癥介質(zhì)引起氣道重塑以及免疫反應(yīng)是本病發(fā)生的主要原因。有研究[13-18]表明，IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α被活化后能夠激活上皮細胞、巨噬細胞等釋放粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和相關(guān)細胞因子，引起氣道內(nèi)炎癥細胞聚集，進一步促進氣道炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型對照組和凡士林穴位貼敷組小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎癥細胞總數(shù)明顯增加，嗜酸性粒細胞數(shù)量明顯增多，肺組織勻漿液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量顯著升高，肺組織可見支氣管上皮細胞腫脹、部分脫落，基底膜增生、變厚，可見大量炎癥細胞浸潤，其中以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞為主。表明小鼠哮喘發(fā)作時大量炎癥細胞參與，氣道炎癥明顯。引痰方干預(yù)后OVA哮喘小鼠BALF中炎癥細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)量顯著下降，肺組織勻漿液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量顯著下降，表明引痰方貼敷雙側(cè)涌泉穴可通過減少炎癥細胞浸潤、抑制炎癥因子水平，減輕炎癥反應(yīng)及氣道重塑，達到治療哮喘的效果，且治療效果與布地奈德霧化療效相當。

綜上所述，引痰方穴位貼敷涌泉穴能夠抑制OVA哮喘小鼠氣道炎癥因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)，控制哮喘發(fā)作，療效與布地奈德霧化相當。