張江濤 吳向華 王昌利 張瀚文 阮暉朝 符小兵 楊榮乾

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，南寧 530021）

乳腺癌是一種女性高發(fā)實(shí)體惡性腫瘤。最新數(shù)據(jù)顯示，目前乳腺癌已超越肺癌，成為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，同時也是導(dǎo)致女性死亡的首要原因［1］。部分早期乳腺癌患者受益于手術(shù)、化療和放療技術(shù)成熟，但晚期乳腺癌具有高轉(zhuǎn)移性、惡病質(zhì)等特點(diǎn)，目前治療手段無法顯著降低患者病死率。隨著對乳腺癌發(fā)生分子機(jī)制的深入研究，多種針對抗癌位點(diǎn)的特異性靶向藥物已用于乳腺癌臨床治療，且明顯提高了乳腺癌治療效果［2］。因此，尋找乳腺癌早期和預(yù)后標(biāo)志物刻不容緩。

趨化因子是一種小細(xì)胞因子或信號蛋白，可定向趨化免疫細(xì)胞募集至感染部位，根據(jù)N端半胱氨酸的排列方式可分為4個亞族：CC趨化因子亞族、CXC趨化因子亞族、XC趨化因子亞族和CX3C趨化因子亞族。作為CC趨化因子亞族成員之一，CCL23（C-C motif chemokine ligand 23）位于染色體17q12區(qū)，目前相關(guān)研究主要集中于腦部病變和炎癥性疾病等［3-5］。在腫瘤領(lǐng)域，CCL23/CCR1/AKT/ESR1軸可抑制肝癌細(xì)胞增殖［6］；國內(nèi)學(xué)者也發(fā)現(xiàn)CCL23在肝癌組織顯著下調(diào)且影響患者預(yù)后［7-8］。414例胃癌患者血清免疫應(yīng)答蛋白研究發(fā)現(xiàn)，CCL23和MMP1與癌癥風(fēng)險降低相關(guān)［9］。一項(xiàng)隊(duì)列研究也表明，高表達(dá)CCL23的食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后良好［10］。另一項(xiàng)研究證明CCL23可作為預(yù)測乳腺癌患者阿霉素用藥后心臟毒性的生物標(biāo)志物［11］。提示CCL23在癌癥發(fā)展中扮演重要角色，但CCL23如何參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的報道較少。

本研究基于多種在線分析工具，包括GEPIA2.0、TIMER、PrognoScan和Oncomine驗(yàn)證CCL23 mRNA在乳腺癌及正常組織的表達(dá)差異和預(yù)后價值，LinkedOmics和GeneMANIA數(shù)據(jù)庫用于可視化CCL23在乳腺癌組織中共表達(dá)基因富集的生物學(xué)行為和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，TIMER數(shù)據(jù)庫闡明CCL23在乳腺癌組織中與免疫微環(huán)境的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 4個在線工具分析人乳腺癌組織CCL23轉(zhuǎn)錄水平差異GEPIA2.0數(shù)據(jù)庫（http://gepia2.cancerpku.cn/#index）是北京大學(xué)創(chuàng)立的一個交互式網(wǎng)站，包含TCGA和GTEx上千例腫瘤和正常樣品RNAseq數(shù)據(jù)［12］。選擇“Box Plot”構(gòu)建箱線圖。TIMER數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）是一個基于TCGA資源開發(fā)的免疫數(shù)據(jù)庫［13］。“DiffExp”模塊研究CCL23 mRNA在腫瘤和鄰近正常組織的差異表達(dá)，以箱線圖顯示。Oncomine數(shù)據(jù)庫（https://soft‐ware.oncomine.com/resource/login.html）是一個免費(fèi)且包含大量癌癥微陣列的數(shù)據(jù)庫［14］。篩選條件為：P<0.01，Change=2。UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）是一個基于TCGA開發(fā)的在線分析網(wǎng)站［15］，輸入“CCL23”，選擇“BRCA”板塊，選擇相應(yīng)乳腺癌亞分類構(gòu)建箱線圖。

1.2 2個在線工具分析CCL23轉(zhuǎn)錄水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系TCGA和GEO是目前公認(rèn)的腫瘤資源庫。選擇基于TCGA開發(fā)的GEPIA2.0數(shù)據(jù)庫生存模塊，選擇條件為P<0.05，“Group Cutoff：Median”。采用“Survival Map”模塊將CCL23前50個共表達(dá)基因進(jìn)行生存分析，以熱圖形式展現(xiàn)。PrognoScan是一個基于GEO資源開發(fā)的經(jīng)典在線網(wǎng)站［16］。閾值設(shè)定為：CoxP-value<0.05。

1.3 2個在線工具探討CCL23涉及的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和生物通路LinkedOmics數(shù)據(jù)庫（http://linkedo‐mics.org/）采用TCGA-BRCA數(shù)據(jù)Pearson檢驗(yàn)分析CCL23共表達(dá)基因，以熱圖顯示。利用Linkinter‐preter模塊進(jìn)行KEGG富集分析，設(shè)置條件為FDR<0.05，1 000次計(jì)算［17］。GeneMANIA（http://genema‐nia.org/）數(shù)據(jù)庫是一個可視化分析、包括智人在內(nèi)9種生物目標(biāo)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的工具［18］。輸入“CCL23”和選擇“homo sapiens”獲取與CCL23可能存在相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)，數(shù)據(jù)來源主要為GEO、BioGRID、IRefIndex、I2D［18］。

1.4 TIMER數(shù)據(jù)庫了解CCL23轉(zhuǎn)錄水平與免疫微環(huán)境的關(guān)系 采用Gene模塊查詢CCL23 mRNA與6種免疫細(xì)胞數(shù)量和腫瘤純度的關(guān)系。另外通過相關(guān)性模塊了解CCL23 mRNA與多種免疫細(xì)胞活化標(biāo)志物的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析檢測腫瘤組織與正常組織表達(dá)差異；Kaplan-Meier生存分析判斷CCL23 mRNA表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，高、低表達(dá)組以中位數(shù)區(qū)分，采用log-rank檢驗(yàn)分析高、低CCL23表達(dá)組的生存差異，得到P值；Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析CCL23的共表達(dá)基因。采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)通過調(diào)節(jié)腫瘤純度分析CCL23與免疫細(xì)胞標(biāo)志基因的相關(guān)性。其余分析采用相關(guān)網(wǎng)站提供的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方式。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCL23 mRNA在人類乳腺癌組織中呈低表達(dá) 基于Oncomine、GEPIA2.0和TIMER數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，相較于乳腺正常組織，乳腺癌組織CCL23 mRNA水平顯著下調(diào)。Oncomine數(shù)據(jù)庫設(shè)定條件為P<0.000 1，倍數(shù)變化為2，分析顯示CCL23 mRNA在乳腺癌組織中呈低表達(dá)（圖1）。采用UALCAN數(shù)據(jù)庫對TCGA-BRCA樣品多種臨床病理特征進(jìn)行亞組分析（根據(jù)性別、淋巴轉(zhuǎn)移狀態(tài)和腫瘤等級），乳腺癌患者CCL23表達(dá)明顯低于正常對照組（圖2）。提示CCL23可能是乳腺癌的潛在診斷指標(biāo)。

圖1 CCL23 mRNA在人類乳腺癌組織中呈低表達(dá)Fig.1 CCL23 mRNA expression is decreased in human breast cancer tissues

圖2 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析正常乳腺組織與乳腺癌組織（不同性別、淋巴轉(zhuǎn)移狀態(tài)和腫瘤分期）CCL23表達(dá)差異Fig.2 Differences of CCL23 expression between normal breast tissue and cancer tissues（different gender，lymphatic metastasis status and tumor stage）in UALCAN database

2.2 CCL23 mRNA是乳腺癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物 通過在線分析工具GEPIA2.0對TCGA樣本進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明：高表達(dá)CCL23 mRNA的乳腺癌患者預(yù)后更好［OS（HR=0.63，P=0.004 8），DFS（HR=0.63，P=0.017 0），圖3］。為克服單一數(shù)據(jù)庫導(dǎo)致的不確定性，采用PrognoScan數(shù)據(jù)庫分析GEO數(shù)據(jù)集GSE6532-GPL570和GSE2034，結(jié)果表明，與GEPIA2.0分析結(jié)果趨勢類似（表1）。表明CCL23具有作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物的潛力。

表1 GEO數(shù)據(jù)集中CCL23與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性Tab.1 Correlation between CCL23 and breast cancer prognosis in GEO dataset

圖3 GEPIA2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)后模塊分析CCL23表達(dá)與乳腺癌OS和DFS的關(guān)系Fig.3 Relationship between expression of CCL23 and OS and DFS of breast cancer analyzed by prognosis module of GEPIA2.0 database

2.3 CCL23涉及的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和KEGG通路LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析得到CCL23在乳腺癌中的共表達(dá)基因，并對前50個相關(guān)性最為顯著的基因生成熱圖。利用Linkinterpreter模塊進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示：CCL23及其共表達(dá)基因主要參與免疫相關(guān)生物學(xué)行為；采用GEPIA2.0對前50個正相關(guān)和負(fù)相關(guān)基因生成生存熱圖，提示正相關(guān)基因中13/50個基因與患者OS相關(guān)（P<0.05），負(fù)相關(guān)基因中5/50個基因與患者OS相關(guān)（P<0.05）。Genemania數(shù)據(jù)庫可視化分析發(fā)現(xiàn)，CCL23具有復(fù)雜的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，其中CCL21和CCR1蛋白聯(lián)系最為密切（圖4）。

圖4 CCL23涉及的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和KEGG通路Fig.4 Protein interaction network and KEGG pathway involved in CCL23

2.4 CCL23 mRNA與乳腺癌組織免疫微環(huán)境的關(guān)系 選擇Gene模塊的BRCA隊(duì)列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，提示CCL23與腫瘤純度呈顯著負(fù)相關(guān)，與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)（圖5）。采用相關(guān)性模塊通過調(diào)節(jié)腫瘤純度發(fā)現(xiàn)，CCL23與多個活化CD4+T和CD8+T細(xì)胞標(biāo)志物呈顯著正相關(guān)（表2）。

表2 乳腺癌組織中CCL23與CD8+T和CD4+T細(xì)胞活化標(biāo)志物的相關(guān)性Tab.2 Correlation between CCL23 and CD8+T，CD4+T cell activation markers in breast cancer tissue

3 討論

采用生物信息學(xué)技術(shù)對大量測序和芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析不僅有利于了解疾病發(fā)生的分子機(jī)制，而且能夠確定腫瘤關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，為臨床治療提供新方向。免疫治療作為腫瘤治療的新方向，與傳統(tǒng)治療方式相比，具有特異性強(qiáng)和副作用小的優(yōu)勢［19］。目前PD-1和CTLA4抑制劑已在臨床腫瘤治療方面取得了顯著療效［20］。因此，探索活化腫瘤免疫細(xì)胞功能的相關(guān)分子有利于促進(jìn)抗瘤免疫治療發(fā)展。

本研究通過GEPIA2.0、Oncomine和TIMER數(shù)據(jù)庫均發(fā)現(xiàn)相較于乳腺正常組織，腫瘤組織CCL23呈顯著低表達(dá)。UALCAN數(shù)據(jù)庫分析表明，女性患者CCL23 mRNA表達(dá)高于男性。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗的主要原因。與正常組織相比，轉(zhuǎn)移型與高分期的乳腺癌患者CCL23 mRNA表達(dá)更低。CCL23具有作為早期乳腺癌關(guān)鍵分子標(biāo)志物的潛能。GEPIA2.0發(fā)現(xiàn)低表達(dá)CCL23的乳腺癌患者往往OS和DFS較短。PrognoScan分析發(fā)現(xiàn)，GEO多個數(shù)據(jù)集中也具有相似趨勢。表明CCL23有較大潛力成為乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物。

免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，越來越多的研究表明，趨化因子家族通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫行為參與腫瘤進(jìn)展，且在惡性腫瘤免疫治療中具有重要意義［21-22］。CCL20已被證明作用于NF-κB信號通路參與調(diào)節(jié)三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231紫杉醇敏感性［23］。CCL11/CCR3軸可促進(jìn)乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［24］。但CCL23如何參與乳腺癌的具體機(jī)制尚未明確。LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析CCL23在乳腺癌中共表達(dá)的基因發(fā)現(xiàn)，CCL23多個共表達(dá)基因與預(yù)后相關(guān)。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，CCL23及其共表達(dá)基因主要參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。在GeneMANIA數(shù)據(jù)庫中選擇智人模塊，分析提示CCL23蛋白主要作用于CCL21和CCR1蛋白。免疫細(xì)胞向腫瘤部位募集是由趨化因子及其特定配體介導(dǎo)的，與癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)，CCL23/CCR1軸已被證明參與上皮性卵巢癌進(jìn)展和化療敏感性調(diào)控［25］。本研究還發(fā)現(xiàn)CCL21是CCL23相關(guān)性較強(qiáng)的趨化因子。CCL21可能是調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展的雙向調(diào)節(jié)因子。一方面有研究發(fā)現(xiàn)CCL21/CCR7軸參與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［26］；另一方面有研究發(fā)現(xiàn)CCL21可活化T細(xì)胞功能，并在小鼠模型中得以驗(yàn)證，且CCL21聯(lián)合PD-1抑制劑可增強(qiáng)抗腫瘤免疫療效［27］。但尚未有報道表明CCL2和CCL21與腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞可作為評估癌癥患者預(yù)后和免疫治療效果的獨(dú)立指標(biāo)［28］。本研究結(jié)果提示CCL23與乳腺腫瘤微環(huán)境的免疫細(xì)胞成分密切相關(guān)。TIMER數(shù)據(jù)庫分析表明，CCL23與腫瘤純度呈顯著負(fù)相關(guān)，與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。CCL23與CD4+T細(xì)胞、CD8+T、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞相關(guān)性較強(qiáng)。CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在特異性殺傷腫瘤細(xì)胞有著不可或缺的作用［29］；樹突狀細(xì)胞是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，能夠有效激活T細(xì)胞，是機(jī)體免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)［30］。研究表明，N1型中性粒細(xì)胞的抗腫瘤作用主要通過分泌Ⅰ型干擾素活化自然殺傷細(xì)胞IL-18表達(dá)［31］。通過調(diào)節(jié)腫瘤純度探討CCL23與免疫細(xì)胞活化相關(guān)標(biāo)志物的聯(lián)系，結(jié)果顯示：CCL23與多個活化CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞標(biāo)志物呈顯著正相關(guān)。有報道稱CCL23通過結(jié)合CCR1可活化T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞功能，增強(qiáng)抗腫瘤免疫力，為本研究提供了科學(xué)依據(jù)［32］。

綜上，本研究結(jié)果提示CCL23可能通過結(jié)合CCR1活化包括T淋巴細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞，增強(qiáng)抗腫瘤免疫力，使乳腺癌患者預(yù)后良好。但以上研究僅是基于TCGA等公共數(shù)據(jù)資源分析的初步理論結(jié)果，尚需一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和乳腺癌病理標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。另外，課題組缺乏CCL23調(diào)節(jié)乳腺癌免疫微環(huán)境的直接證據(jù)，仍需免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果初步闡明了CCL23作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物的潛在價值，并提供了一種機(jī)制。CCL23將是腫瘤免疫療法的新方向。